Nội dung bài viết với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I của tổ hợp gen BCR/ABL gây kháng mạnh với imatinib (IM) trên bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT).
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL KHÁNG MẠNH VỚI IMATINIB BẰNG KỸ THUẬT ASO‐PCR TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC Phạm Thị Mỹ Hạnh*, Phan Thị Xinh** TĨM TẮT Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I của tổ hợp gen BCR/ABL gây kháng mạnh với imatinib (IM) trên bệnh nhân (BN) bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT). Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu thực hiện trên 30 mẫu tủy xương của BN BCMDT kháng IM tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng 01/2012 đến 05/2013 có chỉ định tìm đột biến BCR‐ABL kháng IM bằng kỹ thuật giải trình tự DNA. Đồng thời, xây dựng điều kiện kỹ thuật ASO‐PCR với 6 cặp mồi chun biệt của 6 kiểu đột biến và chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho từng cặp mồi để khảo sát đột biến cho 30 mẫu BN trên. Kết quả: Sau khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp cho từng cặp mồi chun biệt, chúng tơi đã xác định được nhiệt độ tối ưu cho phản ứng ASO‐PCR đối với 6 kiểu đột biến gen BCR/ABL kháng mạnh với IM là G250E và Y253H ở 650C, Y253F ở 550C, E255K và E255V ở 680C, và T315I ở 630C. Đồng thời, kết quả khảo sát 6 kiểu đột biến trên 30 BN BCMDT kháng IM bằng kỹ thuật ASO‐PCR phát hiện 17 lượt đột biến trên 15 BN so với 15 lượt đột biến trên 14 BN bằng giải trình tự chuỗi DNA, cho thấy kỹ thuật ASO‐PCR có độ nhạy cao hơn so với giải trình tự chuỗi DNA. Kết luận: Xây dựng thành cơng kỹ thuật ASO‐PCR khảo sát 6 kiểu đột biến thường gặp, kháng mạnh với IM giúp các bác sĩ lâm sàng quyết định hướng điều trị phù hợp cho BN. Ngồi ra, ASO‐PCR là kỹ thuật đơn giản, hiệu quả có thể triển khai rộng rãi ở các Bệnh viện có chun khoa huyết học để chẩn đốn đột biến điểm BCR/ABL đã biết. Từ khóa: bạch cầu mạn dòng tủy, đột biến kháng imatinib, ASO‐PCR. ABSTRACT DETECTION OF BCR/ABL MUTATIONS WHICH STRONGLY RESIST TO IMATINIB USING ASO‐ PCR AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL Pham Thi My Hanh, Phan Thi Xinh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 200 - 204 Objective: Using ASO‐PCR to detect the 6 types (Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I) of BCR/ABL mutation which strongly resist to Imatinib (IM) in chronic myeloid leukemia (CML). Methods: This study was performed in 30 IM‐resistant CML patients which were analyzed BCR/ABL mutations by direct sequencing at Blood transfusion and Hematology hospital from January 2012 to May 2013. ASO‐PCR conditions were established to dectect the 6 types of BCR/ABL mutation strong resistance to IM. Results: By adjusting primer annealing temperature, we determined optimal primer annealing temperature for ASO‐PCR to dectect the 6 types of BCR/ABL mutation (G250E and Y253H at 650C, Y253F at 550C, E255K and E255V at 680C, and T315I at 630C). Concomitantly, the results of detecting the 6 types of BCR/ABL mutation in 30 patients showed that there were 17 mutations in 15 patients by using ASO‐PCR and 15 mutations in 14 patients by using direct sequencing. These results indicate that ASO‐PCR is more sensitive than direct sequencing technique. Conclusion: Successful development of ASO‐PCR procedure for detecting the 6 types of BCR/ABL * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932.728.115 Email: phanthixinh@yahoo.com 200 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học mutation helps the doctors in selecting suitable therapy regiment for patient. Moreover, ASO‐PCR is simple and effective technique which can apply for detecting the known BCR/ABL kinase domain mutations in other hematology hospitals. Keywords: chronic myeloid leukemia, mutations resistance to Imatinib, ASO‐PCR trường hợp mang đột biến kháng mạnh với IM ĐẶT VẤN ĐỀ thường gặp. Khoảng 20% đến 30% bệnh nhân (BN) bạch ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU cầu mạn dòng tủy (BCMDT) được phát hiện kháng imatinib (IM) sau khi điều trị với thuốc Đối tượng nghiên cứu một thời gian. Các cơ chế kháng IM đã được mô Nghiên cứu được tiến hành trên 30 mẫu tủy tả mà nguyên nhân chủ yếu là do những đột xương của BN BCMDT kháng IM tại BV.TMHH biến trên ABL kinase domain (chiếm tới 30 ‐ 90% TP.HCM từ tháng 01/2012 đến 05/2013 có chỉ các BN kháng IM) và tăng biểu hiện do sự định tìm đột biến BCR/ABL kháng IM bằng kỹ khuếch đại của gen BCR/ABL(2,4). Do đó, khảo sát thuật giải trình tự chuỗi DNA. các đột biến vùng kinase trên BCR/ABL là yếu tố Phương pháp nghiên cứu quan trọng giúp quyết định hướng điều trị cho Thiết kế nghiên cứu BN BCMDT kháng IM. Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới. Từ năm 2010 đến năm 2012, tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BV.TMHH) TP.HCM, chúng tơi đã khảo sát 103 BN BCMDT kháng IM bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(3). Kết quả nghiên cứu cho thấy có 46,6% BN mang đột biến, trong đó các kiểu đột biến thường gặp gây kháng mạnh với IM là G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, E279K, T315I (23/103 = 22,3%). Việc phát hiện các đột biến gây kháng mạnh này giúp các bác sĩ quyết định ngừng sử dụng IM và đưa ra lựa chọn điều trị khác thích hợp cho BN. Mặc dù kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phù hợp để khảo sát tất cả các kiểu đột biến BCR/ABL gây kháng IM nhưng đòi hỏi phải có đủ trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, nhân lực được đào tạo tốt có thể phân tích đột biến nên khó triển khai rộng rãi. Trong khi đó, kỹ thuật ASO‐PCR có độ nhạy và tính chun biệt cao, có thể sử dụng để phát hiện nhanh các đột biến đã biết kháng mạnh với IM sử dụng trang thiết bị đơn giản như máy luân nhiệt và kỹ thuật viên có thể thực hiện được nếu quy trình đã được xây dựng tốt. Trong nghiên cứu này chúng tơi xây dựng quy trình ASO‐PCR khảo sát đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I để giúp hoàn thiện kỹ thuật phát hiện nhanh các Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Phương pháp tiến hành Ly trích DNA: Lấy 2 ml tủy xương từ gai chậu hoặc 5 ml máu ngoại biên (nếu số lượng bạch cầu ≥ 20 K/μL) trong chống đơng EDTA. Ly trích DNA từ tủy xương hoặc máu ngoại biên bằng GenElute blood genomic DNA kit (Sigma, Mỹ). Sản phẩm DNA sau ly trích được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm. Thực hiện phản ứng ASO‐PCR: Thành phần phản ứng ASO‐PCR gồm có 1μL (10μM) mồi cho mỗi loại (bảng 1), 0,1μL (5UI / μL) Takara Taq HotStart Polymerase (Takara, Nhật) và 1 μL (100ng) DNA trong 20μL thể tích phản ứng. Tiến hành thử điều kiện của phản ứng PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng từ 55 ~ 680C. Chu kỳ luân nhiệt trên máy Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) bao gồm 940C trong 5 phút; theo sau là 30 chu kỳ của 940C trong 25 giây, 55 ~ 680C trong 25 giây và 720C trong 30 giây. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch 2% có chứa ethidium bromide trong 0,5 x TBE và quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ (Biorad, Mỹ). Chứng dương và chứng âm được chọn từ những mẫu có đột biến và khơng đột 201 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học biến đã khảo sát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. Bảng 1: Các cặp mồi dùng cho ASO‐PCR và kích thước sản phẩm PCR tương ứng Kiểu đột Mồi Mồi xuôi biến ngược G250E Y253H Y253F E255K E255V T315I 250mu 253mu1 253mu2 255mu1 255mu2 315mu 244R 315R Kích thước sản phẩm PCR 208 bp 199 bp 198 bp 194 bp 194 bp 158 bp 560C 600C 550C 650C Nhiệt độ bắt cặp tối ưu 65oC 65oC 55oC 68oC 68oC 63oC KẾT QUẢ Chúng tôi đã tiến hành thử điều kiện phản ứng ASO‐PCR để chọn điều kiện nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu khuếch đại đặc hiệu 6 kiểu đột biến BCR/ABL kháng mạnh với IM. Kết quả thử điều kiện của từng kiểu đột biến được mô tả như sau: Đối với đột biến G250E, chúng tơi khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi ở 560C, 600C và 650C đối với mẫu chứng âm mang đột biến T315I (giếng 1, 4, 7), mẫu mang đột biến G250E (giếng 2, 5, 8) và nước (giếng 3, 6, 8) (hình 1A). Kết quả cho thấy cả 3 điều kiện đều xuất hiện băng đặc hiệu cho đột biến G250E (208 bp) như kết quả của giếng 2, 5, 8 và nước hồn tồn khơng có băng (hình 1A). Giếng 1 và 4 xuất hiện băng mờ khơng đặc hiệu ở 560C và 600C, trong khi đó ở 65oC băng khơng đặc hiệu này biến mất (giếng 7, Hình 1A). Điều kiện tối ưu của phản ứng được kiểm tra trên 3 mẫu chứng dương và lặp lại 2 lần. Đối với đột biến Y253H, chúng tơi khảo sát ở 4 mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C, 620C, 650C và 680C đối với mẫu có đột biến Y253H, mẫu chứng âm mang đột biến Y253F và nước. Kết quả cho thấy ở 650C mẫu có đột biến Y253H xuất hiện băng đậm và rõ nét hơn các điều kiện khác. Ngược lại, với đột biến Y253F chúng tôi khảo sát ở 550C, kết quả cho thấy chỉ có mẫu mang đột biến Y253F mới xuất hiện băng đặc hiệu (198 bp) ở giếng 1, mẫu chứng âm mang đột biến Y253H (giếng 2), mẫu khơng có đột biến (giếng 3) và nước (giếng 4) đều không xuất hiện băng đặc 202 hiệu (hình 1B). Điều kiện tối ưu của Y253H và Y253F được kiểm tra trên 3 mẫu và 2 mẫu chứng dương tương ứng và lặp lại 2 lần. B A Hình 1: ASO‐PCR phát hiện đột biến G250E (A) và Y253F (B) (A): Giếng 1, 4, 7 là mẫu chứng âm có đột biến T315I; giếng 2, 5, 8 là mẫu có đột biến G250E; giếng 3, 6, 8 là nước. (B): Giếng 1 là mẫu có đột biến Y253F; giếng 2 là mẫu chứng âm có đột biến Y253H; giếng 3 là mẫu khơng có đột biến; và giếng 4 là nước. Đối với đột biến E255K, chúng tơi khảo sát 3 mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C, 620C và 680C với mẫu chứng dương có đột biến E255K, chứng âm có đột biến E255V và nước. Kết quả cho thấy ở điều kiện 68oC cho kết quả tối ưu nhất (Hình 2A). Ngược lại, với đột biến E255V chúng tôi khảo sát 4 mốc nhiệt độ bắt cặp là 580C, 600C, 650C và 680C với mẫu chứng dương có đột biến E255V, chứng âm có đột biến E255K và nước, và kết quả cho thấy ở điều kiện 68oC cho kết quả tối ưu nhất (Hình 2B). Điều kiện tối ưu của E255K và E255V được kiểm tra trên 3 mẫu và 1 mẫu chứng dương tương ứng và lặp lại 2 lần. 600C 620C A 680C 58oC 60oC 65oC 68oC B Hình 2: ASO‐PCR phát hiện đột biến E255K (A) và E255V (B) (A): Giếng 1, 4, 7 là mẫu có đột biến E255K; giếng 2, 5, 8 là mẫu chứng âm có đột biến E255V; giếng 3, 6, 8 là nước. (B): Giếng 1, 4, 7 và 10 là mẫu có đột biến E255V; giếng 2, 5, 8 và 11 là mẫu chứng âm có đột biến E255K; giếng 3, 6, 9 và 12 là nước. Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Đối với đột biến T315I, chúng tơi khảo sát ở 3 mốc nhiệt độ bắt cặp mồi là 630C, 640C và 650C, mẫu chứng dương có đột biến T315I (giếng 1, 4, 7), mẫu chứng âm có đột biến G250E (giếng 2, 5, 8) và nước (giếng 3, 6, 9). Kết quả cho thấy ở điều kiện 63oC cho kết quả tối ưu nhất với băng đột biến (158bp) rõ nét nhất (hình 3). Điều kiện tối ưu của phản ứng được kiểm tra trên 3 mẫu chứng dương và lặp lại 2 lần. 63 64 65 Hình 3: ASO‐PCR phát hiện đột biến T315I Giếng 1, 4, 7 là mẫu có đột biến T315I; giếng 2, 5, 8 là mẫu chúng âm có đột biến G250E; giếng 3, 6, 9 là nước. Sau khi chuẩn hóa điều kiện ASO‐PCR thành cơng, chúng tơi khảo sát 6 kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I kháng mạnh với IM trên 30 BN BCMDT kháng IM. Kết quả cho thấy có 17 lượt đột biến của 6 kiểu trên 15 BN (bảng 2). Kiểm tra bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA cho thấy 6 kiểu đột biến trên được phát hiện 15 lượt trên 14 BN, 5 BN có đột biến khác và 11 BN khơng phát hiện đột biến vùng ATP‐binding domain. Bảng 2: Các kiểu đột biến BCR/ABL kháng IM Kiểu đột biến G250E Y253H Y253F E255K E255V T315I Không phát kiểu đột biến Đột biến khác đột biến ASOPCR 3 15 Giải trình tự DNA 3 3 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học Kiểu đột biến Không phát đột biến vùng ATPbinding domain ASOPCR Giải trình tự DNA 11 BÀN LUẬN Khi khảo sát các kiểu đột biến, chúng tôi sử dụng DNA trong phản ứng PCR và thử điều kiện với 2 loại taq polymerase là GoTaq Plexi DNA polymerase (Promega, Hoa Kỳ) và Takara Taq HotStart Polymerase. Kết quả của GoTaq Plexi cho nhiều băng phụ ngoài băng đặc hiệu ở cùng điều kiện nhiệt độ nên Takara Taq HotStart Polymerase được chọn sử dụng trong nghiên cứu này. Với việc thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi cho từng phản ứng PCR, chúng tôi đã xác định được điều kiện nhiệt độ phù hợp cho các phản ứng ASO‐PCR phát 6 kiểu đột biến BCR/ABL kháng mạnh với IM (Bảng 1). Điều kiện phản ứng ASO‐PCR đã xây dựng trong nghiên cứu cho thấy kết quả khảo sát đặc hiệu cho từng kiểu đột biến như tại vị trí Y253 và E255 đều có 2 kiểu đột biến xảy ra là Y253K/Y253F và E255K/E255V, khi khảo sát đột biến Y253F thì Y253K được dùng làm chứng âm nhưng chỉ có mẫu mang đột biến Y253F xuất hiện băng đặc hiệu và ngược lại (Hình 1B), tương tự đối với E255K và E255V (Hình 2). Kết quả khảo sát 30 BN BCMDT kháng IM bằng 2 kỹ thuật ASO‐PCR và giải trình tự chuỗi DNA cho thấy giá trị của ASO‐PCR trong việc tầm sốt các đột biến đã biết. Trong 30 BN được khảo sát, có 15 BN biểu hiện 17 lượt của 6 kiểu đột biến G250E, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315I, cao hơn so với kết quả giải trình tự chuỗi DNA (15 lượt của 14 BN) (Bảng 2). Trong đó, có 2 BN (IAP‐015 và IAP‐025) khơng tìm thấy đột biến Y253H bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nhưng băng đột biến được phát hiện bằng kỹ thuật ASO‐PCR (giếng 3, Hình 4A). Tuy nhiên, kết quả giải trình tự chuỗi DNA của 2 BN trên cũng cho thấy tại vị trí aa253 ngồi sóng T bình thường còn xuất hiện sóng C rất nhỏ gần bằng sóng nền (sóng nhiễu) nên rất khó nhận diện và quyết định là sóng bất thường (Hình 4B), chứng tỏ trên 2 BN này đã xuất hiện dòng tế bào 203 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học mang đột biến Y253H chiếm tỉ lệ thấp hơn nhiều so với dòng tế bào khơng mang đột biến (