Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã phát triển kỹ thuật MLPA để xác định đột biến gen gây bệnh α-thalassemia với nhiều ưu điểm. Xuất phát từ những thực tiễn nêu trên, nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu: “Xác định các đột biến gen α globin ở bệnh nhân α-thalassemia bằng kỹ thuật MLPA”
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 509 - THÁNG 12 - SỐ - 2021 Effect and Relationship ofSeasons on the High Risk of Ovarian Hyperstimulation Syndrome After Oocyte Retrieval in Patients With Polycystic Ovary Syndrome Front Endocrinol 11:610828 Sun B, Ma Y, Li L, et al (2021) Factors Associated with Ovarian Hyperstimulation Syndrome (OHSS) Severity in Women With Polycystic Ovary Syndrome Undergoing IVF/ICSI Front Endocrinol 11:615957 Klaus Fiedler, Diego Ezcurra (2016) Prevention and treatment of moderate and severe ovarian hyperstimulation syndrome: a guideline Fertil Steril, 2016;106:1634–1647 Golan A, et al (2010), A modern classification of OHSS, Reproductive BioMedicine, Vol 19, No 1, pp: 28-32 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN α THALASSEMIA Ở BỆNH NHÂN HBH Lê Thanh Hằng*, Lê Thị Phương*, Trần Huy Thịnh*, Trần Vân Khánh* TÓM TẮT 56 Bệnh α-thalassemia thường gây nên đột biến xóa đoạn gen HBA1 HBA2 làm thiếu hụt chuỗi α-globin cấu thành nên phân tử Hemoglobin Tùy theo số lượng chuỗi α bị thiếu hụt mà mức độ biểu lâm sàng bệnh cấp độ khác Xác định đột biến gen bệnh nhân giúp chẩn đoán xác định tư vấn di truyền cho thành viên gia đình bệnh nhân Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) áp dụng để xác định đột biến 21 bệnh nhân mắc bệnh α-thalassemia dựa vào số huyết học, điện di huyết sắc tố dấu hiệu lâm sàng Nghiên cứu xác định 14/21 bệnh nhân mang kiểu gen SEA/-ꭤ3.7, 7/21 bệnh nhân mang kiểu gen -SEA/-ꭤ4.2 MLPA kỹ thuật hiệu để phát đột biến đoạn bệnh α thalassemia Việt Nam Từ khóa: bệnh α- thalassemia, HbH, MLPA, -SEA/-ꭤ3.7, SEA/-ꭤ4.2 SUMMARY APPLYING MULTIPLEX LIGATIONDEPENDENT PROBE AMPLIFICATION TECHNIQUE TO DETECT MUTATION IN ALPHA THALASSEMIA PATIENTS Alpha-thalassemia disease is mostly caused by mutations in the HBA1 and HBA2 genes that lead to the deficiency in the α-globin chain, which builds up the hemoglobin molecule Depending on the number of missing α chains, the clinical manifestations of the disease are at different levels Detecting mutations in patients will help diagnose and genetic counseling for the patient's family Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) technique was applied to *Trường Đại học Y Hà Nội Chịu trách nhiệm chính: Trần Vân Khánh Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận bài: 10.9.2021 Ngày phản biện khoa học: 2.11.2021 Ngày duyệt bài: 12.11.2021 detect mutation of HBA1, HBA2 gene in DNA samples of 21 people suspected of having α-thalassemia, based on test results of red blood cells and hemoglobin, the study identified 14/21 people carry the genotype -SEA/-ꭤ3.7 , 7/21 people carry the genotype SEA/-ꭤ4.2 MLPA is effective method to detect the deletion and duplication mutation in Vietnam α-thalassemia patients Keywords: α- thalassemia disease, HbH, MLPA, -SEA/-ꭤ3.7, SEA/-ꭤ4.2 I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh α-thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, đặc trưng suy giảm thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin phân tử Hemoglobin Bệnh thuộc nhóm bệnh di truyền phổ biến nhất, nguyên nhân gây thiếu máu tan máu hàng đầu trẻ em.1 Bệnh α-thalassemia xuất tất chủng tộc giới, phổ biến nước Đơng Nam Á Hiện có khoảng 5% dân số giới người mang gen bệnh α-thalassemia, bao gồm dạng α+ -thalassemia, α0 -thalassemia, phân bố khác khu vực, quốc gia, chủng tộc khác Tại Trung Quốc, người mang gen αthalassemia chiếm 5-15% dân số, Thailand 1530%, Lào 43%, Việt Nam có 45% dân số mang gen bệnh Ở người bình thường, NST số 16 có hai gen α globin, có tổng cộng bốn gen α globin hai NST 16 tương đồng (αα/αα).3,4 Tùy theo số lượng gen α bị đột biến, tùy theo kết hợp đa dạng dạng alen đột biến khác bệnh α-thalassemia, gây biểu lâm sàng nhiều mức độ khác α thalassemia phân loại dựa số lượng alen bị đột biến; đột biến xuất aleen gọi α+ thalassemia (hay gọi thalassemia thể ẩn); đột biến xuất alen ta α0 thalassemia Bệnh α thalassemia 221 vietnam medical journal n01 - DECEMBER - 2021 hay bệnh HbH xuất có alen bị đột biến Vì số lượng alen bị đột biến lớn nên có thiếu hụt nghiêm trọng chuỗi α-globin tạo nên huyết sắc tố bất thường Hb Bart’s ( ), hay HbH ( )2,5 Những huyết sắc tố không bền không đảm bảo chức vận chuyển oxy máu Chính vậy, lâm sàng bệnh nhân xuất triệu chứng thiếu máu từ mức độ trung bình đến nặng, gan to, lách to, biến dạng xương Nhằm hạn chế hậu nặng nề mà bệnh gây ra, y học đại đặt mục tiêu phát sớm điều trị sớm cho bệnh nhân từ giai đoạn triệu chứng Từ năm 2008 đến 2010, kỹ thuật phân tích kiểu đột biến gen bệnh α-thalassemia bắt đầu tiến hành Việt Nam Tuy nhiên, kỹ thuật PCR, ARMS-PCR, lai điểm ngược, giải trình tự gen để xác định đột biến có nhược điểm5 Trong năm gần đây, nhà khoa học giới phát triển kỹ thuật MLPA để xác định đột biến gen gây bệnh α-thalassemia với nhiều ưu điểm Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: “Xác định đột biến gen α globin bệnh nhân α-thalassemia kỹ thuật MLPA” - Nghiên cứu sử dụng kit SALSA MLPA hãng MRC Holland (Hà Lan) với đầu dò P140 dành cho chẩn đoán α-thalassemia - Tiến hành: 5ul DNA có nồng độ tối ưu khoảng 50-250ng, khử RNA, sử dụng làm khuôn cho phản ứng MLPA gồm bước biến tính, lai hóa đầu dò, PCR bước cuối điện di mao quản Các bước thí nghiệm chu trình nhiệt phản ứng thực tuân theo quy trình chung nhà sản xuất - Kết MLPA phân tích phần mềm COFFALYSER.Net để tính giá trị DQ (Dosage Quotient-thương số tín hiệu đỉnh mẫu nghiên cứu so với mẫu đối chứng) Những đỉnh có giá trị DQ khoảng 0,8-1,2 bình thường; DQ=0 tương đương với đột biến đoạn đồng hợp tử; DQ khoảng 0,4-0,65 xác định xoá đoạn dị hợp tử; DQ từ 1,31,65 có đột biến lặp đoạn.6 2.3 Vấn đề y đức Nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt đạo đức nghiên cứu y sinh Bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu cách tự nguyện Họ thông báo kết xét nghiệm gen bảo mật thơng tin cá nhân Bệnh nhân rút khỏi nghiên cứu lúc họ yêu cầu II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 bệnh nhân chọn dựa xét nghiệm công thức máu bất thường: MCH