Bước đầu ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng đánh giá tồn lưu tế bào ác tính tổ hợp GEN TEL-AML1 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học

Nội dung bài viết nhằm nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng (RQ‐PCR) trong đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) có mang tổ hợp gen TEL‐AML1. Nghiên cứu trên 13 bệnh nhân được chẩn đoán BCCDL‐B có biểu hiện TEL‐AML1 bằng RT‐PCR và FISH được khảo sát TLTBAT lúc chẩn đoán và trong quá trình theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR sử dụng Taqman Probe.

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG   ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH TỔ HỢP GEN TEL‐AML1   TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC  Nguyễn Thị Minh n*, Phan Thị Xinh**  TĨM TẮT  Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng (RQ‐PCR) trong đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT)  trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) có mang tổ hợp gen TEL‐AML1.  Đối tượng và phương pháp: 13 BN được chẩn đốn BCCDL‐B có biểu hiện TEL‐AML1 bằng RT‐PCR và  FISH được khảo sát TLTBAT lúc chẩn đốn và trong q trình theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR sử dụng  Taqman Probe.  Kết  quả  nghiên  cứu:  Trước điều trị, hầu hết các BN đều có biểu hiện TEL‐AML1 ở mức độ cao với kỹ  thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH. Sau khi hồn tất giai đoạn tấn cơng, có 5 trong 13 BN (38,46%) thì vẫn còn  biểu hiện TEL‐AML1 ở mức thấp từ 0,03% đến 0,28 % trong khi FISH và RT‐PCR đều âm tính. Đối với BN  ALL‐10, kết quả khảo sát bằng kỹ thuật RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 trước điều  trị là 75,82%, giảm còn 0,29% (gần 3 log) sau điều trị tấn cơng và khơng còn sự hiện diện của tổ hợp gen TEL‐ AML1 sau điều trị tăng cường. BN ALL‐13 với mức độ biểu hiện TEL‐AML1 là 31,18% so với ABL, sau điều  trị xong giai đoạn tấn cơng, TLTBAT là 0,16% (giảm khoảng 2 log) và 0,10% sau đó 2 tháng. Tuy nhiên, tỷ lệ  TLTBAT bắt đầu tăng lên ở các lần gửi mẫu tiếp theo lần lượt là 0,36% và 2,42% cho thấy xuất hiện lại dòng tế  bào ác tính.  Kết  luận:  Bước đầu sử dụng  kỹ thuật RQ‐PCR đánh giá TLTBAT trong BCCDL‐B cho thấy có ý nghĩa  trong đánh giá lui bệnh và dự đốn nguy cơ tái phát trong q trình điều trị cho BN có mang tổ hợp gen TEL‐ AML1.  Từ khóa: TEL‐AML1, tồn lưu tế bào ác tính, PCR định lượng.  ABSTRACT  DEVELOPMENT OF REAL‐TIME QUANTITATIVE PCR   TO MONITOR MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN TEL/AML1 POSITIVE PATIENTS   AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL  Nguyen Thi Minh Yen, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 184 ‐ 189  Object:  Using  Real  Time  Quatitative  ‐  PCR  (RQ‐PCR)  to  assess  minimal  residual  disease  (MRD)  in  patients with TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia (ALL).   Methods:  13  B‐ALL  patients  detected  TEL/AML1  positive  by  FISH  and  RT‐PCR  methods  before  chemotherapy are monitored MRD by RQ‐PCR with Taqman Probe   Results:  Before chemotherapy, most of patients express TEL‐AML1 at high levels by RQ‐PCR, RT‐PCR  and FISH. At the end of the induction therapy, 5 in13 cases (38.46%) are still detected MRD at the very low  levels, from 0.03% to 0.28 %; while both FISH and RT‐PCR indicate the negative result. To patient ALL‐10, the  result of RQ‐PCR shows the TEL‐AML1 high positive level at diagnosis time, standing at 75.82%, declining  * Khoa Di Truyền Học Phân Tử ‐ Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh  ** Bộ mơn Huyết Học ‐ Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh   ĐT: 093.2728.115   Email: phanthixinh@yahoo.com  184 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học sharply to 0.29% (approximately 3 logs) after induction therapy and then vanishing after intensification therapy.  Patient ALL‐13 shows positive TEL‐AML1/ABL level at 31.18%; after induction therapy, MRD occupies 0.16%  (decrease over 2 logs) and declining to 0.10% after 2 months. However, there is a significant increasing in MRD  levels of the next 2 times, 0.36% and 2.42%, respectively.  Conclusions: The first step applying RQ‐PCR method to assess MRD in TEL‐AML1 positive ALL patients  shows the important value of monitoring remission and predicts a relapse risk in treatment duration.  Key words: TEL‐AML1, minimal residual disease, Real Time Quatitative PCR.   hành  khảo  sát  TLTBAT  trên  BN  có  biểu  hiện   ĐẶT VẤN ĐỀ  TEL/AML1 ở các giai đoạn sau điều trị, đặc biệt  Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT) là  sau giai đoạn tấn cơng.  một  yếu  tố  dự  đốn  nguy  cơ  tái  phát  rất  quan  ĐỐI    TƯỢNG  –  PHƯƠNG    PHÁP    NGHIÊN   trọng ở bệnh nhân (BN) bệnh bạch cầu cấp dòng  CỨU  lympho (BCCDL)(1,6,9). Trong hầu hết các nghiên  cứu, tỷ lệ TLTBAT lớn hơn 0,01% là tỷ lệ thuận  Đối tượng  với  nguy  cơ  tái  phát(2).  Hiện  nay,  việc  đánh  giá  BN được  chẩn  đoán  BCCDL‐B  dựa  vào  tủy  TLTBAT  trong  BCCDL  có  thể  sử  dụng  các  kỹ  đồ  và  dấu  ấn  bề  mặt  tế  bào  tại  BVTMHH  từ  thuật  như  Flow  Cytometry  (FCM),  PCR  định  tháng 06/2010 đến tháng 03/2013. Các BN này có  lượng  (RQ‐PCR)  các  tái  sắp  xếp  gen  kết quả RT‐PCR dương tính với tổ hợp gen TEL‐ imunoglobullin  và  T‐cell  receptor  và  RQ‐PCR  AML1 trước khi bắt đầu điều trị và có gửi mẫu  các tổ hợp gen thường gặp(9,2,7). Trong đó, hai kỹ  theo dõi sau điều trị.   thuật đầu tiên có khả năng là theo dõi khoảng 80  Phương pháp nghiên cứu  ‐ 95% các BN(8,9). Đối với những BN BCCDL‐B có  biểu hiện tổ hợp gen như TEL/AML1, BCR/ABL,  Thiết kế nghiên cứu  E2A/PBX1 và MLL/AF4 thì RQ‐PCR khảo sát các  Mơ tả loạt ca.  tổ  hợp  gen  trên  được  lựa  chọn  ưu  tiên  vì  đặc  Phương pháp tiến hành  hiệu cho dòng tế bào ung thư(2,3,6,8) và có thể theo  Xử lý mẫu và ly trích RNA  dõi được khoảng 30 ‐35% trường hợp.  Lấy  2  mL  mẫu  tủy  trong  chống  đông  Tổ  hợp  gen  TEL/AML1  được  tạo  thành  do  EDTA, ly giải hồng cầu bằng dung dịch ly giải  chuyển  vị  t(12;21)(p13;q22)  gặp  trong  khoảng  chứa  1M  MgCl2,  5M  NaCl  và  1M  Tris‐HCl.  20–25% BN BCCDL‐B và là yếu tố tiên lượng tốt  Rửa tế bào bằng dung dịch đệm PBS và lấy 1 x  (8). Theo báo cáo của một số nghiên cứu, sau đợt  107  tế  bào  trộn  đều  với  1  mL  Trizol  (Life  điều trị tấn cơng, kết quả đánh giá TLTBAT cho  Technologies, Mỹ).   thấy có khoảng 40‐50% bệnh nhân vẫn còn biểu  hiện  tổ  hợp  gen  TEL‐AML1(2,5).  TLTBAT  được  chứng  minh  là  liên  quan  đến  nguy  cơ  tái  phát  sau  này.  Trong  những  nghiên  cứu  về  vấn  đề  này,  các  tác  giả  đã  đưa  ra  kết  quả  chung  rằng  những  BN  không  phát  hiện  TLTBAT  vẫn  chưa  thấy  bị  tái  phát,  tuy  nhiên,  đối  với  những  BN  vẫn  còn  TLTBAT,  một  số  trường  hợp  đã  bị  tái  phát(4,8,11).  Huyết học (BVTMHH) TP. HCM, sau khi đã  thiết lập thành cơng điều kiện của kỹ thuật RQ‐ PCR cho tổ hợp gen TEL/AML1(12), chúng tơi tiến  Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học  RNA được ly trích từ mẫu tế bào lưu trữ với  Trizol  theo  qui  trình  kỹ  thuật  do  cơng  ty  cung  cấp.  Sau  đó,  đo  nồng  độ  RNA  bằng  máy  Ultrospec  5300  pro  (GE  Heathcare,  Anh).  Mẫu  đạt chất lượng khi có tỉ lệ OD260/OD280 = 1,8 –  2,0.  Lấy  đúng  1g  RNA  để  tổng  hợp  cDNA  nhằm  đảm  bảo  sự  đồng  nhất  đầu  vào  của  các  mẫu cần định lượng. Lượng RNA  còn  lại  được  lưu trữ ở nhiệt độ ‐80oC.  Tổng hợp cDNA  185 Nghiên cứu Y học  Tổng hợp cDNA sử dụng bộ kít Transcriptor  First  Strand  cDNA  Synthesis  Kit  (Roche,  Thụy  Sĩ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp  RNA và men sao chép ngược trên được ủ bằng  máy  luân  nhiệt  iCycler  (Biorad,  Mỹ)  theo  chu  trình  luân  nhiệt  là  25oC  trong  10  phút,  55oC  trong 30 phút, và 85oC trong 5 phút. Mẫu cDNA  được  pha  loãng  để  điều  chỉnh  về  nồng  độ  50  ng/3L và được lưu trữ ở ‐20oC đến khi sử dụng.  Thực hiện RQ‐PCR  Tiến  hành  chạy  RQ‐PCR  đồng  thời  mẫu  bệnh nhân, mẫu chuẩn và chứng nội tại ở cùng  điều kiện theo mô tả Thanh TTT và cộng sự(12) trên  máy CFX 96 của (Biorad, Mỹ). Mẫu chuẩn trong  nghiên  cứu  này  được  chuẩn  bị  theo  mô  tả  của  Thanh  TTT  và  cộng  sự(12)  với  Taqman  Probe  có  đầu  5’  được  đánh  dấu  bằng  FAM,  và  đầu  3’  được đánh dấu bằng TAMRA và chứng nội tại  được  lựa  chọn  sử  dụng  là  gen  ABL.  Chu  trình  ln nhiệt cho phản ứng RQ‐PCR như sau: 50oC  trong 2 phút; 95oC trong 10 phút; 50 chu kỳ với  95oC trong 10 giây, 60oC trong 30 giây. Phân tích  kết  quả  trực  tiếp  trên  máy  mà  khơng  cần  qua  bước điện di.  Phân tích kết quả  ‐  Kiểm  tra  các  thơng  số  của  đường  khuếch  đại và đường chuẩn để đánh giá tính chính xác,  hiệu suất phản ứng, và độ tin cậy của phản ứng.   ‐ Tính tỉ lệ phần trăm tổ hợp gen quan tâm  so với chứng nội tại, thể hiện kết quả dưới dạng  biểu đồ để dễ dàng đánh giá được mức độ tồn  lưu tế bào ác tính.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 thuật RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH (Bảng 1), ngoại  trừ ALL‐11 và ALL‐13.   Bảng 1: Kết quả TEL‐AML1 với kỹ thuật RQ‐PCR,  RT‐PCR và FISH lúc chẩn đốn.  STT MÃ BN ALL-01 116,90 (+) 89,00 ALL-02 158,69 (+) 96,05 ALL-03 105,01 (+) 91,50 ALL-04 114,20 (+) 98,00 ALL-05 422,01 (+) 98,00 ALL-06 71,78 (+) 97,00 ALL-07 234,15 (+) 97,50 ALL-08 115,38 (+) 97,00 ALL-09 204,32 (+) 81,50 10 ALL-10 75,82 (+) 90,00 11 ALL-11 0,35 (+) 15,00 12 ALL-12 56,92 (+) 78,05 13 ALL-13 31,18 (+) 64,45 Đến  lần  gửi  mẫu  thứ  hai  sau  khi  hồn  tất  giai  đoạn  tấn  cơng,  những  BN  này  không  phát  hiện  thấy  TLTBAT  bằng  kỹ  thuật  RT‐PCR  và  FISH. Tuy nhiên, 5 trong 13 BN (38,46%) vẫn còn  biểu  hiện  TEL‐AML1  ở  mức  thấp  từ  0,03%  đến  0,28 % với kỹ thuật RQ‐PCR (Bảng 2).   Bảng  2:  Kết  quả  của  BN  còn  biểu  hiện  TEL‐ AML1 sau hồn tất giai đoạn tấn cơng.  186 RQ-PCR RT-PCR FISH TELTEL-AML1 t(12;21) AML1/ABL (%) (%) (%) STT MÃ BN ALL-05 0,28 (-) 0,00 ALL-07 0,03 (-) 0,00 ALL-09 0,04 (-) 0,00 ALL-10 0,29 (-) Không làm ALL-13 0,16 (-) 0,00 KẾT QUẢ   Trong thời gian thực hiện nghiên cứu, chúng  tơi đã thu thập được 13 BN chẩn đốn BCCDL‐ B, thỏa mãn tiêu chuẩn chọn mẫu và được khảo  sát biểu hiện tổ hợp gen TEL‐AML1 qua các giai  đoạn  điều  trị  bằng  kỹ  thuật  RQ‐PCR,  trong  đó  có 12 BN (ALL‐01 đến ALL‐12) là mới chẩn đốn  và 1 BN (ALL‐13) là tái phát tủy lần 2. Ở lần gửi  mẫu đầu tiên trước điều trị, hầu hết các BN đều  có  biểu  hiện  TEL‐AML1  ở  mức  độ  cao  với  kỹ  RQ-PCR RT-PCR FISH TELTEL-AML1 t(12;21) AML1/ (%) (%) ABL (%) Trong  13  BN  trên,  có  2  BN  đã  tiếp  tục  gửi  mẫu để khảo sát TEL/AML1 sau các đợt hóa trị  liệu.  Kết  quả  mức  độ  biểu  hiện  TEL‐AML1  qua  Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  các giai đoạn điều trị bằng kỹ thuật RQ‐PCR của  từng BN được mơ tả như sau:  BN  Châu  Ngọc  K.  L.  là  BN  nữ,  sinh  năm  2004, mã ALL‐10. Kết quả RQ‐PCR của 3 lần gởi  mẫu theo dõi điều trị của BN ALL‐10 được tóm  tắt theo biểu đồ 1.  Nghiên cứu Y học BN  ALL‐13  được  chẩn  đoán  là  BCCDL  tái  phát và điều trị theo phác đồ COPRALL 2005.  Theo  biểu  đồ  2,  ở  lần  gửi  mẫu  đầu  tiên  trước  điều trị (ALL‐13‐1),  kết  quả  RQ‐PCR  cho  thấy  mức độ biểu hiện TEL‐AML1 là 31,18% so với  ABL.  Sau  hơn  3  tháng  điều  trị  xong  giai  đoạn  tấn  công,  kết  quả  RQ‐PCR  cho  thấy  mức  độ  biểu hiện TEL‐AML1 giảm khoảng 2 log và vẫn  còn 0,16%.    Biểu đồ 1: Kết quả RQ‐PCR theo dõi điều trị của BN  ALL‐10   Dựa  vào  biểu  đồ  1,  ở  lần  gửi  mẫu  đầu  tiên  (ALL‐10‐1) trước điều trị, kết quả khảo sát bằng  kỹ thuật RQ‐PCR cho thấy mức độ biểu hiện tổ  hợp  gen  TEL‐AML1  là  75,82%.  Ở  lần  gửi  mẫu  thứ hai (ALL‐10‐2) sau khi hồn tất giai đoạn tấn  cơng  thì  tỉ  lệ  này  giảm  gần  3  log  và  vẫn  còn  0,29%. Đến  lần  gửi  mẫu  thứ  ba  (ALL‐10‐3),  khi  hoàn  tất  tăng  cường  1  bằng  phát  đồ  FRALLE  2000 nhóm A1, kết quả RQ‐PCR cho thấy khơng  còn sự hiện diện của tổ hợp gen TEL‐AML1. Kết  quả  RQ‐PCR  so  với  kết  quả  RT‐PCR  và  FISH  theo Bảng 3.  Bảng 3: Kết quả RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH của ca  ALL‐10 qua các lần gửi mẫu  RQ-PCR TEL-AML1/ABL (%) ALL-10-1 75,82 ALL-10-2 0,29 ALL-10-3 0,00 Mã BN RT-PCR TEL-AML1 FISH t(12;21) (%) (+) (-) (-) 90,00 Không làm 0,00 BN Phan Chí U là BN nam, sinh năm 2000,  mã ALL‐13, tình trạng bệnh là tái phát tủy lần 2.  Kết quả RQ‐PCR các lần gởi mẫu theo dõi điều  trị của BN ALL‐13 được tóm tắt theo biểu đồ 2.  Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học    Biểu đồ 2: Kết quả RQ‐PCR theo dõi điều trị của BN  ALL‐12  Sau đó 2 tháng, sau khi hồn tất BLOCK R1  R2,  RQ‐PCR  cho  thấy  TLTBAT  chỉ  còn  0,10%  (Bảng 4). Đến lần gửi mẫu thứ  4  (ALL‐13‐4)  và  thứ 5 (ALL‐13‐5), tỷ lệ TLTBAT đã bắt đầu tăng  lên lần lượt là 0,36% và 2,42%. RT‐PCR cho kết  quả dương tính với cả 5 lần gửi mẫu (Bảng 4).  Bảng 4: Kết quả RQ‐PCR, RT‐PCR và FISH của ca  ALL‐12  Mã BN ALL-13-1 ALL-13-2 ALL-13-3 ALL-13-4 ALL-13-5 RQ-PCR RT-PCR FISH TEL-AML1/ABL (%) TEL-AML1 t(12;21 (%) 31,18 (+) 64,5 0,16 (+) 0,00 0,1 (+) Không làm XN 0,36 (+) Không làm XN 2,42 (+) Không làm XN BÀN LUẬN   Trong  13  BN  khảo  sát  biểu  hiện  TEL‐ AML1/ABL bằng RQ‐PCR trước điều trị, có 2 BN  ALL‐11 và ALL‐13 cho kết quả lần lượt là 0,35%  và  31,18%,  thấp  hơn  nhiều  so  với  các  BN  khác  (Bảng  1).  Đối  với  trường  hợp  ALL‐11,  kỹ  thuật  187 Nghiên cứu Y học  FISH  cho  kết  quả  dương  tính  t(12;21)  ở  mức  thấp  với  15%,  ngồi  ra  còn  có  thêm  1  dòng  tế  bào khác chiếm 80% biểu hiện 4 tín hiệu nhiễm  sắc thể 21. Trường hợp ALL‐13 đã được điều trị  bằng phát đồ đặc hiệu và tái phát lần 1, sau đó  được  điều  trị  bằng  phát  đồ  FRALLE  93  và  tái  phát tủy lần 2, nên TEL‐AML1 không biểu hiện ở  mức  cao.  Những  trường  hợp  mới  được  chẩn  đoán,  chưa  trải  qua  quá  trình  điều  trị  thì  tỉ  lệ  TEL‐AML1/ABL rất cao như ALL‐2, ALL‐5, ALL‐ 7,  ALL‐9,   với  tỉ  lệ  >100%  (Bảng  1),  cao  hơn  so  với tỉ lệ tế bào có t(12;21) khảo sát bằng kỹ thuật  FISH,  cho  thấy  dòng  tế  bào  ung  thư  có  t(12;21)  biểu hiện bản sao TEL‐AML1 rất mạnh.   Tổ  hợp  gen  TEL‐AML1  xuất  hiện  ở  trẻ  em  mắc bệnh BCCDL‐B cho tiên lượng tốt  (5, 8). Sau  khi hồn tất điều trị tấn cơng, kết quả kiểm tra  bằng FISH và RT‐PCR là âm tính hay  kết  quả  RQ‐PCR cho TLTBAT ở mức thấp hoặc khơng  phát hiện đã thể hiện khả năng đáp ứng điều  trị tốt của các BN BCCDL‐B dương tính tổ hợp  gen TEL‐AML1. Tuy nhiên, 38,46% BN vẫn còn  TLTBAT ở mức rất thấp (  0,01%  và  4  BN  có  TLTBAT