Khảo sát đột biến gen FLT3-ITD trên bệnh bạch cầu cấp dòng tủy người lớn tại bệnh viện Truyền máu – Huyết học

Bài viết khảo sát đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD của bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) người lớn dựa trên kích thước đoạn chèn, mức độ biểu hiện đột biến và có kèm đột biến gen NPM1.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6* 2019 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FLT3-ITD TRÊN BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY NGƯỜI LỚN TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU – HUYẾT HỌC Hồ Châu Minh Thư*, Cao Văn Động**, Cao Sỹ Ln**, Đồn Thị Tuyết Thu**, Phù Chí Dũng**,Phan Thị Xinh* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) người lớn dựa kích thước đoạn chèn, mức độ biểu đột biến có kèm đột biến gen NPM1 Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: 36 BN BCCDT người lớn (khơng tính thể M3) chẩn đoán Bệnh viện Truyền Máu-Huyết Học TP.Hồ Chí Minh từ 01/06/2013 đến 28/02/2019 có đột biến gen FLT3-ITD Nghiên cứu mô tả loạt ca Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp (Sanger sequencing) kỹ thuật phân tách đoạn DNA (DNA fragment analysis) để xác định số cặp base (bp) chèn vào gen FLT3 lượng allele mang đột biến gen FLT3-ITD Kết quả: Kết nghiên cứu cho thấy có 17 BN (47,2%) có đặc điểm ≥70bp chèn vào gen FLT3 và/ lượng allele mang đột biến FLT3-ITD ≥50%; đó, trường hợp (22,2%) có số bp chèn vào gen FLT3 ≥ 70 bp 11 trường hợp (30,6%) có lượng allele mang đột biến gen FLT3-ITD ≥50% Tỉ lệ BN có đột biến gen FLT3-ITD kèm không kèm đột biến gen NPM1 52,8% (n=19) 47,2% (n=17) Kết luận: Chúng ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự trực tiếp kết hợp với kỹ thuật phân tách đoạn DNA việc khảo sát đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD, giúp phân nhóm tiên lượng BN BCCDT xác Từ khóa: bạch cầu cấp dòng tủy, FLT3-ITD, kỹ thuật giải trình tự trực tiếp, kỹ thuật phân tách đoạn DNA ABSTRACT ANALYSIS OF FLT3-ITD MUTATION IN ADULT ACUTE MYELOID LEUKEMIA AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL Ho Chau Minh Thu, Cao Van Dong, Cao Sy Luan, Doan Thi Tuyet Thu, Phu Chi Dung, Phan Thi Xinh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 317 - 322 Objectives: To analyse FLT3-ITD mutant level, number, size and interaction with NPM1 mutations in adult patients with acute myeloid leukemia (AML) Subjects: We analysed 36 adult patients with AML (non-APL) who had FLT3-ITD mutation at Blood Transfusion Hematology Hospital from June 1, 2013 to February 28, 2019 Method: Prospective case series We used Sanger sequencing and DNA fragment analysis method for determining ITD length and FLT3-ITD mutant allelic burden Results: There were 17 patients (47.2%) expressing long ITD length (≥70 bp) or high FLT3-ITD mutant allelic burden (≥50%); in there, cases (22.2%) expressing long ITD length, 11 cases (30.6%) expressing high FLT3-ITD mutant allelic burden We also found 19 out of 36 patients (52.8%) had NPM1 mutation and 17 patients (47.2%) did not Conclusion: Analyse FLT3-ITD mutation combining Sanger sequencing and DNA fragment analysis *Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh **Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tác giả liên lạc: TS Cao Sỹ Luân ĐT: 0917 862 262 Email: caosyluan@gmail.com Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học 317 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 was successfully established at our hospital This may help to improve the classification and prognosis in AML patient Key word: acute myeloid leukemia, FLT3-ITD, sanger sequencing, DNA fragment analysis máu – Huyết học TP.Hồ Chí Minh ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) thể bệnh thường gặp thể bạch cầu cấp người lớn Đây bệnh không đồng mặt di truyền học sinh học phân tử, đột biến gen nhiễm sắc thể gây rối loạn tăng trưởng, biệt hóa tế bào tiền thân tạo máu Các bất thường gen kể đến đột biến gen CEBPA, NPM1 đặc biệt gen FLT3 Gen FLT3 nằm nhiễm sắc thể 13, mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase thuộc nhóm III gen thường bị đột biến Hai loại đột biến FLT3 thường gặp bệnh BCCDT tìm thấy bao gồm nhân đoạn nội (FLT3-ITD) chiếm khoảng 30% trường hợp đột biến điểm vùng tyrosine kinase (FLT3-TKD), chiếm khoảng 10%(1,2,9) Trước đây, bệnh nhân (BN) BCCDT có đột biến gen FLT3-ITD xếp vào nhóm tiên lượng xấu(1,2,5,9) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần cho thấy biểu gen FLT3-ITD không giống BN mang đột biến Nói cách khác, đặc điểm lâm sàng, sinh học tiên lượng, dự hậu BN BCCDT có đột biến gen FLT3-ITD phụ thuộc vào khác biệt đặc điểm đột biến, xác định tỉ lệ allele có đột biến khơng có đột biến (alletic ratio) lượng allele có đột biến tổng số allele, chiều dài đoạn chèn đột biến(4,6,8) đột biến khác kèm theo Tuy nhiên, thời điểm nghiên cứu chưa có cơng trình Việt Nam báo cáo việc đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD để hỗ trợ chẩn đoán phân nhóm tiên lượng Nhận thấy cần thiết việc khảo sát đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD BN BCCDT để giúp định hướng phương pháp điều trị, thực đề tài BV.Truyền 318 ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu 36 BN BCCDT người lớn (khơng tính thể M3) chẩn đốn BV Truyền Máu-Huyết Học TP.Hồ Chí Minh từ 01/06/2013 đến 28/02/2019 có đột biến gen FLT3-ITD Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả loạt ca Phương pháp tiến hành nghiên cứu Hình Sơ đồ tiến hành nghiên cứu Ly trích RNA, tổng hợp cDNA Mẫu tủy xương máu ngoại biên lấy chống đông EDTA thời điểm bệnh chẩn đốn Ly trích RNA kit Invitrap Spin Universal RNA Mini kit (Stractec) theo quy trình kỹ thuật nhà sản xuất cung cấp cDNA tổng hợp kit PrimeScript RT Master Mix (Takara) Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp (Sanger sequencing) Phản ứng PCR gen FLT3 thực với hóa chất Takara Mỗi tube PCR (BN/chứng dương/chứng âm) tích 20 l chứa thành phần: DNase-Free Water, PCR Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6* 2019 buffer, dNTPs (250 M cho loại), mồi xuôi 1675F mồi ngược 2728R, Takara TaqTM HotStar Polymerase 1,25unit/μl cDNA Chu kỳ luân nhiệt máy Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life Technologies) bao gồm 98oC phút; theo sau 45 chu kỳ với bước luân nhiệt: 98oC 10 giây, 61oC 20 giây, 72oC 1,5 phút; kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 72oC phút; cuối trì 4oC Hình Quy trình giải trình tự gen FLT3-ITD Điện di sản phẩm PCR thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide quan sát hệ thống chụp ảnh Geldoc-ItTM (UVP) để kiểm tra kết PCR Sản phẩm PCR sau tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) theo hai chiều xuôi ngược (sử dụng mồi PCR) Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hòa tan Hi-Di formamide, biến tính 96oC trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 Nghiên cứu Y học polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems) Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench với trình tự gen FLT3 tham chiếu trình tự chuẩn sở liệu NCBI để xác định kiểu đột biến, bao gồm vị trí đoạn chèn số base (bp) chèn vào gen FLT3 Phương pháp phân tách đoạn DNA (DNA fragment analysis) Sử dụng cDNA mẫu xác định có đột biến gen FLT3-ITD kỹ thuật giải trình tự Các đoạn mồi dùng cho phản ứng PCR khuếch đại gen FLT3 bao gồm mồi xuôi 5’-6FAM/GC AAT TTA GGT ATG AAA GCC AGC-3’ mồi ngược 5’-CTT TCA GCA TTT TGA CGG CAA CC-3’ thiết kế phần mềm Oligo 4.1 Mỗi tube PCR (BN/chứng dương/chứng âm) tích 20 l chứa thành phần: DNase-Free Water, PCR buffer, dNTPs (250 μM cho loại), mồi xuôi, mồi ngược, Takara TaqTM HotStar Polymerase 1,25unit/μl cDNA Chu kỳ luân nhiệt máy Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life Technologies) bao gồm 98oC phút; theo sau 25 chu kỳ với bước luân nhiệt: 98oC 10 giây, 66oC 40 giây, 72oC phút; kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 72oC phút; cuối trì 4oC Sản phẩm PCR pha loãng với Nanopure water theo tỉ lệ 1:10, sau hòa tan với Hi-di formamide, size standard đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Kết phân tích phần mềm Gene scan software (Applied Biosystems) lượng allele mang đột biến gen FLT3-ITD tính theo cơng thức: Trong đó: A: diện tích đường cong mẫu allele mang đột biến Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học B: diện tích đường cong mẫu allele 319 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học bình thường STT Tuổi KẾT QUẢ Từ 01/06/2013 đến 28/02/2019, chúng tơi có 36 BN BCCDT (khơng tính thể M3) phát có đột biến gen FLT3-ITD chọn vào nghiên cứu Chẩn đoán tủy đồ chiếm đa số thể M2 (58,3%), M4 (30,5%) khơng có trường hợp M0, M6 M7 (Bảng 1) Tuổi trung bình 45,3 tuổi (từ 20-68 tuổi) Có 15 BN nam 21 BN nữ Tỉ lệ nam:nữ 1:1,4 (Bảng 2) Bảng Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT có đột biến gen FLT3-ITD chẩn đoán dựa tủy đồ Chẩn đoán M0 M1 M2 M4 M5 M6 M7 Tổng số Số lượng 21 11 0 36 Tỉ lệ 0% 5,6% 58,3% 30,5% 5,6% 0% 0% 100% Bảng Kết đột biến gen FLT3-IT STT Tuổi 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 320 68 44 52 50 42 53 58 39 60 64 48 28 51 48 49 20 48 53 52 59 25 39 44 46 Giới Exon Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nam Nữ 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 15 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 Số bp Lượng FLT3NPM1 chèn ITD 24 19,2% (-) 54 34,8% (-) 39 36,8% (-) 60 42,4% (+) 60 15,1% (+) 45 44,4% (+) 45 39,1% (+) 48 30% (-) 54 41,8% (+) 27 47,8% (+) 81 37,1% (-) 60 46,8% (-) 24 63,4% (-) 15 52,6% (-) 42 51,6% (-) 21 53,7% (+) 21 61,2% (+) 24 100% (+) 63 34,1% (+) 84 43,9% (-) 90 10,8% (-) 90 33,5% (-) 90 53,6% (+) 44,3% (-) 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 57 26 40 28 55 49 35 47 36 27 56 34 Giới Exon Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 Số bp Lượng FLT3NPM1 chèn ITD 57 59,1% (-) 78 20,1% (+) 48 19,2% (-) 24 58,7% (+) 24 41,1% (+) 48 46,2% (+) 36 66% (+) 51 33,7% (-) 84/81 59% (+) 108 38,2% (+) 21 48,2% (-) 57 43,5% (+) Kết Bảng cho thấy tất 36 BN có đột biến lặp đoạn bảo tồn khung đọc, kích thước đoạn lặp thay đổi, ngắn bp (1 acid amin) dài 108 bp (36 acid amin) Số lượng đoạn lặp hầu hết đoạn vị trí đoạn lặp gặp vùng cận màng, chưa phát vị trí khác Hơn nữa, tiến hành so sánh số bp chèn vào gen FLT3 theo kỹ thuật giải trình tự với kỹ thuật phân tách đoạn DNA, kết cho thấy số bp chèn giống kỹ thuật tất 36 BN (Hình 3) Code Sample File Name Allele Size (bp) Height Area 9336 frag_002_F08.fsa 33 239 6171 4131 9336 frag_002_F08.fsa OL 260 5711 4343 Hình So sánh số bp chèn vào gen FLT3 kỹ thuật giải trình tự gen kỹ thuật phân tách đoạn DNA Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6* 2019 Phân tách đoạn DNA kỹ thuật điện di có độ phân giải cao, phân tách đoạn DNA có kích thước bp Trong nghiên cứu này, 01 trường hợp có số bp chèn vào ngắn (Hình 4) phát dễ dàng xác Nghiên cứu Y học đặc điểm số bp chèn vào gen FLT3 ≥ 70bp và/ lượng allele mang đột biến gen FLT3-ITD ≥50%; đó, có BN mang đặc điểm Bảng Đặc điểm đột biến gen FLT3-ITD mẫu khảo sát Đặc điểm < 70bp ≥ 70bp < 50% Lượng allele mang đột biến ≥ 50% Số bp chèn vào gen FLT3 < 70bp lượng allele mang đột biến