Bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận (LDCTTT) thuộc nhóm bệnh di truyền thoái hóa thần kinh, với tần suât mắc bệnh trong khoảng 1/20000 đến 1/50000 trẻ. Nguyên nhân bệnh thường do bởi những đột biến trên gen ABCD1, nằm trên nhiễm sắc thể X mã hóa cho protein ALD, một protein vận chuyển trên màng peroxisome.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ABCD1 TRONG BỆNH LOẠN DƯỠNG CHẤT TRẮNG THƯỢNG THẬN (ADRENOLEUKODYSTROPHY) Nguyễn Thế Vinh*, Hồng Anh Vũ* TĨM TẮT Mở đầu: Bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận (LDCTTT) thuộc nhóm bệnh di truyền thối hóa thần kinh, với tần st mắc bệnh khoảng 1/20000 đến 1/50000 trẻ Nguyên nhân bệnh thường đột biến gen ABCD1, nằm nhiễm sắc thể X mã hóa cho protein ALD, protein vận chuyển màng peroxisome Những đột biến gây tích tụ acid béo bão hòa chuỗi dài ảnh hưởng đến myelin hệ thần kinh trung ương, vỏ thượng thận, tế bào Leydig tinh hồn Sử dụng cơng cụ sinh học phân tử việc chẩn đoán bệnh LDCTTT đưa đánh giá xác, nhanh chóng giúp bệnh nhân nhận chế độ điều trị thích hợp, làm chậm q trình bệnh kéo dài thời gian sống Mục tiêu: Xây dựng quy trình ứng dụng kỹ thuật giải trình tự khảo sát đột biến gen ABCD1 Đối tượng phương pháp: Tiến hành bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng mắc LDCTTT, tách chiết DNA từ máu bệnh nhân thực kỹ thuật giải trình tự gen, phân tích đột biến gen ABCD1 Kết quả: Thiết kế thành cơng cặp mồi quy trình PCR khuếch đại 10 exon gen ABCD1 Phát đột biến dịch khung p.Q472fsX554 Kết luận: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự chẩn đốn đột biến gen ABCD1 Từ khóa: loạn dưỡng chất trắng thượng thận, gen ABCD1, kỹ thuật giải trình tự ABSTRACT DEVELOP A PROTOCOL FOR SCREENING ABCD1 MUTATIONS IN ADRENOLEUKODYSTROPHY Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 376 - 380 Background: Adrenoleukodystrophy is a genetic degenerative disorder of nervous system with an incidence estimated between 1/20000 to 1/50000 children The cause of disease come from the mutations on ABCD1 gene located on X chromosome, that encodes for ALD protein which is transporter protein on peroxisome membrane These mutations lead to the accumulation of very long chain fatty acid that affects the myelin in the central nervous system, the adrenal cortex and the Leydig cells in the testes Using biomolecular engineering in adrenoleukodystrophy prognosis gives results correctly and fast, so the patient would be treated appropriately and disease process could be slowed down Objective: Develop a sequencing protocol for ABCD1 mutations screening Method: Sequence and screen for ABCD1 mutations using DNA from blood of OI patients diagnosed clinically Results: Successfully designed pairs of primer and PCR protocol that amplifies 10 exons of ABCD1 Identified a frameshift mutation p.Q472fsx55 * Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: CN.Nguyễn Thế Vinh Điện thoại: 0935827668 376 Email: vinhnguyen29391@gmail.com Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Conclusion: Our research has developed and applied successfully a sequencing protocol to identify mutations of ABCD1 Keywords: Adrenoleukodystrophy, ABCD1, sequencing béo chuỗi dài không bị phân hủy tích tụ ĐẶT VẤN ĐỀ thể Việc tích tụ gây độc cho tuyến Bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận thượng thận myelin bao quanh dây thần (LDCTTT), tên tiếng anh kinh khắp thể Nhiều nghiên cứu cho Adrenoleukodystrophy, nhóm bệnh di tích tụ acid béo chuỗi dài dẫn đến khởi truyền thối hóa thần kinh mô tả lần đầu phát đáp ứng viêm não, dẫn đến phá hủy vào năm 1913 Schilder(1) Tần suất mắc bệnh myelin, gây triệu chứng LDCTTT(5) LDCTTT khoảng 1/20000 đến 1/50000 Đột biến ABCD1 thường biến trẻ(16) Bệnh ảnh hưởng đến tính ổn định đổi nhỏ gây đột biến sai nghĩa, vô nghĩa, myelin não dây thần kinh ngoại vi một vài acid amin, dịch khung đọc mã, khiếm khuyết trình beta oxi hóa chất béo đột biến vùng cắt nối exon-intron(10) Phổ đột peroxisome Các biểu lâm sàng thường biến ABCD1 trải dài khắp gen, sử gặp rối loạn thị giác, thối hóa thần kinh vận dụng phương pháp giải trình tự Sanger thích động nhận thức, suy chức vỏ thượng hợp cho việc tìm kiếm đột biến gen thận… Bệnh nhân nhập viện với tổn Việc xác định sớm tư vấn di truyền cho thương hệ thần kinh trung ương tiến triển bậc cha mẹ có tiền sử gia đình mắc LDCTTT nhanh có triệu chứng tương tự cần thiết, nhằm dự đốn tình trạng bệnh số rối loạn tâm thần, gây chẩn họ hạn chế biến chứng xảy đoán sai(9) họ mắc LDCTTT Phát tình trạng Ở bệnh nhi, LDCTTT tiến triển nhanh, bệnh sớm đưa biện pháp dẫn đến tình trạng mê dài hạn khoảng chữa trị hợp lý giảm nguy chức năm sau triệu chứng hệ thần kinh phát tuyến thượng thận Nếu đột biến ABCD1 bệnh triển, hình thức khác bệnh nhẹ nhân có tính gia đình, phương pháp xét nghiệm Ba phương pháp điều trị thường sử dụng cho sinh học phân tử đánh giá nguy bệnh nhân LDCTTT: điều chỉnh chế độ ăn uống bệnh người thân họ hàng bệnh nhân mỡ, sử dụng số loại thuốc (Lorenzo(11), Lovastatin(13)…), cấy ghép tế bào gốc(2) ABCD1 nằm NST Xq28, bệnh nhân LDCTTT thường phát đột biến gen ABCD1 thuộc siêu họ protein vận chuyển bám ATP Siêu họ gồm protein màng vận chuyển nhiều loại chất từ vào tế bào, bao gồm nhiều loại sản phẩm biến dưỡng, lipid, sterol thuốc(4) ABCD1 biểu nửa protein vận chuyển peroxisome(14) Sự đột biến gen ABCD1 gây LDCTTT ngăn cản hình thành protein ALD khoảng 75% bệnh nhân mắc hội chứng Ở số bệnh nhân khác việc tạo protein ALD xảy protein khơng có chức Với protein ALD hồn tồn khơng, acid Nội Tiết Hiện chưa thấy có báo cáo Việt Nam nghiên cứu đột biến gen ABCD1 bệnh LDCTTT Ứng dụng phương pháp xét nghiệm gen y sinh học phân tử việc chẩn đoán bệnh LDCTTT, bệnh di truyền khác cho kết xác, nhanh chóng Đồng thời giúp chẩn đốn sớm bệnh bệnh nhi có biểu triệu chứng bệnh chưa rõ ràng, tiềm ứng dụng chẩn đoán tiền sinh ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu genomic DNA thu nhận từ máu bệnh nhân chẩn đoán bệnh loạn dưỡng 377 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học chất trắng thượng thận Mẫu máu bệnh nhân đánh mã số ALD-10 60oC : 20 giây, 72oC : phút 30 giây; với bước 72oC : phút Trữ sản phẩm PCR 4oC Phương pháp nghiên cứu Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose: Trên thạch agarose 2% có nhuộm ethium bromide quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Nghiên cứu thực Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM Mẫu xét nghiệm mẫu máu ly trích DNA giải trình tự DNA tồn 10 exon gen ABCD1 Tinh sản phẩm: Trường hợp có băng phụ xuất hiện, sản phẩm PCR mong muốn cắt từ gel tinh Sản phẩm PCR trực tiếp cắt từ gel sau tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: Tiến hành lấy ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đơng có EDTA, lắc nhẹ nhàng Genomic DNA tách chiết vòng 24 kit illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Giải trình tự phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xi ngược Sản phẩm sau kết tủa ethanol tuyệt đối, lạnh, với hỗ trợ tủa muối NH4OAC, hòa tan Hi-Di formaldehyde, biến tính 96C trước làm lạnh đột ngột 4oC Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Thiết kế mồi cho 10 exon gene ABCD1: Sử dụng phần mềm CLC main workbench tải trình tự gene ABCD1 người từ NCBI (NG_009022.2 ), sau sử dụng cơng cụ thiết kế mồi sẵn có phần mềm để thiết kế mồi PCR cho exon gene ABCD1 Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại toàn chiều dài gen ABCD1: Mỗi tube PCR tích 15 l chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mồi xuôi ngược (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nước cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình luân nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 98oC phút, với 40 chu kỳ lặp lại bước 98oC : 10 giây, Phân tích kết giải trình tự: Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn ABCD1 tham khảo từ ngân hàng trình tự gene website NCBI KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thiết kế mồi trình bày bảng 1: Bảng 1: Trình tự 11 cặp mồi sử dụng khuếch đại 10 exon gen ABCD1 thông số STT 378 Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngược (5’-3’) Kích thước sản Vùng exon phẩm (bp) khuếch đại Tên mồi Trình tự Tên mồi Trình tự ABCD1_1F aggacaggagagccaagttc ABCD1_1R cttagagctgcgatcctagc 1460 ABCD1_1F2 tgtggctcctgcggctgctg ABCD1_1R cttagagctgcgatcctagc 981 ABCD1_2F ccttgagtttgagacctggc ABCD1_2R cacttctccaggcacagata 633 ABCD1_3F gttggtttgtctgtatggtg ABCD1_4R ccttccttcccagacagtag 840 3,4 ABCD1_5F gttcagcttgttggaagacc ABCD1_5R ggtgagagaccaacgtgtct 429 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 STT Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngược (5’-3’) Nghiên cứu Y học Kích thước sản Vùng exon phẩm (bp) khuếch đại Tên mồi Trình tự Tên mồi Trình tự ABCD1_6F ttcagctgtggcagaatagg ABCD1_6R ctgcagaggcccaggaagtg 536 ABCD1_7F atgtggacactgcctgggag ABCD1_7R2 gcctctcccttggcctccag 293 ABCD1_7F atgtggacactgcctgggag ABCD1_7R ggtcactctgctgtgtttgg 1466 ABCD1_8F taaaccgcagggatggattg ABCD1_9R caggcggctgtcatcagcag 974 8,9 10 ABCD1_8F2 ctgtcgtcacagctagctca ABCD1_9R caggcggctgtcatcagcag 564 8,9 11 ABCD1_10F cagcaggcggctgtcatcag ABCD1_10R cctccctccagagactcgag 682 10 Kết PCR: Để giảm chi phí nghiên cứu tiết kiệm thời gian, thiết kế phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ABCD1 có mang nhiều exon nằm gần theo bảng exon gen ABCD1 Đột biến làm lệch khung dịch mã, thay đổi trình tự chuỗi acid amin protein ALD, tạo stop codon vị trí acid amin số 554 Bảng 2: Các phản ứng khuếch đại exon gen ABCD1 Cặp mồi ABCD1_1F/1R ABCD1_2F/2R ABCD1_3F/5R ABCD1_6F/7R ABCD1_8F/10R Genomic Chứng âm Kích thước DNA từ máu (nước cất vùng bệnh nhân lần khử ion) khuếch đại (bp) Phản ứng Phản ứng 1460 Phản ứng Phản ứng 633 Phản ứng Phản ứng 1470 Phản ứng Phản ứng 2172 Phản ứng Phản ứng 10 1633 Hình 2: Kết giải trình tự exon gen ABCD1 bệnh nhân BÀN LUẬN Kết điện di cho thấy phản ứng PCR xảy tốt, băng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu khơng có băng phụ xuất hiện, kết luận mồi thiết kế hoạt động tốt, khuếch đại xác, không tự bắt cặp tạo primer dimer Các giếng chứng âm âm tính cho thấy phản ứng khơng bị ngoại nhiễm, thao tác quy trình thí nghiệm chặt chẽ, chuẩn xác Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR Giếng 1, (mồi ABCD1_1F/1R, 1460bp), giếng 3, 4(mồi ABCD1_2F/2R, 633bp), giếng 5, 6(mồi ABCD1_3F/5R, 1470bp), giếng 7, (mồi ABCD1_6F/7R, 2172bp), giếng 9, 10 (mồi ABCD1_8F/10R, 1633bp) Nhận xét: kết điện di cho thấy giếng số 1, 3, 5, 7, cho sản phẩm có kích thước mong muốn Các giếng chứng âm 2, 4, 6, 8, 10 khơng có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ phản ứng PCR thành công không xảy tượng nhiễm chéo Kết giải trình tự Trên 10 exon khảo sát gen ABCD1 bệnh nhân, phát đột biến đồng hợp tử, nucleotide (c.1415-1416delAG) Nội Tiết Gen ABCD1 có 10 exon, thiết kế 11 cặp mồi gen có số đoạn giàu G/C A/T gây khó khăn cho việc PCR giải trình tự Sanger, số cặp thiết kế dự phòng kết hợp lẫn để tìm cặp mồi tối ưu khuếch đại vùng exon mong muốn Như kết PCR đưa ra, có 10 exon cần phản ứng PCR đủ để khuếch đại tồn Như vậy, so với dự tính thiết kế mồi ban đầu, tiết kiệm tối đa số phản ứng PCR cần thực để khuếch đại toàn 10 exon gen ABCD1, giảm 50% 379 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 lượng hóa chất cơng sức để thực phản ứng PCR Theo số báo cáo giới phát có nhiều đoạn giả gen gen ABCD1 vùng NST khác ( NST – 2p11, NST 10 – 10p11, NST 16 – 16p11 NST 22- 22q11)(15) Những đoạn giả gen mang trình tự giống vùng exon 8, 9, 10 gen ABCD1 lấy từ NCBI với mã tương ứng với đoạn NST 2, 10, 16, 22 sau: U90288, U90289, U90290, U90291(6) Sử dụng trình tự để thiết kế mồi cho exon 8, 9, 10 cho mồi tránh khuếch đại vùng giả gen, làm sai kết chẩn đốn Theo kết giải trình tự Sanger, phát đột biến nucleotide A, G vị trí 17312 17313, đột biến báo cáo nhiều báo giới(3,7,12), thống kê bệnh nhân LDCTTT miền nam Trung Quốc cho thấy đột biến xuất tần suất cao 26%(8) Đột biến gây lệch khung dịch mã, làm thay đổi trình tự chuỗi acid amin protein ALD , tạo stop codon vị trí 554 Sự biến đổi ảnh hưởng đến domain protein domain vận chuyển acid béo chuỗi dài, domain ATPase làm chức protein KẾT LUẬN Nghiên cứu thiết lập thành công quy trình phát đột biến 10 exon gen ABCD1 phương pháp giải trình tự chuỗi Sanger Điều có ý nghĩa quan trọng việc chẩn đốn sớm để đưa phương pháp trị liệu thích hợp cho bệnh nhân, giảm thiểu hậu xấu bệnh gây TÀI LIỆU THAM KHẢO Benke PJ, Reyes PF, Parker Jr JC (1981) New form of adrenoleukodystrophy Human genetics, 58(2):204-208 Cartier N, Aubourg P (2010) Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy Brain Pathology, 20(4):857862 Chiu HC, Liang JS, Wang JS, Lu JF (2006) Mutational analyses of Taiwanese kindred with X-linked adrenoleukodystrophy Pediatric neurology, 35(4):250-256 380 Dean M, Hamon Y, Chimini G (2001) The human ATPbinding cassette (ABC) transporter superfamily Journal of lipid research, 42(7):1007-1017 Dumser M, Bauer J, Lassmann H, Berger J, Forss-Petter S (2007) Lack of adrenoleukodystrophy protein enhances oligodendrocyte disturbance and microglia activation in mice with combined Abcd1/Mag deficiency Acta neuropathologica, 114(6):573-586 Eichler EE, Budarf ML, Rocchi M, Deaven LL, Doggett NA, Baldini A, Nelson DL, Mohrenweiser HW (1997) Interchromosomal duplications of the adrenoleukodystrophy locus: a phenomenon of pericentromeric plasticity Human molecular genetics, 6(7):991-1002 Finsterer J, Lässer S, Stöphasius E (2013) Dementia from the ABCD1 mutation c 1415-1416delAG in a female carrier Gene, 530(1):155-157 Jiang MY, Cai YN, Liang CL, Peng MZ, Sheng HY, Fan LP, Lin RZ, Jiang H, Huang Y, Liu L (2015) Clinical, biochemical, neuroimaging and molecular findings of X-linked Adrenoleukodystrophy patients in South China Metabolic brain disease, 30(6):1439-1444 Kitchin W, Cohen-Cole SA, Mickel SF (1987) Adrenoleukodystrophy: frequency of presentation as a psychiatric disorder Biological psychiatry, 22(11):1375-1387 10 Ligtenberg M, Kemp S, Sarde CO, van Geel BM, Kleijer WJ, Barth PG, Mandel JL, van Oost BA, Bolhuis PA (1995) Spectrum of mutations in the gene encoding the adrenoleukodystrophy protein American journal of human genetics, 56(1):44 11 Moser HW, Moser AB, Hollandsworth K, Brereton NH, Raymond GV (2007) “Lorenzo’s Oil” Therapy for X-linked Adrenoleukodystrophy: Rationale and Current Assessment of Efficacy Journal of Molecular Neuroscience, 33(1):105-113 12 Niu YF, Ni W, Wu ZY (2013) ABCD1 mutations and phenotype distribution in Chinese patients with X-linked adrenoleukodystrophy Gene, 522(1):117-120 13 Pai GS, Khan M, Barbosa E, Key LL, Craver JR, Curé JK, Betros R, Singh I (2000) Lovastatin therapy for X-linked adrenoleukodystrophy: clinical and biochemical observations on 12 patients Molecular genetics and metabolism, 69(4):312322 14 Shani N, Valle D (1996) A Saccharomyces cerevisiae homolog of the human adrenoleukodystrophy transporter is a heterodimer of two half ATP-binding cassette transporters Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(21):1190111906 15 Smith KD, Kemp S, Braiterman LT, Lu JF, Wei HM, Geraghty M, Stetten G, Bergin JS, Pevsner J, Watkins PA (1999) X-linked adrenoleukodystrophy: genes, mutations, and phenotypes Neurochemical research, 24(4):521-535 16 Takemoto Y, Suzuki Y, Tamakoshi A, Onodera O, Tsuji S, Hashimoto T, Shimozawa N, Orii T, Kondo N P(2002) Epidemiology of X-linked adrenoleukodystrophy in Japan Journal of human genetics, 47(11):0590-0593 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 20/11/2015 30/11/2015 15/02/2016 Chuyên Đề Nội Khoa I ... of ABCD1 Keywords: Adrenoleukodystrophy, ABCD1, sequencing béo chuỗi dài khơng bị phân hủy tích tụ ĐẶT VẤN ĐỀ thể Việc tích tụ gây độc cho tuyến Bệnh loạn dưỡng chất trắng thượng thận thượng thận. .. nhiễm chéo Kết giải trình tự Trên 10 exon khảo sát gen ABCD1 bệnh nhân, phát đột biến đồng hợp tử, nucleotide (c.1415-1416delAG) Nội Tiết Gen ABCD1 có 10 exon, thiết kế 11 cặp mồi gen có số đoạn giàu... với trình tự chuẩn ABCD1 tham khảo từ ngân hàng trình tự gene website NCBI KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thiết kế mồi trình bày bảng 1: Bảng 1: Trình tự 11 cặp mồi sử dụng khuếch đại 10 exon gen ABCD1