Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP xác định các LOCI HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài này được tiến hành nhằm xác định kháng nguyên HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 ở người cho và người nhận tế bào gốc tại Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh, với phương pháp định type HLA ở 203 đối tượng nhờ kỹ thuật polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP).

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-SSP XÁC ĐỊNH CÁC LOCI HLA-A, -B, -C, DRB1, -DRB3/4/5 VÀ –DQB1 TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Hồng Thị Tuệ Ngọc*, Phan Nguyễn Thanh Vân*, Huỳnh Thị Thu Hương*, Phạm Thị Kim Ngân*, Lê Thanh Trúc*, Nguyễn Tấn Bỉnh** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định kháng nguyên HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 –DQB1 người cho người nhận tế bào gốc Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh Phương pháp: Định type HLA 203 đối tượng nhờ kỹ thuật polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) Kết quả: Tổng cộng có 14 họ allele HLA-A, 25 HLA-B, 12 HLA-C, 13 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLADRB1, HLA-DRB5 HLA-DQB1 tìm thấy Các họ alen HLA-A*11, A*02, A*24, B*15, B*46, B*07, Cw*07, Cw*08, Cw*01, DRB1*12, DRB1*09, DRB3*03, DRB3*02, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03 DQB1*05 chiếm ưu nghiên cứu Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để định danh HLA đáp ứng nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu BVTMHH Từ khóa: PCR-SSP, hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (HLA) ABSTRACT APPLICATION OF THE PCR-SSP FOR IDENTIFYING THE HLA-A, -B -C, -DRB1, -DRB3/4/5 AND – DQB1 LOCI AT THE BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL - HO CHI MINH CITY Hoang Thi Tue Ngoc, Phan Nguyen Thanh Van, Huynh Thi Thu Huong, Pham Thi Kim Ngan, Le Thanh Truc, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 488 - 492 Objective: To determine the HLA –A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 and –DQB1 in the donors-recipients in the Blood Transfusion Hematology Hospital - Ho Chi Minh City Methods: The HLA typing in 203 subjects was studied using the polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) Results: A total of 14 HLA-A, 25 HLA-B, 12 HLA-C, 13 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB1, HLA-DRB5 and HLA-DQB1 alleles were found HLA-A*11, A*02, A*24, B*15, B*46, B*07, Cw*07, Cw*08, Cw*01, DRB1*12, DRB1*09, DRB3*03, DRB3*02, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03 and DQB1*05 were predominant in this study Conclusion:Our study showed the application of the PCR-SSP for identifying of the HLA alleles was responded to the hematopoietic stem cell transplatation at the Blood Transfusion Hematology Hospital - Ho Chi Minh City Keywords: polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP), human leukocyte antigen system (HLA) * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: ThS.BS Phan Nguyễn Thanh Vân ĐT: 091.691.770 488 Email: vanntp@yahoo.com Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ thống kháng nguyên bạch cầu (HLA human leukocyte antigen system) tên gọi phức hợp hòa hợp mơ chủ yếu (major histocompatibility complex - MHC) người Hệ miễn dịch dùng kháng nguyên HLA yếu tố để xác định kháng nguyên phù hợp với thể Vì hệ thống HLA hàng rào thải ghép, sau hệ kháng nguyên ABO(1,2) Các kháng ngun HLA có vai trò quan trọng ghép quan nhiều nghiên cứu quan tâm kháng nguyên HLA-A, HLA-B, HLA-C (HLA lớp I) kháng nguyên HLA-DR, HLA-DQ (HLA lớp II) HLA hệ thống có kiểu gen phức tạp đa dạng Kết đa hình hai cá thể khơng có quan hệ huyết thống với có tỷ lệ tương đồng tất locus quy định HLA thấp(1) Như vậy, việc xác định kiểu gen HLA có ý nghĩa nhằm tìm người hiến tạng có tương đồng HLA với người nhận, góp phần quan trọng vào thành công trường hợp ghép tạng Do kháng nguyên HLA kháng nguyên đồng trội nên cá thể có biểu lộ kháng nguyên locus (A, B, DR, …) Các kháng nguyên định danh phương pháp định type diện kháng ngun khơng ảnh hưởng đến việc định danh kháng nguyên khác(2,6) Có nhiều phương pháp định danh HLA Trước tính đặc thù HLA xác định huyết học từ phương pháp PCR đời, kỹ thuật định danh HLA có tiến đáng kể Ngày nay, có nhiều kỹ thuật dựa PCR phát triển cho mục đích định danh HLA, ví dụ như: PCR-SSO (polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotides), PCR-SBT (polymerase chain reaction - sequence-based typing), PCR-SSP (polymerase chain reactionsequence specific primers)… Các phương pháp có độ xác cao có tính khả Chun Đề Truyền Máu Huyết Học Nghiên cứu Y học thi dễ dàng chuẩn hóa quy trình phương pháp định type cổ điển huyết học nên ngày ưu tiên lựa chọn(7) Để phục vụ cho công tác ghép tế bào gốc tạo máu Thành Phố Hồ Chí Minh, Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) triển khai kỹ thuật PCR-SSP việc định danh HLA-A, -B, - DR từ năm 2004 sau mở rộng thêm với việc định danh HLA-C, -DQB1 kể từ năm 2010 Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định loci HLA-A, -B, -C, DRB1, -DRB3/4/5 –DQB1 BVTMHH khoảng thời gian từ tháng 06/2010 đến tháng 07/2011 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu mô tả tiến cứu thực từ tháng 06/2010 đến tháng 07/2011 BVTMHH mẫu máu ngoại vi 203 người, bao gồm bệnh nhân có định ghép tế bào gốc tạo máu thân nhân người cho tế bào gốc dự kiến Mẫu máu ngoại vi đối tượng nghiên cứu thu thập ống chống đơng EDTA, sau chuyển đến phận HLA, Khoa Miễn Dịch, BVTMHH để ly trích DNA ngày DNA tồn phần ly trích từ 200 L máu QIAamp Blood Mini Kit cơng ty Qiagen theo quy trình cơng ty cung cấp DNA sau ly trích có độ tinh từ 1,6 1,9 OD, dùng để thực PCR trữ -20oC sử dụng Xác định HLA thực kỹ thuật PCR-SSP với xét nghiệm Micro SSPTM công ty One Lamda Tất trường hợp bắt đầu xét nghiệm loại tổng quát (Generic) (1) Micro SSP TM HLA Class I and II ABDR DNA Typing Tray; (2) Micro SSP TM HLA Class I C Locus Specific (3) Micro SSP TM HLA Class II Typing Tray DQB1 only Dựa vào kết phân tích loci HLA-A, -B, -C, -DRB1, DRB3/4/5, -DQB1 từ xét nghiệm loại tổng 489 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 quát (Generic) trên, tùy trường hợp mà sử dụng thêm xét nghiệm loại đặc hiệu cho gen (Allele Specific) phù hợp để xác định xác họ allele đối tượng Các xét nghiệm gồm hai thành phần khay có sẵn primer đặc hiệu D-mix với thành phần có sẵn cho phản ứng PCR (Ngoại trừ Taq polymerase) Taq polymerase sử dụng phản ứng PCR iTaq DNA polymerase cơng ty BioRad Dựa theo quy trình nhà sản xuất, tất phản ứng thực với thể tích tổng cộng 10 L Phản ứng cài đặt theo chu trình luân nhiệt sau: 96oC 130 giây, 63oC 60 giây, tiếp chu kỳ với bước 96oC 10 giây bước 63oC 60 giây, sau 20 chu kỳ với bước 96oC 10 giây, bước 59oC 50 giây bước 72oC 30 giây Sản phẩm PCR điện di thạch agarose 2% dung dịch đệm 0,5xTBE chụp hình Kết phân tích nhờ phần mềm HLA Fusion 2.0 Tần xuất allele HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 –DQB1 ước tính tính tốn trực tiếp KẾT QUẢ Do kháng nguyên HLA kháng nguyên đồng trội nên cá thể có biểu lộ kháng nguyên locus Trong nghiên cứu này, xác định kiểu gen HLA 203 người, nghĩa locus có tổng cộng 406 trường hợp phân tích Phân bố allele HLA lớp I Sự phân bố họ allele HLA lớp I (HLA-A, -B -C) nghiên cứu trình bày Bảng Nghiên cứu tìm thấy 14 họ allele locus HLA-A Trong dân số nghiên cứu, HLA-A*11 họ allele HLA-A phổ biến (chiếm 23,4%), theo sau A*02 (chiếm 22,6%) A*24 (chiếm 19,7%) Ngồi ra, có 19 trường hợp khơng phân định A*02 với A*24, có trường hợp không phân định A*02 với A*92 Các trường hợp xếp riêng vào nhóm HLA-A*02/24 HLA-A*02/92, có tỉ lệ lần 490 lượt 4,7% 0,7% Như thực tế, tỉ lệ A*02 A*24 cao số 22,6% 19,7% Tại locus HLA-B, nghiên cứu tìm thấy 25 họ allele, phổ biến HLA-B*15 (chiếm 19,2%), theo sau B*46 (chiếm 12,8%) B*07 (chiếm 12,5%) Có 31 trường hợp (trong tổng số 406) khơng phân định xác họ allele, trường hợp chiếm 7,3% số HLA-B nghiên cứu Có 12 họ allele HLA-C xác định qua nghiên cứu Cw*07 họ allele thường gặp dân số nghiên cứu này, chiếm tỉ lệ 21,6% Tiếp đó, họ allele chiếm tỉ lệ cao Cw*08 (chiếm 17,5%) Cw*01 (chiếm 16,7%) Ngồi ra, có trường hợp không phân biệt Cw*08 với Cw*05 trường hợp không phân định Cw*01 với HLA-C khác Như vậy, tỉ lệ Cw*08 Cw*01 thực tế cao Bảng 1: Phân bố tần xuất allele HLA lớp I 203 người HLA-A HLA-B HLA-C Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% A*01 3,2 B*07 12,5 Cw*01 16,7 A*02 22,6 B*08 1,2 Cw*02 0,2 A*03 1,9 B*13 6,6 Cw*03 13,3 A*11 23,4 B*15 19,2 Cw*04 8,6 A*24 19,7 B*18 3,2 Cw*05 3.4 A*26 2,9 B*27 2,2 Cw*06 3,9 A*29 5,9 B*35 3,9 Cw*07 21,6 A*30 2,9 B*38 3,7 Cw*08 17,5 A*31 0,2 B*39 1,5 Cw*12 2,5 A*33 8,6 B*40 4,4 Cw*14 0,7 A*34 0,2 B*44 1,5 Cw*15 7,4 A*68 2,9 B*45 0,2 Cw*16 0,2 A*74 0,2 B*46 12,8 Cw*01/12 0,2 A*02/24 4,7 B*48 1,2 Cw*01/14 0,7 A*02/92 0,7 B*51 3,9 Cw*01/03/04 0,2 B*52 1,2 Cw*03/05 0,7 B*53 0,2 Cw*06/12 0,5 B*54 3,7 Cw*08/05 1,5 B*55 1,2 Cw*12/14 0,2 B*56 0,5 B*57 2,5 B*58 4,9 B*95 0,5 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 HLA-A HLA-B Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% B*13/44 0,2 B*15/45 4,7 B*15/46 0,2 B*27/47 0,2 B*38/39 0,5 B*38/44 0,2 B*39/67 0,2 B*40/45 0,2 B*44/51 0,2 B*46/95 0,5 B*54/55 0,2 HLA-C Họ allele Tỉ lệ% Phân bố allele HLA lớp II Sự phân bố allele HLA lớp II (HLADRB1, -DRB3/4/5 -DQB1) trình bày Bảng Trong số 13 họ allele HLA-DRB1 xác định, allele DRB1*12 chiếm tỉ lệ vượt trội nghiên cứu, với 29,8% trường hợp Họ allele có tần xuất cao DRB1*09 (chiếm 19,4%) Tiếp theo hai họ allele DRB1*15 DRB1*10, với tỉ lệ 9,8% 9,3% Tất trường hợp xác định HLADRB1 nghiên cứu định rõ họ allele Bảng 2: Phân bố tần xuất allele HLA lớp II 203 người HLA-DRB1 HLA-DRB3/4/5 HLA-DQB1 Tỉ Họ allele Tỉ Họ allele Họ allele Tỉ lệ% lệ% lệ% DRB1*01 0,7 DRB3*01 4,2 DQB1*01 0,2 DRB1*03 3,2 DRB3*02 19,5 DQB1*02 4,9 DRB1*04 5,4 DRB3*03 26,4 DQB1*03 40,3 DRB1*07 5,9 DRB3*02/03 0,5 DQB1*04 3,7 DRB1*08 3,6 DRB3*01/02 0,2 DQB1*05 28,3 DRB1*09 19,4 DRB3*01/02/03 1,9 DQB1*06 11,8 DRB1*10 9,3 DRB4*01 32,3 DQB1*01/06 0,2 DRB1*11 2,9 DRB5*01 14,5 DQB1*03/04 10,1 DRB1*12 29,8 DRB5*01/02 0,5 DQB1*03/06 0,5 DRB1*13 4,2 DRB1*14 4,6 DRB1*15 9,8 DRB1*16 1,2 Trong dân số nghiên cứu, có 52,7% trường hợp biểu DRB3; 32,3% trường hợp biểu DRB4 15% trường hợp biểu DRB5 Trong trường hợp biểu DRB3, có họ allele tìm thấy nghiên Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Nghiên cứu Y học cứu HLA-DRB3*01, DRB3*02 DRB3*03, họ allele DRB3*03 thường gặp (chiếm 26,4% tổng số 406 trường hợp) Tất trường hợp biểu DRB4 DRB4*01 (chiếm 32,3%) Trong số họ allele HLA-DQB1 tìm thấy nghiên cứu, họ allele HLA-DQB1*03 DQB1*05 phổ biến (chiếm tỉ lệ 40,3% 28,3%) BÀN LUẬN Nghiên cứu dựa phân tích kháng nguyên HLA bệnh nhân có định ghép tế bào gốc tạo máu BVTMHH người cho tế bào gốc dự kiến anh chị em ruột, bà có liên hệ huyết thống bệnh nhân nên tần suất allele đại diện cho dân số chung Tuy nhiên, kết nghiên cứu đưa số ước tính allele thường gặp người Việt Nam Trong nghiên cứu này, phân tích phân bố allele locus HLA-A cho thấy có tương đồng với nghiên cứu nước châu Á, họ allele chiếm ưu A*11, A*02 A*24(3,5,7) Ở hầu hết nghiên cứu dân số châu Á ghi nhận nhóm allele A*02 chiếm tỉ lệ cao nhất, nghiên cứu cho thấy tỉ lệ A*11 cao A*02 (23,4% so với 22,6%) Tuy nhiên, có 21 trường hợp (5,4%) nghiên cứu không phân định A*02 với A*24 A*92 nên thực tế tỉ lệ A*02 cao A*11 Khi so sánh phân bố kháng nguyên HLA-B nghiên cứu với nghiên cứu Hoa B.K cộng 170 người Việt Nam dân tộc Kinh, nhận thấy có điểm chung allele HLA-B*15, B*46 B*07 chiếm ưu thế(3) Tuy nhiên, kết có khác biệt so với nghiên cứu khác quần thể dân châu Á nghiên cứu Chunmei Shen cộng 516 người Trung Quốc khỏe mạnh tìm thấy allele hay gặp HLA-B*13, B*15 B*51 với tỉ lệ 11%; 9,3% 8,5%(5) Họ allele B*40 không chiếm ưu nghiên cứu (4,4%) 491 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 theo số nghiên cứu khác thường gặp châu Á(4) Khi so sánh phân bố allele HLA-C, DRB1, -DQB1 nghiên cứu với nghiên cứu Hoa B.K 170 người Việt Nam dân tộc Kinh, chúng tơi nhận thấy có số tính chất chung allele Cw*01, Cw*07, Cw*08, DRB1*12, DQB1*03, DQB1*05 thường gặp nhất(3) Như vậy, cho dù dân số nghiên cứu người cho người nhận có quan hệ huyết thống kết thể hình ảnh đặc trưng cho dân số chung người Việt Nam Về mặt kỹ thuật định danh HLA dùng nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy có số trường hợp không phân định rõ họ allele (5,4% trường hợp HLA-A; 7.3% HLA-B; 3,6% HLA-C; 3,1% HLA-DRB3/4/5 10,8% HLADQB1) Vấn đề giai đoạn đầu nghiên cứu khơng có nhiều thơng tin allele thường gặp, mẫu thực với xét nghiệm loại tổng quát (Generic) nên có nhiều trường hợp khơng phân định Dần dần, q trình nghiên cứu, chúng tơi triển khai thêm xét nghiệm loại đặc hiệu cho gen (Allele Specific) nên trường hợp sau phân định rõ họ allele Về mặt dịch tễ, điểm hạn chế nghiên cứu xét mặt thực tế lâm sàng chấp nhận trường hợp ghép BVTMHH 492 anh chị em ruột nên dựa thêm vào tương hợp locus khác để tìm người cho phù hợp KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định loci HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 –DQB1 đáp ứng nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu BVTMHH Đây sở cho việc định danh HLA cho mẫu máu cuống rốn nhằm phục vụ việc phát triển ngân hàng máu cuống rốn bệnh viện TÀI LIỆU THAM KHẢO Choo SY (2007) The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications Yonsei Medical Journal, 48: 11-23 Ferrer A et al (2005) Overview on HLA and DNA typing methods Biotechnologia Aplicada, 22: 91-101 Hoa BK (2008) HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam Tissue Antigens, 71(2): 127-134 Shankarkumar U (2010) Complexities and similarities of HLA antigen distribution in Asian subcontinent Indian J Hum Genet, 16(3): 108-110 Shen C (2008) Genetic polymorphisms at HLA-A, -B, and – DRB1 loci in Han population of Xi’an city in China Croat Med J., 49: 476-482 Sullivan KA KIPPS TJ (2010) Human leukocyte and platelet antigens In: Williams Hematology, 8ed MacGraw-Hill, Inc International edition, New York Zhu B et al (2010) Distribution of HLA-A and –B alleles and haplotypes in the Yi ethnic minority of Yunnan, China: relationship to other populations Journal of Zhejiang University-Science, 11(2): 127-135 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học ... pháp định type cổ điển huyết học nên ngày ưu tiên lựa chọn(7) Để phục vụ cho công tác ghép tế bào gốc tạo máu Thành Phố Hồ Chí Minh, Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) triển khai kỹ thuật PCR-SSP. .. cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định loci HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 –DQB1 đáp ứng nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu BVTMHH Đây sở cho việc định danh HLA cho mẫu máu cuống rốn... việc định danh HLA-A, -B, - DR từ năm 2004 sau mở rộng thêm với việc định danh HLA-C, -DQB1 kể từ năm 2010 Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định