Xác định 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong bạch cầu cấp dòng tủy tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT). Nghiên cứu được tiến hành trên bệnh nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7 năm 2011.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 XÁC ĐỊNH TỔ HỢP GEN AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 TRONG BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phan Nguyễn Thanh Vân*, Nguyễn Tấn Bỉnh*, Nguyễn Thị Kim Định*, Phan Thị Xinh** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang Sử dụng phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược với mồi thiết kế phát tất kiểu tổ hợp gen Nghiên cứu tiến hành bệnh nhân BCCDT Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng năm 2011 Kết quả: 19 bệnh nhân (BN) biểu AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu PML/RARA (6,8%), BN biểu CBFB/MYH11 (4,3%), BN biểu MLL/AF9 (2,5%), số 162 BN BCCDT Kết luận: Kỹ thuật RT-PCR đơn giản, có độ nhạy cao nên triển khai sở chuyên khoa Huyết học Việt Nam để giúp phát nhanh chuyển vị NST thường gặp BCCDT mà bệnh lý máu ác tính khác Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT), Phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ABSTRACT DETECTION OF FUSION GENES: AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HO CHI MINH CITY Phan Nguyen Thanh Van, Nguyen Tan Binh, Nguyen Thi Kim Dinh, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 498 - 502 Objective: To detect fusion genes AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 in Acute Myeloid Leukemia (AML) patients Method: Case series - descriptive research Using RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) with primer sets that can amplify all possible transcripts of each fusion gene From March 01, 2010 to July 31, 2011, we analysed Acute Myeloid Leukemia patients at Blood Transfusion Hematology Hospital Results: 19 patients expressing AML1/ETO (11.7%), 11 patients expressing PML/RARA (6.8%), patients expressing CBFB/MYH11 4.3%), and patients expressing MLL/AF9 (2.5%), among 162 newly diagnosed patients with AML Conclusion: RT-PCR is simple and highly sensitive technique that should apply to detect the frequent chromosome translocations not only in AML but also in other hematologic malignancies in hematology centers in Vietnam * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS BS Phan Nguyễn Thanh Vân ĐT: 0919.691.770 Email: vanntp@yahoo.com 498 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Keywords: Acute Myeloid Leukemia (AML), Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ĐẶT VẤN ĐỀ Phương pháp Cho đến nay, bất thường nhiễm sắc thể (NST) liên quan chặt chẽ với bệnh lý ác tính hệ tạo máu điểm quan trọng việc chẩn đoán tiên lượng bệnh(11) Khảo sát bất thường NST đột biến gen lúc chẩn đoán yếu tố tiên lượng độc lập đáp ứng điều trị thời gian sống bệnh nhân (BN) Việc phân nhóm nguy theo di truyền tế bào khác nhóm BN trẻ tuổi nhóm ≥ 60 tuổi bất thường NST mắc phải diện tế bào ung thư máu hầu hết bệnh nhân BCCDT Mẫu máu mẫu tủy ly trích RNA sử dụng Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) theo qui trình kỹ thuật cơng ty cung cấp Sau ly trích RNA, cDNA tổng hợp cách sử dụng kít iScript cDNA synthesis (Cơng ty Biorad, Mỹ), tn thủ qui trình kỹ thuật công ty Một số chuyển vị NST tạo tổ hợp gen đặc trưng bệnh BCCDT AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 chuyển vị nhiễm sắc thể t(8;21)(q22;q22)(1,15,16,17), t(15;17)(q22;q11)(2,5,6,8), (4,7,13) inv(16)(p13;q22) , t(9;11)(p21-22;q23)(3,10,14), tương ứng Từ đầu năm 2010 đến nay, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM sử dụng phương pháp RT-PCR để khảo sát tổ hợp gen thường gặp AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 BCCDT lúc chẩn đoán Với phương pháp này, kết xác định vòng tuần góp phần phân nhóm tiên lượng vào ngày thứ phác đồ điều trị, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp cho bệnh nhân ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Thành phần phản ứng PCR gồm có μL cDNA trộn với 0,1 μL (0,5 U) iTaq Polymerase (Biorad), μL (10 pmol) cặp mồi xuôi ngược 20 μL hỗn hợp Để khuếch đại tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9, mồi cho tổ hợp gen sử dụng Riêng tổ hợp gen cần khảo sát qua hai giai đoạn phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng μL sản phẩm phản ứng PCR lần thứ làm mạch khuôn Nhiệt độ bắt cặp thời gian phản ứng thay đổi tùy theo loại tổ hợp gen, cặp mồi, tùy theo trường hợp cụ thể Phản ứng PCR thực cách sử dụng máy luân nhiệt iCycler (Công ty Biorad) Sản phẩm phản ứng PCR điện di thạch 2% chứa 0,5 μg/mL ethidium bromide 0,5 x TBE, quan sát hệ thống Gel Doc EQ (Cơng ty Biorad) Kết dương tính biểu kích thước băng tương ứng cặp mồi mô tả bảng 1(18) Kết xử lý phần mềm Excell Medicalc Bảng 1: Danh sách đoạn mồi khảo sát tổ hợp gen BCCDT STT Tên mồi Trình tự nucleotide Mơ tả loạt ca Đối tượng Nghiên cứu tiến hành 162 bệnh nhân BCCDT Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng năm 2011 Bệnh nhân chẩn đốn xác định bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, dựa vào huyết đồ, tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Tên gen kích thước sản phẩm 5' CTA CCG CAG AML1-A CCA TGA AGA ACC AML1/ETO 3' AML1 exon 5/ ETO 5' AGA GGA AGG exon 2: 395 bp ETO-B CCC ATT GCT GAA 3' 5' AGC GCG ACT PML/RARA PML-C2 ACG AGG AGA T 3' Type bcr1: 688 bp 5' CTG CTG CTC Type bcr2: 652 bp RARA-D TGG GTC TCA AT 3' Type bcr3: 289 bp 499 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 STT Tên mồi Trình tự nucleotide CBFB-C MYH11D2 MLL-F1 AF9-R1 MLL-F2 10 AF9-R2 Tên gen kích thước sản phẩm 5' GGG CTG TCT GGA GTT TGA TG 3' CBFB/MYH11 Type A: 271 bp 5' CTT GAG CGC CTG CAT GTT 3' 5' CCA GAG CAG AGC AAA CAG AAA A 3' MLL/AF9 5' CGA TCT GCT GCA GAA TGT GTC MLL exon 9/ AF9 3' exon 5: 468bp 5' CCG CCC AAG MLL exon 10/ AF9 TAT CCC TGT A 3' exon 4: 645 bp 5' GTA TGC CTT GTC ACA TTC ACC A 3' KẾT QUẢ Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, 162 bệnh nhân BCCDT chọn vào nhóm nghiên cứu, để xác định tổ hợp gen nêu Tuổi trung vị 35,5 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) 16 giá trị bách phân thứ 75 (75%) 46 Trong đó, tuổi trung vị giới nam 39, giới nữ 31,5 Sự phân bố tuổi thể bảng Bảng 2: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT theo tuổi Nhóm tuổi Dưới 15 tuổi Từ 15 đến 30 tuổi Từ 30 đến 45 tuổi Từ 45 đến 60 tuổi Từ 60 tuổi trở lên Tổng số Số lượng 36 35 39 40 12 162 Tỉ lệ% 22,2% 21,6% 24,1% 24,7% 7,4% 100,0% Tỉ lệ nam (51,9%) nữ (48,1%) gần tương đồng Chẩn đoán tủy đồ chiếm đa số M2 (61,1%); kế tiếp, M3 (14,2%), M4 (12,3%) (Bảng 3) Bảng 3: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT theo chẩn đốn tủy đồ Chẩn đoán M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Tổng số 500 Số lượng 99 23 20 162 Tỉ lệ% 1,9% 3,1% 61,1% 14,2% 12,3% 1,9% 4,3% 1,2% 100,0% Kết xác định gen mơ tả bảng Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, nhóm lại chiếm tỉ lệ 77,2% Bảng 4: Kết tổ hợp gen BCCDT Loại gen AML1/ETO PML/RARA CBFB/MYH11 MLL/AF9 Không biểu gen Tổng số Số lượng 19 11 121 162 Tỉ lệ% 11,7% 6,8% 4,3% 2,5% 74,7% 100,0% Chẩn đoán tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào có liên quan với tổ hợp gen (Bảng 5, 6, 8) Bảng 5: Phân phối nhóm bệnh BCCDT theo chẩn đốn tủy đồ tổ hợp gen (P < 0,0001) Loại gen Không AML1/ CBFB/M MLL/A PML/RARA biểu Tổng số ETO YH11 F9 gen M0 0 0 3 (1,9%) M1 0 0 5 (3,1%) M2 17 77 99 (61,1%) M3 11 11 23 (14,2%) M4 15 20 (12,3%) M5 0 (1,9%) M6 0 0 7 (4,3%) M7 0 0 2 (1,2%) 19 11 121 Tổng số (11,7% 162 (6,8%) (4,3%) (2,5%) (74,7%) ) Chẩn đốn Bảng 6: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M2 tổ hợp gen AML1/ETO (P = 0,0143) Tổ hợp gen AML1/ETO + AML1/ETO Tổng số Chẩn đốn Khơng phải M2 Tổng số M2 17 19 (11,7%) 82 61 143 (88,3%) 99 63 162 (61,1%) (38,9%) Bảng 7: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M2 tổ hợp gen PML/RARA (P = 0,0001) Tổ hợp gen PML/RARA + PML/RARA Tổng số Chẩn đốn M2 Khơng phải M2 Tổng số 11 11 (6,8%) 99 52 151 (93,2% ) 99 (61,1%) 63 (38,9%) 162 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Bảng 8: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M3 tổ hợp gen PML/RARA (P < 0,0001) Tổ hợp gen Chẩn đoán M3 Không phải M3 Tổng số 11 11 (6,8%) PML/RARA + 12 139 151 (93,2%) PML/RARA Tổng số 23 (14,2%) 139 (85,8%) 162 BÀN LUẬN Đối với BCCDT, bất thường NST lúc chẩn đốn có ý nghĩa tiên lượng rõ ràng Có kiểu chuyển vị NST thường gặp BCCDT t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), inv(16)(p13;q22), t(9;11)(p21-22;q23) tạo kiểu tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 tương ứng Trong chuyển vị NST trên, t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), inv(16)(p13;q22) thuộc nhóm tiên lượng tốt, t(9;11)(p21-22;q23) hay khơng có chuyển vị NST thuộc nhóm tiên lượng trung bình Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, khảo sát 162 bệnh nhân (BN) BCCDT chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR, phát 19 BN biểu AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu PML/RARA (6,8%), BN biểu CBFB/MYH11 (4,3%), BN biểu MLL/AF9 (2,5%) (Bảng 4) Trong nghiên cứu này, với kỹ thuật RT-PCR, phát 41 bệnh nhân có mang kiểu tổ hợp gen thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,3% giúp phân nhóm tiên lượng bệnh nhân BCCDT Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, tỉ lệ tương đương với nghiên cứu United Kingdom Medical Research Council (MRC-10) Nhóm lại chiếm tỉ lệ 77,2% có biểu MLL/AF9 hay không biểu tổ hợp gen số tổ hợp gen khảo sát, nhiên chưa thể loại trừ bất thường nhiễm sắc thể (NST) khác nên khơng xếp vào nhóm tiên lượng trung bình Điều cho thấy vai trò quan trọng NST đồ phân nhóm tiên lượng Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Nghiên cứu Y học BCCDT, kỹ thuật di truyền phân tử đại FISH RT-PCR hỗ trợ khơng thể thay hồn tồn NST đồ Tuy nhiên, kỹ thuật RT-PCR có nhiều ưu điểm việc khảo sát tổ hợp gen thường gặp BCCDT, thời gian ngắn (trong vòng 24 giờ), có ý nghĩa tiên lượng định hướng điều trị Tiêu biểu phát t(15;17) tổ hợp gen PML/RARA đóng góp lớn việc định điều trị ATRA; sở cho chẩn đoán, theo dõi điều trị tiên lượng Trong nghiên cứu chúng tơi, có mối liên quan chẩn đoán tủy đồ tổ hợp gen (P < 0,0001 - Bảng 5), cụ thể liên quan có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) chẩn đoán BCCDT thể M2 gen AML1/ETO (Bảng 6), thể M2 gen PML/RARA (Bảng 7), thể M3 gen PML/RARA (Bảng 8) Nói cách khác, tổ hợp gen PML/RARA thường gặp BCCDT thể M3 không gặp BCCDT thể M2 thể khác; tổ hợp gen AML1/ETO thường gặp BCCDT thể M2 Điều góp phần cho hướng chẩn đốn xác thể bệnh BCCDT Gần đây, có nhiều nghiên cứu xuất đột biến gen thay đổi biểu gen ảnh hưởng trực tiếp đến tiên lượng bệnh nhân Điều ghi nhận bệnh nhân BCCDT người lớn lẫn trẻ em(9,12) Có mối tương quan kiểu gen quy định đột biến với dự hậu điều trị hay nguy tái phát BN chẩn đoán BCCDT có kết di truyền học bình thường Trong tương lai, kỹ thuật NST đồ, FISH RT-PCR thiết lập điều kiện ứng dụng thành công vào chẩn đoán bất thường NST, cần triển khai khảo sát đột biến gen để phân nhóm tiên lượng xác cho nhóm bệnh nhân có NST đồ bình thường bệnh nhân cấy NST không mọc Đồng thời, cần triển khai RQ-PCR để định lượng số tổ hợp gen để theo dõi đáp ứng xác q trình điều trị Đó cơng việc lớn cần nhiều thời gian kinh 501 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 phí liên quan đến nhiều gen nhiều tổ hợp gen Đây nghiên cứu khảo sát tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 người Việt Nam Chúng tơi chuẩn hóa thành công sử dụng kỹ thuật cách thường quy khảo sát bất thường NST gen cho bệnh nhân BCCDT Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh KẾT LUẬN Kỹ thuật RT-PCR phát tổ hợp gen thường gặp BCCDT cách nhanh chóng, có độ nhạy độ đặc hiệu cao, góp phần cho hướng chẩn đốn xác thể bệnh BCCDT, giúp phân nhóm tiên lượng xác góp phần nâng cao chất lượng hiệu điều trị Kỹ thuật đơn giản nên dễ dàng triển khai phòng xét nghiệm sinh học phân tử chuyên ngành Huyết học 10 11 12 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 502 Asou H, Tashiro S, Hamamoto K, et al (1991) Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21 chromosome translocation Blood, 77 (9): 2031-2036 Borrow J, Goddard AD, Sheer D, et al (1990) Molecular analysis of acute promyelocytic leukemia breakpoint cluster region on chromosome 17 Science, 249 (4976): 1577-1656 Cavazzini F, Bardi A, Tammiso E, et al (2006) Validation of an interphase fluorescence in situ hybridization approach for the detection of MLL gene rearrangements and of the MLL/AF9 fusion in acute myeloid leukemia Haematologica, 91 (3): 381385 Claxton DF, Liu P, Hsu HB, et al (1994) Detection of fusion transcripts generated by the inversion 16 chromosome in acute myelogenous leukemia Blood, 83 (7): 1750-1755 de Thé H, Chomienne C (1990) The t(15;17) translocation of acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor α gene to a novel transcribed locus Nature, 347: 558-561 Lemons RS, Eilander D (1990) Cloning and characterization of the t(15;17) translocation breakpoint region in acute promyelocytic leukemia Genes Chromosome Cancer, 2: 79-87 15 16 17 18 Liu PP, Tarle SA, Hajra A (1993) Fusion between transcription factor CBFβ/PEBP2β and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia Science, 261: 1041-1044 Longo L, Pandolfi PP (1990) Rearrangements and aberrant expression of the RARa gene in acute promyelocytic leukemias J Exp Med, 172: 1571-1575 Mrozek K, Marcucci G, Paschka P, et al (2007) Clinical relevance of mutations and gene-expression changes in adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics: are we ready for a prognostically prioritized molecular classification? Blood, 109 (2): 431-478 Muller CI, Trepel M, Kunzmann R, et al (2004) Hematologic and molecular spontaneous remission following sepsis in acute monoblastic leukemia with translocation (9;11): a case report and review of the literature Eur J Haematol, 73 (1): 62-67 Raimondi CS (2006) Cytogenetics of acute leukemias In: PUI (Eds.) Childhood Leukemias, 2nd edition: 235-237 Cambrigde University Press, UK Shimada A, Taki T, Tabuchi K, et al (2008) Tandem duplications of MLL and FLT3 are correlated with poor prognoses in pediatric acute myeloid leukemia: a study of the Japanese childhood AML Cooperative Study Group Pediatr Blood Cancer, 50 (2): 264-272 Shurtleff SA, Meyers S, Hiebert SW, et al (1995) Heterogeneity in CBF beta/MYH11 fusion messages encoded by the inv(16)(p13q22) and the t(16;16)(p13;q22) in acute myelogenous leukemia Blood, 85 (12): 3695-4397 Strissel PL, Strick R, Tomek RJ, et al (2000) DNA structural properties of AF9 are similar to MLL and could act as recombination hot spots resulting in MLL/AF9 translocations and leukemogenesis Hum Mol Genet, (11): 1671-1679 Tighe JE, Calabi F (1994) Alternative, out-of-frame runt/MTG8 transcripts are encoded by the derivative (8) chromosome in the t(8;21) of acute myeloid leukemia M2 Blood, 84 (7): 2115-2135 Tighe JE, Daga A, Calabi F (1993) Translocation breakpoints are clustered on both chromosome and chromosome 21 in the t(8;21) of acute myeloid leukemia Blood, 81 (3): 592-597 van de Locht L T., Smetsers T F., Wittebol S., et al (1994) Molecular diversity in AML1/ETO fusion transcripts in patients with t(8;21) positive acute myeloid leukaemia Leukemia, (10): 1780-1783 van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al (1999) Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia Leukemia, 13 (12): 1901-1928 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT SỰ MẤT ĐOẠN 13q14 VÀ 17p13 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU MẠN DỊNG LYMPHƠ Trần Thị Trúc Thanh*, Lê Nguyễn Kim Dung*, Phan Thị Xinh** TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát đoạn nhiễm sắc thể (NST) 13q14 17p13 bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn dòng lymphô (BCMDL) Phương pháp: Kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang (FISH) sử dụng để phát bất thường NST Kết quả: Trong ca khảo sát, chúng tơi phát ca có đoạn 13q14 ca có đoạn 17p13 Trong ca vừa có đoạn 13q14, vừa có đoạn 17p13 Kết luận: Kỹ thuật FISH thực tế bào bạch cầu kỳ trung gian có khả phát đoạn NST 13q14 17p13 cách xác nhanh chóng so với kỹ thuật phân tích NST đồ Đây yếu tố tiên lượng quan trọng giúp dự đoán thời gian diễn tiến bệnh thời gian sống tồn bệnh BCMDL Từ khóa: Bạch cầu mạn dòng lymphơ, đoạn 13q14, đoạn 17p13 ABSTRACT DETERMINING THE DELETION OF 13q14 AND 17p13 IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA Tran Thi Truc Thanh, Le Nguyen Kim Dung, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 503 - 506 Objective: To detect the deletion of 13q14 and 17p13 in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) Methods: Florescence in situ hybridiztion (FISH) technique was used to identify these chromosomal abnormalities Results: There are cases which were examined The deletion in chromosome band 13q14 was detected in of cases There is case which has the deletion of both 13q14 and 17p13 Conclusion: In comparision with metaphase karyotyping, the interphase FISH can detect the deletion in chromosome band 13q14 and 17p13 more accurately and quickly These chromosomal abnormalities are significant prognostic factors which are useful for predicting time to progression and overall survival in CLL Keywords: chronic lymphocytic leukemia (CLL), deletion of 13q14, deletion of 17p13 Diễn biến lâm sàng bệnh BCMDL đa ĐẶT VẤN ĐỀ dạng Có BN tử vong vài tháng sau BCMDL đặc trưng tăng sinh tích chẩn đốn, trái lại có bệnh nhân sống đến 20 tụ tế bào lymphô máu, tủy năm hơn(2,7) xương, hạch bạch huyết, lách Bệnh thường Cho đến nay, hệ thống Rai Binet gặp bệnh nhân (BN) có độ tuổi trung sử dụng phương pháp bình 65, có 10 - 15% BN 50 tuổi(7) * Bệnh viện truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS BS Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Email: phanthixinh@yahoo.com 503 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 hữu dụng cho việc phân chia giai đoạn lâm sàng để tiên đoán thời gian sống BN BCMDL(1,6) Tuy nhiên, hầu hết BN lần đầu chẩn đoán bệnh, hệ thống khơng thể tiên đốn nguy tiến triển bệnh thời gian sống cá nhân giai đoạn sớm bệnh (giai đoạn A hệ thống Binet giai đoạn đến hệ thống Rai)(2) Và việc xác định bất thường NST giúp khắc phục hạn chế hai hệ thống Những bất thường NST xem yếu tố tiên lượng độc lập quan trọng điểm cho việc lựa chọn chiến lược điều trị(4) Sự đoạn NST 6q21, 11q22-23, 13q14, 17p13; NST số 3, 8, 12; chuyển đoạn liên quan đến NST 14q32 bất thường thường gặp có ý nghĩa tiên lượng bệnh BCMDL(2,3,5,8) Những bất thường di truyền tế bào phát kỹ thuật phân tích NST đồ kỹ thuật FISH Tuy nhiên, khả phân bào tế bào BCMDL nên dòng tế bào bất thường phát 40% đến 50% tổng số ca BCMDL sử dụng kỹ thuật phân tích NST đồ(5) Vì vậy, kỹ thuật FISH với đoạn dò thiết kế đặc hiệu, khơng đòi hỏi phải thu nhận tế bào phân chia có khả phát bất thường NST đến 80% tổng A số ca BCMDL(5) cách nhanh chóng, xác ngày sử dụng rộng rãi Trong số bất thường NST thường gặp đoạn NST 13q 17p có ý nghĩa tiên lượng đặc biệt Theo nghiên cứu Döhner Hartmut cộng (2000) 325 BN BCMDT, đoạn NST 13q chiếm tỉ lệ cao đến 55%, đoạn 17p chiếm 7%(2) Những BN có bất thường 13q xếp vào nhóm có tiên lượng tốt với thời gian sống trung bình, thời gian sống trung bình khơng điều trị dài tương ứng 133 tháng 92 tháng Trái lại, BN có đoạn 17p lại có tiên lượng so với BN có mang bất thường NST khác với thời gian sống trung bình thời gian sống trung bình khơng điều trị tương ứng 32 tháng tháng(2) Vì vậy, nghiên cứu này, ứng dụng kỹ thuật FISH tập trung khảo sát hai bất thường nhằm hỗ trợ việc phân nhóm tiên lượng sớm xác giai đoạn chẩn đốn qua giúp lựa chọn phát đồ điều trị phù hợp NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu B 13q14 control C 13qter 13qter Hình 1: Cấu trúc đoạn dò kết FISH khảo sát tế bào không phân chia Đoạn dò vùng 13q14 trải dài 220kb gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ, đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm vùng đầu tận (13qter) dùng để kiểm tra diện NST 13 (A) Để phát đoạn 17p13, đoạn dò phát huỳnh quang màu đỏ dài 330 kb phủ toàn gen p53 thiết kế, đoạn dò để kiểm tra diện NST 17 gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm vùng tâm động NST 17 (B) Bình thường quan sát tín hiệu màu xanh tín hiệu màu đỏ tế bào Trong trường hợp đoạn 13q14 xảy ra, quan sát tín hiệu màu đỏ tín hiệu màu xanh tế bào (C) 504 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 - mL tủy xương thu nhận từ BN BCMDL Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) Thành phố Hồ Chí Minh - Đoạn dò Poseidon™ DLEU (13q14) & 13qter Control probe – KBI-10102 (hãng Kreatech) dùng để khảo sát đoạn 13q14 (hình 1A) - Đoạn dò Poseidon™ p53 (17p13) & SE17 Control probe – KBI-10112 (hãng Kreatech) dùng để khảo sát đoạn 17p13 (hình 1B) Phương pháp nghiên cứu - Tiến hành thu nhận tế bào bạch cầu từ mẫu tủy xương phương pháp thu hoạch trực tiếp, cố định tế bào lam - Biến tính lai hóa với đoạn dò đặc hiệu Bước thực máy ThermoBrite hãng Abbott Ủ 37oC 16 đến 18 - Rửa để loại bỏ mẫu dò khơng bắt cặp đặc hiệu dung dịch x SSC / 0,3% NP40, dung dịch x SSC / 0,1% NP-40 - Đọc kết 200 tế bào để tìm bất thường kính hiển vi huỳnh quang KẾT QUẢ Về mặt kỹ thuật, chúng tơi chuẩn hóa kỹ thuật FISH với nhiệt độ thời gian biến tính tối ưu 77oC phút Kết BN trình bày bảng Bảng 1: Kết FISH BN BCMDL STT Năm sinh 1940 1926 1939 1960 1953 Giới tính Nam Nữ X X X X X Tỉ lệ% tế bào dương tính (%) Mất đoạn Mất đoạn 13q14 17p13 18 51,5 0 0 9,5 Trong BN BCMDL phân tích, chúng tơi nhận thấy đa số nam Trong BN có độ tuổi cao 85 tuổi, thấp 51 tuổi Kết khảo sát cho thấy BN khảo sát đoạn 13q14 có đến BN cho kết dương tính (hình 1C); có BN có Chun Đề Truyền Máu Huyết Học Nghiên cứu Y học đoạn 17p13 BN khảo sát Trong đó, BN có đoạn NST 17p13 đồng thời có đoạn NST 13q14 Chỉ có BN khơng tìm thấy đoạn NST 13q14 17p13 BÀN LUẬN Từ năm 2006 kỹ thuật FISH trở thành xét nghiệm thường quy BVTMHH Thành phố Hồ Chí Minh Cho đến nay, sử dụng kỹ thuật FISH để khảo sát 20 bất thường NST thường gặp thể bệnh ung thư máu, có đoạn dò có khả phát bất thường NST thường gặp bệnh BCMDL 13q14, 17p13, 11q23, 3q26, 8q24, t(14;18) Trong thời gian gần đây, bắt đầu triển khai khảo sát đoạn 13q 17p thường quy BN BCMDL BVTMHH Tuy có BN khảo sát, kết cho thấy đoạn 13q thường gặp (3 BN), kết phù hợp với nghiên cứu giới đoạn 13q chiếm tỉ lệ cao số bất thường NST thường gặp bệnh BCMDL(2) Với kỹ thuật FISH, chúng tơi phát 14 tế bào bất thường 200 tế bào (7%) giúp hạn chế bỏ sót dòng tế bào bất thường so với kỹ thuật NST đồ kinh điển (chỉ phân tích 20-30 tế bào phân chia) Đây kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, với trang thiết bị sẵn có chúng tơi khảo sát tất bất thường di truyền bệnh BCMDL, giúp phân nhóm tiên lượng lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho BN BCMDL TÀI LIỆU THAM KHẢO Binet JL, Auquier A, Dighiero G, et al (1981) A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis Cancer, 48: 198-206 Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al (2000) Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia N Engl J Med, 343: 1910-1915 Döhner H, Stilgenbauer S, Döhner K, Bentz M, Lichter P (1999) Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis J Mol Med, 77: 266-346 Juliusson G, Merup M (1998) Cytogenetics in chronic lymphocytic leukemia Semin Oncol, 25: 19-26 505 Nghiên cứu Y học 506 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Juliusson G, Oscier DG, Fitchett M, et al (1990) Prognostic subgroups in B-cell chronic lymphocytic leukemia defined by specific chromosomal abnormalities N Engl J Med, 323: 720-723 Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, et al (1975) Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia Blood, 46: 219-252 Rozman C, Montserrat E (1995) Chronic lymphocytic leukemia N Engl J Med, 333: 1052-1058 Zenz T, Dohner H, Stilgenbauer S (2007) Genetics and riskstratified approach to therapy in chronic lymphocytic leukemia Best Pract Res Clin Haematol, 20: 439-491 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học ... tuổi(7) * Bệnh viện truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS BS Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Email: phanthixinh@yahoo.com... 2010 đến 31 tháng năm 2011 Bệnh nhân chẩn đoán xác định bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, dựa vào huyết đồ, tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế bào Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Tên gen kích thước sản phẩm 5'... nay, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM sử dụng phương pháp RT-PCR để khảo sát tổ hợp gen thường gặp AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 BCCDT lúc chẩn đoán Với phương pháp này, kết xác định