Bài viết trình bày quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ PHÂN TÁN NHIỄM SẮC CHẤT CỦA TINH TRÙNG (SPERM CHROMATIN DISPERSION - SCD) DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG NGƯỜI Nguyễn Trương Thái Hà*, Nguyễn Thị Thúy An*, Mã Phạm Quế Mai*, Phạm Nguyễn Thảo Trang*, Hồ Mạnh Tường* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng Đối tượng: 70 mẫu tinh dịch tình nguyện viên nam tuổi từ 18 - 40 Phương pháp nghiên cứu: Các bước xây dựng quy trình gồm khảo sát: mật độ tinh trùng làm tiêu bản, thành phần dung dịch ly giải, thời gian ly giải điều kiện biến tính trước ly giải Mẫu tinh dịch xử lý H2O2 2% làm chứng dương Hiệu quy trình đối chứng với kết từ thuốc thử Halosperm® G2 Kết quả: Quy trình khảo sát phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD) thực với mật độ tinh trùng dùng làm tiêu 106 tinh trùng/ml, sử dụng dung dịch biến tính HCl 0.08N, dung dịch ly giải gồm Tris 0.4M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5M, SDS 1%, EDTA 50mM, pH 7.5, thuốc nhuộm DAPI 2µg/ml Hiệu quy trình cho kết tương quan dương mạnh (r = 0.97, p < 0.01) chạy thống kê SPSS ver.16 với thuốc thử thương mại Halosperm® Kết luận: Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực ngắn, có tiềm ứng dụng chẩn đốn điều trị vơ sinh nam mở hướng nghiên cứu phân mảnh DNA tinh trùng Việt Nam Từ khóa: Halosperm, hỗ trợ sinh sản, SCD, phân mảnh DNA tinh trùng, vô sinh nam SUMMARY ESTABLISHING THE PROCEDURE SPERM CHROMATIN DISPERSION (SCD) FOR DETERMINATION OF HUMAN SPERM DNA FRAGMENTATION Nguyen Truong Thai Ha, Nguyen Thi Thuy An, Ma Pham Que Mai, Pham Nguyen Thao Trang, Ho Manh Tuong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No - 2016: 82 - 87 Objective: Establish the procedure for determination of human sperm DNA fragmentation Subjects: 70 semens from male volunteers in ages 18 - 40 Methods: The experiments were surveyed such as the optimal semen dilution for templates, semen dilution, the concentration of the components in the lysis solution and conditions for human sperm DNA treatment The H2O2 2% treated semen was used as positive control In addition, DFI was evaluated by both of the established procedure and the halo sperm G2 kit in order to assess correlation between two methods Result: It is shown that the optimal sperm concentration is 106 sperm/ml Samples should be treated in the denaturing solution HCl 0.08N before using lysis solution (Tris 0.4 M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5 M, SDS %, EDTA 50 mM, pH 7.5) Sperm DNA was stained by fluorescence dye DAPI µg/ml And DFI can be analyzed on fluorescence microscopy at 40X The strong positive correlation was observed to both of the improved SCD test and Halosperm kit (r=0.97, P50% nhóm DFI Ở nồng độ 0.4 mM ly giải 0.6 mM kết DFI mẫu tương đương với Khảo sát nồng độ DTT tối ưu 0.2 mM, 0.4 Halosperm nhóm DFI Chọn nồng độ DTT mM, 0.6 mM, 0.8 Mm 0.4 mM để tiết kiệm hóa chất Xét chứng dương: nồng độ 0.2 mM, 0.4 Khảo sát nồng độ NaCl tối ưu 1M, 1.5M, 2M mM 0.6 mM mẫu cho kết DFI Xét chứng dương: ba nồng độ tất 100%, nồng độ 0.8mM mẫu bị âm tính giả mẫu cho kết DFI 100% Xét kết cho kết DFI < 50% Xét kết DFI DFI mẫu: nồng độ NaCl M kết mẫu: nồng độ 0.2 mM kết từ quy 85 Nghiên cứu Y học từ quy trình SCD mẫu bị dương tính giả, tỷ lệ DFI >50% nhóm DFI, nồng độ 1.5 M M mẫu cho kết tương đương quy trình SCD Haosperm Để tiết kiệm hóa chất chọn nồng độ NaCl tối ưu 1.5 M Cải tiến dung dịch ly giải Xét chứng dương: nghiệm thức cho kết DFI 100% Xét kết DFI mẫu: mẫu sử dụng L1 L2 nhận thấy mẫu khơng ly giải, 100% tinh trùng khơng có halo, hình thái đầu khơng nở to Mẫu ly giải L1L2 L2DTT 30 phút cho kết DFI tương đương Halosperm Vậy dung dịch L2DTT có tác dụng tương tự với việc sử dụng dung dịch ly giải, xét mặt hóa chất thao tác tiện lợi nên sử dụng dung dịch ly giải kết hợp cho bước thí nghiệm Kiểm tra thời gian ly giải mẫu dung dịch L2DTT Xét chứng dương: thời gian, tất mẫu cho kết DFI 100% Xét kết DFI mẫu: mẫu thực ly giải với dung dịch L2DTT 30 phút 20 phút cho kết DFI tương đương với thuốc thử Halosperm®, để tiết kiệm thời gian thực chọn thời gian ngâm ly giải 20 phút Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 37oC trộn nhỏ tồn lên lam kính, đậy phiến kính 24 x 60 mm lên để gel dàn Đặt lam mẫu vào tủ 4oC phút Tháo bỏ phiến kính Ngâm lam mẫu vào dung dịch HCl 0,08N, phút nhiệt độ phòng Chuyển lam mẫu ngâm vào dung dịch ly giải cải tiến, thành phần: Tris 0.4 M, DTT 0.4 mM, NaCl 1.5 M, SDS 1%, EDTA 50 mM, pH 7.5, 20 phút 22oC Rửa lam mẫu TBE 1X phút Lần lượt rửa lam mẫu EtOH 70%, 90% 100% phút/lần rửa Để lam kính mẫu khơ hồn tồn nhiệt độ phòng, trải 100 µl thuốc nhuộm DAPI µg/ml lên lam mẫu, ủ tối 20 phút Lắc rửa lam kính mẫu TBE 1X, để khô tự nhiên khoảng 20 phút tối Phân tích tối thiểu 200 tế bào lam mẫu kính hiển vi huỳnh quang vật kính 40X, tính DFI theo cơng thức Kiểm tra hiệu quy trình SCD xây dựng Đánh giá tương quan kết DFI quy trình SCD thuốc thử Halosperm® cho kết tương quan dương mạnh có ý nghĩa thống kê với r = 0.97, p < 0.001 (Biểu đồ 1) Khảo sát điều kiện biến tính trước ly giải Xét chứng dương: mẫu khơng xử lý biến tính ngâm HCl 0.08 N phút có xử lý biến tính cho kết DFI 100% Xét kết DFI mẫu: mẫu khơng xử lý biến tính bị dương tính giả cho DFI 100%, mẫu xử lý biến tính cho kết DFI tương đương với thuốc thử Halosperm® Cần xử lý biến tính tinh trùng trước ly giải để biến tính DNA tinh trùng, bộc lộ đứt gãy Quy trình SCD cải tiến Phủ lớp gel LMA 1% mỏng lên bề mặt lam kính, để khơ nhiệt độ phòng Pha lỗng mẫu tinh dịch phosphate buffered saline - PBS đến mật độ 106 tinh trùng/ml Cho 25 µl tinh dịch pha lỗng vào 50µl gel LMA 1% 86 Biểu đồ Mối tương quan số DFI quy trình SCD cải tiến thuốc thử Halosperm KẾT LUẬN Nhóm nghiên cứu phân mảnh tinh trùng thuộc trung tâm Nghiên cứu Di truyền Sức khỏe Sinh sản (CGRH) thành cơng việc xây dựng quy trình SCD chẩn đốn phân mảnh DNA tinh trùng người Với ưu điểm Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 thao tác đơn giản, thời gian thực ngắn, chi phí hóa chất thấp (chỉ khoảng 1/5 so với giá thành nhập thuốc thử Halosperm), lại cho hiệu tương đương, quy trình SCD có tiềm trở thành xét nghiệm thường quy giúp đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng, với tinh dịch đồ góp phần chẩn đốn điều trị hiệu cho bệnh nhân vô sinh nam Bên cạnh đó, Việt Nam, nghiên cứu phân mảnh DNA tinh trùng chưa có nhiều cơng bố Do đó, với quy trình SCD cải tiến chúng tơi mở thêm nhiều hướng nghiên cứu phân mảnh DNA tinh trùng ứng dụng vào kỹ thuật hỗ trợ sinh sản nước IUI, ICSI hay trữ lạnh, tìm mối tương quan phân mảnh với tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt, tỷ lệ sinh sống … góp phần nâng cao tỷ lệ thành cơng chu trình hỗ trợ sinh sản cho bệnh nhân vô sinh muộn Lời cảm ơn: Chân thành cám ơn ThS BS Hồ Mạnh Tường tạo điều kiện tìm nguồn tài trợ kinh phí cho việc thực nghiên cứu Cảm ơn anh chị em Trung tâm Nghiên cứu Di truyền Sức khỏe Sinh sản hỗ trợ thời gian, thiết bị để nghiên cứu hoàn thành Cám ơn anh chị kỹ thuật viên hỗ trợ sinh sản bệnh viện Vạn Hạnh, Mỹ Đức, An Sinh đóng góp ý kiến chun mơn lĩnh vực hỗ trợ sinh sản Cảm ơn bạn tình nguyện viên sẵn sàng tham gia cung cấp nguồn mẫu cho nghiên cứu Và cuối cảm ơn chị Mai, chị An, bé Trang bỏ nhiều thời gian, công sức thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Agarwal A, Saleh RA (2002) Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and treatment Urol Clin North Am, 29: 817-27 Agarwal A, Tsarev I, Erenpresis J, Sharma R (2012) Sperm chromatin assessment Textbook of Assisted Reproductive Techniques Volume 1: Laboratory Perspectives, 4th edition, 75-95 Enciso M, Sarasa J, Agarwal A, Fernandez JL, Gosalvez J (2009) A two-tailed Comet assay for assessing DNA damage in spermatozoa Reprod Biomed Online, 18: 609-16 Erenpresis J, Spano M, Erenpreisa J, Bungum M, Giwercman A (2006) Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects Asian J Androl, 8: 11-29 Nghiên cứu Y học 10 11 12 13 14 15 16 17 Evenson Donald, Lorna Jost (2000) Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment Methods in Cell Science, 22: 169 – 189 Fernández JL, Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosálvez J, Enciso M, LaFromboise M, De Jonge C (2005) Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test Fertil Steril, 84: 833-842 Fernández JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R, Alvarez JG (2003) The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation J Androl, 24: 59–66 García-Peiró A, Martínez-Heredia J, Oliver-Bonet M, Abad C, Amengual MJ, Navarro J, Jones C, Coward K, Gosálvez J, Benet J (2011) Protamine to protamine ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm Fertil Steril, 95: 105–109 Gosalvez B, Fernandez JL, Goyanes V (2006) A method for determination of DNA fragmentation in animal sperm cell European patent application, EP1710320A1: 1–30 Gutiérrez R, Bécquer P, Pandolfi A, Cuevillas G, Pupo J, Hernández EW, Riverón G, Pereira N, Cuétara E (2007) DNA damage measurement using a modified protocol of sperm chromatin dispersion test Pharmacologyonline, 1: 1419 Kazim RC, Jeanine TG, Marie L, Christopher JDJ, Douglas TC (2006) Comparison of Chromatin Assays for DNA Fragmentation Evaluation in Human Sperm Journal of Andrology, 27: 1, 53 – 59 Li-hong Z,Yi Q,Ke-hua W,Qiuju W, Guozhen T, Lei-guang W (2010) Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy: comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nickend labeling assay Fertility and Sterility, 94: 3, 1027 – 1032 Manicardi GC, Bianchi PG, Pantano S, Azzoni P, Bizzaro D, Bianchi U (1995) Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility Biol Reprod, 52: 864 - Ribas – Maynou, Garcia, Abad (2012) Alkaline and neutral comet assay profiles of sperm DNA damage in clinical groups Hum Reprod, 27(3): 652 - Schoor RA (2002) Prostatitis and male infertility: evidence and links Curr Urol Rep, 3(4): 324 - 329 Tomlinson MJ, White A, Barratt CLR, Bolton AE, Cooke ID (1992) The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes Hum Repord, 7(4): 517 - 522 Zini A, Kamal K, Phang D, Willis J, Jarvi K (2001a) Biologic variability of sperm DNA denaturation in infertile men Urology, 58, 258 - 261 Ngày nhận báo: 02/09/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 05/09/2016 Ngày báo đăng: 10/10/2016 87 ... (hình 1-5a, b) Trong đó, trường hợp 1, tinh trùng không bị phân mảnh DNA trường hợp 3, 4, tinh trùng bị phân mảnh DNA Chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng (DNA Fragmentation Index – DFI) xác định... (Số tinh trùng bị phân mảnh DNA/ tổng số tinh trùng đếm được) x 100% Ngoài điều kiện khảo sát, bước tiến hành thực theo quy trình tham khảo Mẫu tinh dịch tươi xử lý H2O2 2%, ủ tối 10 phút dùng. .. hiệu quy trình cải tiến Thực đánh giá tương quan theo ý nghĩa thống kê tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng – DFI xác định quy trình SCD cải tiến thuốc thử thương mại Halosperm® G2 cỡ mẫu 50 mẫu tinh