Nội dung bài viết nhằm nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng (RQ‐PCR) trong đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) có mang tổ hợp gen TEL‐AML1. Nghiên cứu trên 13 bệnh nhân được chẩn đoán BCCDL‐B có biểu hiện TEL‐AML1 bằng RT‐PCR và FISH được khảo sát TLTBAT lúc chẩn đoán và trong quá trình theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR sử dụng Taqman Probe.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH TỔ HỢP GEN TEL‐AML1 TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC Nguyễn Thị Minh n*, Phan Thị Xinh** TĨM TẮT Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng (RQ‐PCR) trong đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) có mang tổ hợp gen TEL‐AML1. Đối tượng và phương pháp: 13 BN được chẩn đốn BCCDL‐B có biểu hiện TEL‐AML1 bằng RT‐PCR và FISH được khảo sát TLTBAT lúc chẩn đốn và trong q trình theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR sử dụng Taqman Probe. Kết quả nghiên cứu: Trước điều trị, hầu hết các BN đều có biểu hiện TEL‐AML1 ở mức độ cao với kỹ thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH. Sau khi hồn tất giai đoạn tấn cơng, có 5 trong 13 BN (38,46%) thì vẫn còn biểu hiện TEL‐AML1 ở mức thấp từ 0,03% đến 0,28 % trong khi FISH và RT‐PCR đều âm tính. Đối với BN ALL‐10, kết quả khảo sát bằng kỹ thuật RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 trước điều trị là 75,82%, giảm còn 0,29% (gần 3 log) sau điều trị tấn cơng và khơng còn sự hiện diện của tổ hợp gen TEL‐ AML1 sau điều trị tăng cường. BN ALL‐13 với mức độ biểu hiện TEL‐AML1 là 31,18% so với ABL, sau điều trị xong giai đoạn tấn cơng, TLTBAT là 0,16% (giảm khoảng 2 log) và 0,10% sau đó 2 tháng. Tuy nhiên, tỷ lệ TLTBAT bắt đầu tăng lên ở các lần gửi mẫu tiếp theo lần lượt là 0,36% và 2,42% cho thấy xuất hiện lại dòng tế bào ác tính. Kết luận: Bước đầu sử dụng kỹ thuật RQ‐PCR đánh giá TLTBAT trong BCCDL‐B cho thấy có ý nghĩa trong đánh giá lui bệnh và dự đốn nguy cơ tái phát trong q trình điều trị cho BN có mang tổ hợp gen TEL‐ AML1. Từ khóa: TEL‐AML1, tồn lưu tế bào ác tính, PCR định lượng. ABSTRACT DEVELOPMENT OF REAL‐TIME QUANTITATIVE PCR TO MONITOR MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN TEL/AML1 POSITIVE PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL Nguyen Thi Minh Yen, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 184 ‐ 189 Object: Using Real Time Quatitative ‐ PCR (RQ‐PCR) to assess minimal residual disease (MRD) in patients with TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods: 13 B‐ALL patients detected TEL/AML1 positive by FISH and RT‐PCR methods before chemotherapy are monitored MRD by RQ‐PCR with Taqman Probe Results: Before chemotherapy, most of patients express TEL‐AML1 at high levels by RQ‐PCR, RT‐PCR and FISH. At the end of the induction therapy, 5 in13 cases (38.46%) are still detected MRD at the very low levels, from 0.03% to 0.28 %; while both FISH and RT‐PCR indicate the negative result. To patient ALL‐10, the result of RQ‐PCR shows the TEL‐AML1 high positive level at diagnosis time, standing at 75.82%, declining * Khoa Di Truyền Học Phân Tử ‐ Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh ** Bộ mơn Huyết Học ‐ Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh ĐT: 093.2728.115 Email: phanthixinh@yahoo.com 184 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học sharply to 0.29% (approximately 3 logs) after induction therapy and then vanishing after intensification therapy. Patient ALL‐13 shows positive TEL‐AML1/ABL level at 31.18%; after induction therapy, MRD occupies 0.16% (decrease over 2 logs) and declining to 0.10% after 2 months. However, there is a significant increasing in MRD levels of the next 2 times, 0.36% and 2.42%, respectively. Conclusions: The first step applying RQ‐PCR method to assess MRD in TEL‐AML1 positive ALL patients shows the important value of monitoring remission and predicts a relapse risk in treatment duration. Key words: TEL‐AML1, minimal residual disease, Real Time Quatitative PCR. hành khảo sát TLTBAT trên BN có biểu hiện ĐẶT VẤN ĐỀ TEL/AML1 ở các giai đoạn sau điều trị, đặc biệt Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) là sau giai đoạn tấn cơng. một yếu tố dự đốn nguy cơ tái phát rất quan ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN trọng ở bệnh nhân (BN) bệnh bạch cầu cấp dòng CỨU lympho (BCCDL)(1,6,9). Trong hầu hết các nghiên cứu, tỷ lệ TLTBAT lớn hơn 0,01% là tỷ lệ thuận Đối tượng với nguy cơ tái phát(2). Hiện nay, việc đánh giá BN được chẩn đoán BCCDL‐B dựa vào tủy TLTBAT trong BCCDL có thể sử dụng các kỹ đồ và dấu ấn bề mặt tế bào tại BVTMHH từ thuật như Flow Cytometry (FCM), PCR định tháng 06/2010 đến tháng 03/2013. Các BN này có lượng (RQ‐PCR) các tái sắp xếp gen kết quả RT‐PCR dương tính với tổ hợp gen TEL‐ imunoglobullin và T‐cell receptor và RQ‐PCR AML1 trước khi bắt đầu điều trị và có gửi mẫu các tổ hợp gen thường gặp(9,2,7). Trong đó, hai kỹ theo dõi sau điều trị. thuật đầu tiên có khả năng là theo dõi khoảng 80 Phương pháp nghiên cứu ‐ 95% các BN(8,9). Đối với những BN BCCDL‐B có biểu hiện tổ hợp gen như TEL/AML1, BCR/ABL, Thiết kế nghiên cứu E2A/PBX1 và MLL/AF4 thì RQ‐PCR khảo sát các Mơ tả loạt ca. tổ hợp gen trên được lựa chọn ưu tiên vì đặc Phương pháp tiến hành hiệu cho dòng tế bào ung thư(2,3,6,8) và có thể theo Xử lý mẫu và ly trích RNA dõi được khoảng 30 ‐35% trường hợp. Lấy 2 mL mẫu tủy trong chống đông Tổ hợp gen TEL/AML1 được tạo thành do EDTA, ly giải hồng cầu bằng dung dịch ly giải chuyển vị t(12;21)(p13;q22) gặp trong khoảng chứa 1M MgCl2, 5M NaCl và 1M Tris‐HCl. 20–25% BN BCCDL‐B và là yếu tố tiên lượng tốt Rửa tế bào bằng dung dịch đệm PBS và lấy 1 x (8). Theo báo cáo của một số nghiên cứu, sau đợt 107 tế bào trộn đều với 1 mL Trizol (Life điều trị tấn cơng, kết quả đánh giá TLTBAT cho Technologies, Mỹ). thấy có khoảng 40‐50% bệnh nhân vẫn còn biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1(2,5). TLTBAT được chứng minh là liên quan đến nguy cơ tái phát sau này. Trong những nghiên cứu về vấn đề này, các tác giả đã đưa ra kết quả chung rằng những BN không phát hiện TLTBAT vẫn chưa thấy bị tái phát, tuy nhiên, đối với những BN vẫn còn TLTBAT, một số trường hợp đã bị tái phát(4,8,11). Huyết học (BVTMHH) TP. HCM, sau khi đã thiết lập thành cơng điều kiện của kỹ thuật RQ‐ PCR cho tổ hợp gen TEL/AML1(12), chúng tơi tiến Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học RNA được ly trích từ mẫu tế bào lưu trữ với Trizol theo qui trình kỹ thuật do cơng ty cung cấp. Sau đó, đo nồng độ RNA bằng máy Ultrospec 5300 pro (GE Heathcare, Anh). Mẫu đạt chất lượng khi có tỉ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0. Lấy đúng 1g RNA để tổng hợp cDNA nhằm đảm bảo sự đồng nhất đầu vào của các mẫu cần định lượng. Lượng RNA còn lại được lưu trữ ở nhiệt độ ‐80oC. Tổng hợp cDNA 185 Nghiên cứu Y học Tổng hợp cDNA sử dụng bộ kít Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Thụy Sĩ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp RNA và men sao chép ngược trên được ủ bằng máy luân nhiệt iCycler (Biorad, Mỹ) theo chu trình luân nhiệt là 25oC trong 10 phút, 55oC trong 30 phút, và 85oC trong 5 phút. Mẫu cDNA được pha loãng để điều chỉnh về nồng độ 50 ng/3L và được lưu trữ ở ‐20oC đến khi sử dụng. Thực hiện RQ‐PCR Tiến hành chạy RQ‐PCR đồng thời mẫu bệnh nhân, mẫu chuẩn và chứng nội tại ở cùng điều kiện theo mô tả Thanh TTT và cộng sự(12) trên máy CFX 96 của (Biorad, Mỹ). Mẫu chuẩn trong nghiên cứu này được chuẩn bị theo mô tả của Thanh TTT và cộng sự(12) với Taqman Probe có đầu 5’ được đánh dấu bằng FAM, và đầu 3’ được đánh dấu bằng TAMRA và chứng nội tại được lựa chọn sử dụng là gen ABL. Chu trình ln nhiệt cho phản ứng RQ‐PCR như sau: 50oC trong 2 phút; 95oC trong 10 phút; 50 chu kỳ với 95oC trong 10 giây, 60oC trong 30 giây. Phân tích kết quả trực tiếp trên máy mà khơng cần qua bước điện di. Phân tích kết quả ‐ Kiểm tra các thơng số của đường khuếch đại và đường chuẩn để đánh giá tính chính xác, hiệu suất phản ứng, và độ tin cậy của phản ứng. ‐ Tính tỉ lệ phần trăm tổ hợp gen quan tâm so với chứng nội tại, thể hiện kết quả dưới dạng biểu đồ để dễ dàng đánh giá được mức độ tồn lưu tế bào ác tính. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH (Bảng 1), ngoại trừ ALL‐11 và ALL‐13. Bảng 1: Kết quả TEL‐AML1 với kỹ thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH lúc chẩn đốn. STT MÃ BN ALL-01 116,90 (+) 89,00 ALL-02 158,69 (+) 96,05 ALL-03 105,01 (+) 91,50 ALL-04 114,20 (+) 98,00 ALL-05 422,01 (+) 98,00 ALL-06 71,78 (+) 97,00 ALL-07 234,15 (+) 97,50 ALL-08 115,38 (+) 97,00 ALL-09 204,32 (+) 81,50 10 ALL-10 75,82 (+) 90,00 11 ALL-11 0,35 (+) 15,00 12 ALL-12 56,92 (+) 78,05 13 ALL-13 31,18 (+) 64,45 Đến lần gửi mẫu thứ hai sau khi hồn tất giai đoạn tấn cơng, những BN này không phát hiện thấy TLTBAT bằng kỹ thuật RT‐PCR và FISH. Tuy nhiên, 5 trong 13 BN (38,46%) vẫn còn biểu hiện TEL‐AML1 ở mức thấp từ 0,03% đến 0,28 % với kỹ thuật RQ‐PCR (Bảng 2). Bảng 2: Kết quả của BN còn biểu hiện TEL‐ AML1 sau hồn tất giai đoạn tấn cơng. 186 RQ-PCR RT-PCR FISH TELTEL-AML1 t(12;21) AML1/ABL (%) (%) (%) STT MÃ BN ALL-05 0,28 (-) 0,00 ALL-07 0,03 (-) 0,00 ALL-09 0,04 (-) 0,00 ALL-10 0,29 (-) Không làm ALL-13 0,16 (-) 0,00 KẾT QUẢ Trong thời gian thực hiện nghiên cứu, chúng tơi đã thu thập được 13 BN chẩn đốn BCCDL‐ B, thỏa mãn tiêu chuẩn chọn mẫu và được khảo sát biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 qua các giai đoạn điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR, trong đó có 12 BN (ALL‐01 đến ALL‐12) là mới chẩn đốn và 1 BN (ALL‐13) là tái phát tủy lần 2. Ở lần gửi mẫu đầu tiên trước điều trị, hầu hết các BN đều có biểu hiện TEL‐AML1 ở mức độ cao với kỹ RQ-PCR RT-PCR FISH TELTEL-AML1 t(12;21) AML1/ (%) (%) ABL (%) Trong 13 BN trên, có 2 BN đã tiếp tục gửi mẫu để khảo sát TEL/AML1 sau các đợt hóa trị liệu. Kết quả mức độ biểu hiện TEL‐AML1 qua Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 các giai đoạn điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR của từng BN được mơ tả như sau: BN Châu Ngọc K. L. là BN nữ, sinh năm 2004, mã ALL‐10. Kết quả RQ‐PCR của 3 lần gởi mẫu theo dõi điều trị của BN ALL‐10 được tóm tắt theo biểu đồ 1. Nghiên cứu Y học BN ALL‐13 được chẩn đoán là BCCDL tái phát và điều trị theo phác đồ COPRALL 2005. Theo biểu đồ 2, ở lần gửi mẫu đầu tiên trước điều trị (ALL‐13‐1), kết quả RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện TEL‐AML1 là 31,18% so với ABL. Sau hơn 3 tháng điều trị xong giai đoạn tấn công, kết quả RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện TEL‐AML1 giảm khoảng 2 log và vẫn còn 0,16%. Biểu đồ 1: Kết quả RQ‐PCR theo dõi điều trị của BN ALL‐10 Dựa vào biểu đồ 1, ở lần gửi mẫu đầu tiên (ALL‐10‐1) trước điều trị, kết quả khảo sát bằng kỹ thuật RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 là 75,82%. Ở lần gửi mẫu thứ hai (ALL‐10‐2) sau khi hồn tất giai đoạn tấn cơng thì tỉ lệ này giảm gần 3 log và vẫn còn 0,29%. Đến lần gửi mẫu thứ ba (ALL‐10‐3), khi hoàn tất tăng cường 1 bằng phát đồ FRALLE 2000 nhóm A1, kết quả RQ‐PCR cho thấy khơng còn sự hiện diện của tổ hợp gen TEL‐AML1. Kết quả RQ‐PCR so với kết quả RT‐PCR và FISH theo Bảng 3. Bảng 3: Kết quả RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH của ca ALL‐10 qua các lần gửi mẫu RQ-PCR TEL-AML1/ABL (%) ALL-10-1 75,82 ALL-10-2 0,29 ALL-10-3 0,00 Mã BN RT-PCR TEL-AML1 FISH t(12;21) (%) (+) (-) (-) 90,00 Không làm 0,00 BN Phan Chí U là BN nam, sinh năm 2000, mã ALL‐13, tình trạng bệnh là tái phát tủy lần 2. Kết quả RQ‐PCR các lần gởi mẫu theo dõi điều trị của BN ALL‐13 được tóm tắt theo biểu đồ 2. Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Biểu đồ 2: Kết quả RQ‐PCR theo dõi điều trị của BN ALL‐12 Sau đó 2 tháng, sau khi hồn tất BLOCK R1 R2, RQ‐PCR cho thấy TLTBAT chỉ còn 0,10% (Bảng 4). Đến lần gửi mẫu thứ 4 (ALL‐13‐4) và thứ 5 (ALL‐13‐5), tỷ lệ TLTBAT đã bắt đầu tăng lên lần lượt là 0,36% và 2,42%. RT‐PCR cho kết quả dương tính với cả 5 lần gửi mẫu (Bảng 4). Bảng 4: Kết quả RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH của ca ALL‐12 Mã BN ALL-13-1 ALL-13-2 ALL-13-3 ALL-13-4 ALL-13-5 RQ-PCR RT-PCR FISH TEL-AML1/ABL (%) TEL-AML1 t(12;21 (%) 31,18 (+) 64,5 0,16 (+) 0,00 0,1 (+) Không làm XN 0,36 (+) Không làm XN 2,42 (+) Không làm XN BÀN LUẬN Trong 13 BN khảo sát biểu hiện TEL‐ AML1/ABL bằng RQ‐PCR trước điều trị, có 2 BN ALL‐11 và ALL‐13 cho kết quả lần lượt là 0,35% và 31,18%, thấp hơn nhiều so với các BN khác (Bảng 1). Đối với trường hợp ALL‐11, kỹ thuật 187 Nghiên cứu Y học FISH cho kết quả dương tính t(12;21) ở mức thấp với 15%, ngồi ra còn có thêm 1 dòng tế bào khác chiếm 80% biểu hiện 4 tín hiệu nhiễm sắc thể 21. Trường hợp ALL‐13 đã được điều trị bằng phát đồ đặc hiệu và tái phát lần 1, sau đó được điều trị bằng phát đồ FRALLE 93 và tái phát tủy lần 2, nên TEL‐AML1 không biểu hiện ở mức cao. Những trường hợp mới được chẩn đoán, chưa trải qua quá trình điều trị thì tỉ lệ TEL‐AML1/ABL rất cao như ALL‐2, ALL‐5, ALL‐ 7, ALL‐9, với tỉ lệ >100% (Bảng 1), cao hơn so với tỉ lệ tế bào có t(12;21) khảo sát bằng kỹ thuật FISH, cho thấy dòng tế bào ung thư có t(12;21) biểu hiện bản sao TEL‐AML1 rất mạnh. Tổ hợp gen TEL‐AML1 xuất hiện ở trẻ em mắc bệnh BCCDL‐B cho tiên lượng tốt (5, 8). Sau khi hồn tất điều trị tấn cơng, kết quả kiểm tra bằng FISH và RT‐PCR là âm tính hay kết quả RQ‐PCR cho TLTBAT ở mức thấp hoặc khơng phát hiện đã thể hiện khả năng đáp ứng điều trị tốt của các BN BCCDL‐B dương tính tổ hợp gen TEL‐AML1. Tuy nhiên, 38,46% BN vẫn còn TLTBAT ở mức rất thấp ( 0,01% và 4 BN có TLTBAT