Nội dung bài viết có mục tiêu trình bày về Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT‐PCR khảo sát các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL trên bệnh nhân bạch cầu mạn dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT‐PCR KHẢO SÁT CÁC KIỂU BẢN SAO BCR/ABL TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC Nguyễn Thị Kim Định *, Phan Thị Xinh** TĨM TẮT Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT‐PCR khảo sát các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL trên bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) và bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL). Đối tượng và phương pháp: Từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013, 100 BN gồm 94 BN BCMDT và 6 BCCDL được khảo sát biểu hiện của tổ hợp gen BCR/ABL tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM bằng 2 kỹ thuật RT‐PCR đơn và multiplex RT‐PCR. Kết quả: Kết quả thử điều kiện của phản ứng multiplex RT‐PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 60 C‐65oC cho thấy nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu là 62oC. Khảo sát 100 mẫu từ BN BCMDT và BCCDL bằng 2 kỹ thuật RT‐PCR đơn và multiplex RT‐PCR cho kết quả hồn tồn tương đồng với 6 BN BCCDL chỉ biểu hiện e1a2 và 86 BN BCMDT dương tính các kiểu bản sao là b3a2, b2a2 lần lượt là 58,1%, 34,9%. Đồng biểu hiện của 2 kiểu bản sao biểu hiện với tỉ lệ thấp hơn. o Kết luận: Xây dựng thành cơng kỹ thuật multiplex RT‐PCR để phát hiện các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL lúc chẩn đốn giúp tiết kiệm được thời gian, cơng sức và hóa chất. Nghiên cứu này là tiền đề cho việc xây dựng kỹ thuật multiplex PCR khảo sát các bất thường về gen thường gặp trong các bệnh lý huyết học ác tính khác Từ khóa: Bạch cầu mãn dòng tủy (BCMDT), Bạch cầu cấp dòng Lympho (BCCDL), BCR/ABL, multiplex RT‐PCR. ABSTRACT DETECTION OF BCR/ABL TRANSCRIPTS USING MULTIPLEX RT‐PCR AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL Nguyen Thi Kim Dinh , Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 190 ‐ 194 Objectives: Using multiplex RT‐PCR to detect the types of BCR/ABL transcripts in chronic myeloid leukemia (CML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL). Material and Methods: From October 2012 to June 2013, expression of BCR/ABL fusion transcripts from 100 patients, including 94 with CML and 6 with ALL, are detected by single RT‐ PCR and multiplex RT‐PCR. Results: By adjusting primer annealing temperature in a range from 60oC to 65oC, the optimal temperature was determined at 62oC. The results for detecting BCR/ABL transcripts in 100 patients using single RT‐PCR and multiplex RT‐PCR are the same, in which 6 ALL patients are positive for e1a2 transcript; 86 CML patients are positive for b2a2 and b3a2 transcripts, corresponding to 58.1% and 34.9%, respectively. Patients simultaneously expressing two types of BCR/ABL transcripts are at lower incidence. Conclusion: Successful development of multiplex RT‐PCR procedure for detecting types of BCR/ABL transcripts at the time of diagnosis helps to save time, workforce and chemical. This study is the first step to apply multiplex RT‐PCR for detecting genetic anomalies in other hematopoietic malignancies. Key words: chronic myeloid leukemia (CML), acute lymphoblastic leukemia (ALL), BCR/ABL, multiplex RT‐PCR. * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932.728.115 Email: phanthixinh@yahoo.com 190 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Chuyển vị tương hỗ giữa nhiễm sắc thể (NST) 9 và 22 tạo ra tổ hợp gen BCR/ABL được tìm thấy trong hơn 90‐95% bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT), khoảng 30% BN bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) ở người lớn và 3‐5% BCCDL ở trẻ em. Trong BCMDT, tùy điểm gãy trên gen BCR sẽ tạo ra nhiều kiểu tổ hợp gen BCR/ABL trong đó thường gặp là major BCR/ABL (b3a2, b2a2) kế tiếp là minor BCR/ABL (e1a2) và một số kiểu bản sao hiếm gặp khác như b2a3, b3a3, e1a3, e19a2, e6a2(2,8). Việc sử dụng phản ứng khuếch đại chuỗi (polymerase chain reaction: PCR) đơn để khảo sát các kiểu bản sao thường gặp như b2a2, b3a2 và e1a2 là một kỹ thuật đơn giản, độ nhạy cao(6,7). Ngồi ra, nếu cần độ nhạy cao hơn có thể thực hiện thêm nested PCR nhưng PCR đơn có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, cơng sức và hóa chất vì phải thực hiện trên từng phản ứng PCR riêng biệt và không phát hiện được các kiểu bản sao hiếm gặp. Multiplex PCR là phản ứng PCR mà cùng lúc có thể khuếch đại được nhiều gen hoặc nhiều kiểu bản sao của 1 gen với nhiều cặp mồi hoặc 1 cặp mồi trong cùng 1 phản ứng. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để khảo sát các kiểu bản sao của gen BCR/ABL trong BCMDT và BCCDL lúc chẩn đoán(1,2,3,4,5). Với kỹ thuật này hầu hết các kiểu bản sao của gen BCR/ABL, kể cả các kiểu bản sao hiếm gặp cũng có thể được phát hiện chỉ trong 1 phản ứng PCR, giúp tiết kiệm thời gian, cơng sức, hóa chất và hạn chế sự lây nhiễm do nhiều lần thực hiện thao tác thực nghiệm. Tại bệnh viện Truyền máu Huyết Học (BVTMHH) TP.HCM, từ năm 2005 kỹ thuật RT‐ PCR đơn đã được thiết lập để khảo sát các kiểu bản sao thường gặp là b2a2, b3a2 và e1a2 kết hợp với nested PCR để chẩn đoán và theo dõi điều trị BCMDT và BCCDL(6,7). Trong nghiên cứu này, chúng tơi chuẩn hóa thành cơng điều kiện của multiplex PCR và tiến hành khảo sát các kiểu bản sao BCR/ABL bằng multiplex RT‐ Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học PCR trên 100 BN BCMDT và BCCDL lúc chẩn đoán. Kết quả được so sánh với kết quả PCR đơn trên cùng 100 BN. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu tủy hoặc mẫu máu của 94 BN BCMDT và 6 BN BCCDL mới được chẩn đoán dựa vào huyết đồ, tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tại BVTMHH TP.HCM từ tháng 10/2012 đến tháng 6/2013. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mơ tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới. Phương pháp tiến hành Ly trích RNA và tổng hợp cDNA: Mẫu máu ngoại vi hoặc tủy xương lấy trong chống đơng EDTA được ly trích RNA bằng bộ kít Invitrap Spin Universal RNA Mini kit (Stratec, Đức) theo quy trình kỹ thuật do nhà sản xuất cung cấp. Sau đó, 1 μg RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA với SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, Mỹ) trong tổng thể tích phản ứng là 20 μL, theo chương trình ln nhiệt ở 25oC trong 10 phút, kế tiếp là 42oC trong 50 phút và hủy men còn lại trong phản ứng ở 72oC trong 15 phút. Sau khi pha lỗng với nước tinh khiết, thể tích cDNA là 60 μL. Phản ứng multiplex RT‐PCR: phản ứng multiplex RT‐PCR gồm có 2μL cDNA, 0,4 μL (10μM) mồi xuôi Mul‐BCR‐F1, 0,2 μL (10 μM) mồi xuôi Mul‐BCR‐F2, 0,4 μL (10 μM) mồi ngược Mul‐ABL‐R, và 0,15 μL Takara Taq HS (Takara, Nhật) trong 20 μL thể tích phản ứng. Tiến hành thử điều kiện của phản ứng PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 60oC‐65oC. Chương trình ln nhiệt gồm biến tính ở 98oC trong 3 phút; 45 chu kỳ với 98oC trong 10 giây, 60oC‐65oC trong 30 giây, 72oC trong 45 giây; hồn thành phản ứng với 72oC trong 5 phút. Sau đó, sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên thạch 1,2% chứa 0,5 μg/mL ethidium bromide trong 0,5 x TBE, quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ (Biorad, Mỹ). Kết quả dương tính nếu như 191 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 biểu hiện kích thước băng tương ứng với các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL (Bảng 1). được điện di trên thạch 2%. Kích thước băng tương ứng với các kiểu bản sao theo Bảng 2. Bảng 1: Các mồi dùng cho phản ứng multiplex RT‐ PCR và các sản phẩm PCR tương ứng. Bảng 2: Các cặp mồi dùng cho phản ứng RT‐ PCR đơn và các sản phẩm PCR tương ứng Các kiểu kích thước sản phẩm PCR b3a2 627 bp Qmulti-BCRF1 b2a2 552 bp b2a3 378 bp Qmulti-ABL-R b1a1 580 bp Qmulti-BCRe1a2 429 bp F2 c3a2 1167bp e1a3 255bp Mồi xuôi Mồi ngược RT‐PCR đơn: Phản ứng RT‐PCR gồm có 1μL cDNA, mỗi mồi 0,75 μL (10 μM) và 0,1 μL GoTaq (Promega, Mỹ) trong 15 μL thể tích phản ứng. Chương trình ln nhiệt trên máy iCycler (Biorad, Mỹ) với nhiệt độ bắt cặp là 60oC đối với major BCR/ABL và 65oC đối với minor BCR/ABL trong 45 chu kỳ. Sau đó, sản phẩm của phản ứng PCR Neg A Tên Major BCR/ABL Minor BCR/ABL Kích thước sản phẩm PCR Mồi 7700-F 7700-R m-BA-2nd-F m-BA-2nd-F b2a2: 212 bp b3a2: 278 bp e1a2: 198 bp KẾT QUẢ Kết quả thử điều kiện của phản ứng multiplex RT‐PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 60oC‐65oC cho thấy ở nhiệt độ 60oC thì xuất hiện nhiều băng khơng đặc hiệu (Hình 1A), ở 64oC ‐ 65oC thì băng đặc hiệu của mẫu 1 và 5 khơng khuếch đại được (Hình 1C), ở 62oC thì các băng đặc hiệu xuất hiện đầy đủ và khơng có băng phụ (Hình 1B). Neg B Neg C Hình 1: Kết multiplex RT-PCR nhiệt độ bắt cặp 60oC (A), 62oC (B) 65oC (C) 1: BN có b2a2 và e1a2; 2: BN có b3a2; 3: BN có b3a2 và b2a2; 4: BN có b3a2 và e1a2; 5: BN có e1a2; M: thang chuẩn; N: chứng âm quả của kỹ thuật RT‐PCR đơn (Hình 2A và 2B) Bước đầu khảo sát biểu hiện của 11 BN và multiplex RT‐PCR (Hình 2C). (BN6 – BN16) cho thấy sự tương đồng giữa kết 192 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học BN B P N M M A B N M P N C B Hình 2: Kết quả của 11 BN khảo sát major BCR/ABL bằng RT‐PCR đơn (A), minor BCR/ABL bằng RT‐PCR đơn (B) và multiplex RT‐PCR (C) Kiểu bản sao BCR/ABL của BN6: b3a2; BN7: b2a2; BN8: e1a2; BN9: b3a2 và e1a2; BN10: b2a2 và e1a2; BN11: b3a2 và e1a2; BN12 và BN13 và BN14: b3a2 và b2a2; BN15: e1a2; BN16: âm tính; M: thang chuẩn; P: chứng dương; N: chứng âm. của phản ứng sẽ khó khăn hơn. Trong nghiên Kết quả khảo sát 6 BN BCCDL và 94 BN cứu này, chúng tôi thay đổi điều kiện nhiệt độ BCMDT bằng 2 kỹ thuật multiplex RT‐PCR và bắt cặp mồi trong khoảng từ 60oC‐65oC và kết RT‐PCR đơn cho kết quả tương đồng (Bảng 3). quả cho thấy nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu là 62oC Trong 94 BN BCMDT, có 8 BN khơng biểu hiện (Hình 1). tổ hợp gen BCR/ABL và 86 BN biểu hiện các kiểu bản sao thường gặp là b3a2, b2a2 và e1a2. Kiểu bản sao b3a2 là thường gặp nhất, chiếm tỉ lệ 58,1%, kế tiếp là b2a3 chiếm 34,9%, đồng biểu hiện b3a2 và b2a2 hoặc e1a2 chiếm tỉ lệ lần lượt là 3,5% và 2,3%. Ngồi ra, có 1 BN đồng biểu hiện b2a2 và e1a2 chiếm tỉ lệ 1,2% (Bảng 3). Bảng 3: Các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL Thể bệnh BCCDL BCMDT Kiểu RT-PCR Multiplex RTBCR/ABL đơn (BN) PCR (BN) e1a2 6 b3a2 50 50 b2a2 30 30 b3a2 b2a2 3 b3a2 e1a2 2 b2a2 e1a2 1 Không biểu tổ 8 hợp gen BCR/ABL BÀN LUẬN Nhiệt độ bắt cặp đối với phản ứng RT‐PCR đơn khác nhau khi khảo sát các kiểu bản sao major và minor BCR/ABL nên phải thực hiện 2 phản ứng với 2 chương trình khuếch đại riêng biệt nên tốn thời gian, hóa chất và dụng cụ gấp đơi. Đối với multiplex RT‐PCR, trong cùng 1 phản ứng có thể phát hiện được cùng lúc hầu hết các kiểu bản sao BCR/ABL nên rất thuận lợi trong việc tầm soát gen trước điều trị. Tuy nhiên, việc thử điều kiện để chọn ra điều kiện tối ưu Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Kết quả khảo sát 100 BN cho thấy tỉ lệ các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL tương đồng giữa 2 kỹ thuật multiplex RT‐PCR và RT‐ PCR đơn, trong đó 6 BN BCCDL đều biểu hiện kiểu bản sao e1a2. Kết quả phân tích 86 trường hợp BCMDT cho thấy kiểu bản sao thường gặp nhất là b3a2 (58,1%), kế đến là b2a2 (34,9%) và sau đó là các trường hợp đồng biểu hiện của b3a2, b2a2 và e1a2, tương đồng với các nghiên cứu khác(1,2,3). RT‐PCR đơn, đặc biệt là nested RT‐PCR chỉ sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu trong phản ứng nên nhạy hơn multiplex RT‐PCR, phù hợp cho việc đánh giá biểu hiện gen sau điều trị hóa trị liệu. Trong nghiên cứu này, khơng có sự khác biệt về kết quả giữa 2 kỹ thuật trên 100 mẫu khảo sát cho thấy ưu điểm của multiplex RT‐PCR trong việc khảo sát các kiểu bản sao BCR/ABL lúc chẩn đốn(2,3) giúp tiết kiệm thời gian, cơng sức và hóa chất, làm giảm giá thành xét nghiệm. KẾT LUẬN Chúng tơi đã xây dựng thành cơng kỹ thuật multiplex RT‐PCR để có thể phát hiện các kiểu bản sao thường gặp b3a2, b2a và e1a2, ngồi ra còn có thể phát hiện các kiểu bản sao hiếm gặp khác của tổ hợp gen BCR/ABL. Trong tương lai, 193 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 cần ứng dụng kỹ thuật multiplex RT‐PCR để phát hiện các tổ hợp gen gây bệnh thường gặp trong BCCDL và bạch cầu cấp dòng tủy để tiết kiệm thời gian, chi phí và nhân lực. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bennour A, Ouahchi I, Moez M, et al (2012). Comprehensive analysis of BCR/ABL variants in chronic myeloid leukemia patients using multiplex RT‐PCR. Clin Lab. 58(5‐6):433‐9. Burmeister T, Reinhardt R (2008). A multiplex PCR for improved detection of typical and atypical BCR/ABL fusion transcripts. Leuk Res Apr; 32(4):579‐85. Goh HG, Hwang JY, Kim SH, et al (2006). Comprehensive analysis of BCR/ABL transcript types in Korean CML patients using a newly developed multiplex RT‐PCR. Transl Res Nov; 148(5):249‐56. Lee A, Kirk J, Edmands S, Radich J (1995). Multiplex PCR of bcr‐abl fusion transcripts in Philadelphia positive acute lymphoblastic leukemia. PCR Methods Appl. Apr; 4(5):283‐7. Pallisgaard N, Hokland P, Pedersen B, el al (1998). Multiplex reverse transcription‐polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood. Jul;92(2):574‐88. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2006). Triển khai kỹ thuật FISH và RT‐PCR nhằm phát hiện những bất thường nhiễm sắc thể và gene trong bệnh lý huyết học tại Bệnh viện Truyền máu ‐ Huyết học TP. Hồ Chí Minh. Tạp chí Y học Việt Nam; 545. Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh (2010). Khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho tại BV Truyền Máu ‐ Huyết Học TP. HCM. Tạp chí Y học Việt Nam; 373:180. Yaghmaie M, Ghaffari SH, Ghavamzadeh A, et al (2008). Frequency of BCR/ABL fusion transcripts in Iranian patients with chronic myeloid leukemia. Arch Iran Med; 11(3):247‐51. Ngày nhận bài báo: 15 tháng 8 năm 2013 Ngày phản biện: 29 tháng 8 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013 194 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học ... được điện di trên thạch 2%. Kích thước băng tương ứng với các kiểu bản sao theo Bảng 2. Bảng 1: Các mồi dùng cho phản ứng multiplex RT‐ PCR và các sản phẩm PCR tương ứng. Bảng 2: Các cặp mồi dùng cho phản ứng RT‐ PCR đơn và các sản phẩm PCR tương ứng ... lần thực hiện thao tác thực nghiệm. Tại bệnh viện Truyền máu Huyết Học (BVTMHH) TP.HCM, từ năm 2005 kỹ thuật RT‐ PCR đơn đã được thiết lập để khảo sát các kiểu bản sao thường gặp là b2a2, ... tối ưu Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Kết quả khảo sát 100 BN cho thấy tỉ lệ các kiểu bản sao của tổ hợp gen BCR/ABL tương đồng giữa 2 kỹ thuật multiplex RT‐PCR và RT‐ PCR đơn, trong đó 6 BN BCCDL đều biểu hiện