Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng và chẩn hóa quy trình xét nghiệm xác định đột biến gen F8 gây bệnh hemophila A bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN YẾU TỐ VIII GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Nguyễn Ngọc Minh*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Thị Băng Sương* TĨM TẮT Mở đầu: Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hay bất thường chức năng của yếu tố đơng máu VIII. Đây là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nên bệnh gặp chủ yếu ở nam giới và nữ giới là người mang gen bệnh. Biểu hiện bệnh trên lâm sàng chủ yếu là chảy máu, mức độ chảy máu có thể là nhẹ, trung bình hoặc nặng tùy thuộc vào nồng độ của yếu tố VIII trong huyết tương. Chẩn đốn chính xác và điều trị sớm căn bệnh này có một ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh nhân trở thành tàn tật. Tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay cho phép phân tích DNA để phát hiện những tổn thương gen gây ra bệnh hemophilia A, phát hiện người lành mang gen bệnh và ứng dụng trong chẩn đốn trước sinh cũng như tư vấn di truyền. Mục tiêu: Xây dựng và chẩn hóa quy trình xét nghiệm xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophila A bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen. Đối tượng và phương pháp: Phân tích đột biến gen F8 ở hai bệnh nhân nam mắc bệnh Hemophilia A ở thể nặng đã được chẩn đốn trên lâm sàng. DNA từ máu ngoại vi của bệnh nhân sau khi tách chiết được dùng làm khn cho phản ứng PCR với 33 cặp mồi nhằm khuếch đại tồn bộ 26 exon và vùng nối intron – exon của gen F8. Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự và phân tích kết quả bằng phần mềm chun dụng nhằm xác định các đột biến gây bệnh. Kết quả: Trong hai bệnh nhân nam tham gia vào nghiên cứu, một bệnh nhân được xác định mang đột biến dịch khung do mất 4 nucleotid ở exon 14. Bệnh nhân còn lại mang đột biến thay thế nucleotide T bằng A cũng trên exon 14, đột biến này tạo ra một stop codon làm ngừng q trình phiên mã ngay tại vị trí đột biến. Kết luận: Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã thiết kế 33 cặp mồi và chẩn hóa thành cơng quy trình phản ứng PCR và giải trình tự các vùng mã hóa của gen F8. Với quy trình này, chúng tơi cũng xác định được đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A trên hai bệnh nhân nam. Trong hai đột biến được xác định, một đột biến vơ nghĩa chưa từng được cơng bố trên các cơ sở dữ liệu về Hemophilia A. Từ khoá: Hemophilia A, gen yếu tố 8, đột biến. ABSTRACT ESTABLISH PROTOCOL FOR DIAGNOSIS OF MUTATION IN FACTOR VIII ENCODING GENE CAUSING HEMOPHILIA A Nguyen Ngoc Minh, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 18‐ 23 Introduction: Hemophilia A is an X‐linked congenital bleeding disorder caused by Factor VIII deficiency. Different mutations including point mutations, deletions, insertions and inversions have been reported in the FVIII gene, which cause hemophilia A. Objectives: Establish a standard protocol to diagnose and identify genetic mutations that cause Hemophilia A disorder by PCR and Sequencing methods. * Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0914007038, Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Email: suongnguyenmd@gmail.com. 19 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Methods: Two male patients’ peripheral blood samples were collected to conduct the research. These patients have severe Hemophilia A symptoms. DNA from blood samples were extracted using Quiagen Kit and performed PCR with 33 pair of primers in order to amplify 26 exons with exon‐intron boundaries regions. The PCR‐ amplified fragments were then subjected to Sequencing analysis. Results: In the current study, with the use of PCR and sequencing analysis, we identified a 4‐nt deletion mutant occurring in exon 14 of the FVIII gene and a nonsense mutant caused by a substitution of A for T in exon 14. This mutation that cause a premature stop‐codon at 732 has not previously been reported in the F8 Hemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) database. Conclusion: We have successfully designed the primer set for amplification the whole functional FVIII gene and standardized the diagnostic protocol for FVIII gene mutant. In addition, we detected a nonsense mutant that has not been report before on the HAMSTeRS database. Keywords: Factor VIII, Hemophilia A, deletion, frame shift, nonsense mutants. do chấn thương dù rất nhẹ và khó cầm máu. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện tượng chảy máu khớp kéo dài và tái phát Bệnh ưa chảy máu Hemophilia A là bệnh di nhiều lần có thể dẫn tới biến chứng teo khớp, teo truyền lặn liên kết NST X gây ra do đột biến gen cơ, lâu dần làm mất chức năng vận động. Bệnh yếu tố VIII (F8) ‐ gen chịu trách nhiệm tổng hợp nhân cần được chẩn đốn bệnh càng sớm càng protein FVIII tham gia vào con đường đơng máu tốt và được điều trị bằng cách truyền chế phẩm nội sinh(4). Do khơng có cặp gen tương đồng trên máu. NST Y nên người nam dễ mắc bệnh hơn người Bản đồ của gen F8 được cơng bố vào năm nữ do chỉ cần mang một gen đột biến là biểu 1984, gen nằm trên cánh dài của NST X (Xq28). hiện bệnh. Người nữ dị hợp sẽ khơng có biểu Gen F8 gồm 26 exons có chiều dài 186 kb, mã hiện bệnh nhưng khả năng di truyền gen bệnh hóa cho protein FVIII gồm 2332 acid amin(5). Có cho thế hệ sau, đặc biệt là cho con trai, rất cao. rất nhiều đột biến gen F8 đã được xác định, phổ Trong các bệnh rối loạn đơng máu, Hemophilia biến là đột biến đảo đoạn intron 22 gây ra 40‐ A là bệnh phổ biến nhất với tỷ lệ ước tính 50% ca bệnh Hemophilia A thể nặng và đột biến khoảng 1/5000 tới 1/10000 nam giới(8). đảo đoạn intron 1 gây ra 5‐7% ca bệnh thể Thể bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào số nặng(11). Những trường hợp còn lạn cho bệnh nhân và gia đình và khơng kiểm sốt được sự lan truyền gen bệnh trong cộng đồng. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình giải trình tự chẩn đốn đột biến điểm của gen yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A”. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Hai mẫu máu ngoại vi của hai bệnh nhân nam đã được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh Hemophilia A. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Sử dụng phần mềm chuyên dụng thiết kế 33 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại tồn bộ 26 exon, các vùng lân cận vị trí nối intron của gen yếu tố 8. Các cặp mồi được thiết kế khơng có hiện tượng SNP (single nucleotide polymorphism) và có nhiệt độ gắn mồi xấp xỉ nhau. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân. Máu tươi được chống đông bằng EDTA, được tách chiết DNA trong vòng 24 giờ. Quy trình tách chiết DNA từ 200μl máu ngoại vi được tiến hành theo QiAgen Kit. Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA, những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 mới được sử dụng làm khn để tiến hành phản ứng PCR và giải trình tự gen. Kỹ thuật giải trình tự gen Tiến hành các phản ứng PCR khuếch đại tồn bộ 26 exon và các vị trí nối intron‐ exon của gen F8. Thành phần của phản ứng PCR gồm 50μl chứa các thành phần: 200‐300 ng khuôn mẫu DNA’ 0.2 mmol.l dNTP; 20 mmol/l Tris‐ HCl (pH 8.4); 125 ng mỗi mồi và 2 đơn vị Taq polymerase. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự từng đoạn gen được khuếch đại bằng cả mồi xi và mồi ngược. Phân tích kết quả giải trình tự Xác định đột biến, kiểm tra khả năng gây bệnh của các đột biến bằng những phần mềm chun dụng. Hình 1 là kết quả giải trình tự exon 14 bằng mồi xi của bệnh nhân 01 cho thấy gen F8 của bệnh nhân này bị đột biến mất 4 nucleotid TAGA, tại vị trí c.4121‐4124del, đột biến gây lệch khung dịch mã (frameshift) và làm thay đổi cấu trúc protein F8: pIle1374thrfs*49. Kết quả giải trình tự exon 14 bằng mồi ngược khẳng định lại đột biến này. Đột biến này đã được Lin cơng bố lần đầu tiên vào năm 1993 trên tạp chí Genomics(10). Kết quả giải trình tự gen F8 của bệnh nhân 02 cho thấy bệnh nhân mang đột biến thay thế T bằng A tại codon 732 trên exon 14 (Hình 2). Codon bình thường trên Genbank là TAT mã hóa cho acid amin Tyrosine bị đột biến thành trình tự TAA, đột biến thay nucleotit này đã tạo thành stop codon, làm kết thúc q trình phiên mã ngay tại vị trí đột biến. 21 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 KẾT QUẢ Bệnh nhân 01 Hình 1: Kết quả giải trình tự exon 14 của bệnh nhân 01. Bệnh nhân 02 Hình 2: Kết quả giải trình tự gen F8 của bệnh nhân HA 02. (1958 bp). Trong một nghiên cứu thống kê dữ BÀN LUẬN liệu đột biến 845 gia đình có người nhà là bệnh Hemophilia A là bệnh chảy máu do thiếu nhân hemophilia A, Oldenburg và cộng sự đã yếu tố đơng máu VIII. Bệnh có tính chất di chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X. nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vơ nghĩa) Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII (FVIII) là một chiếm tỉ lệ cao nhất (47,5%) tiếp đến là dạng đột trong những gen lớn với 26 exon trong đó 2 biến đảo đoạn bao gồm đảo đoạn intron 1và exon lớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 22 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 intron 22 (36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10‐15%(12). Tùy thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng nhẹ khác nhau. Việc xác định các đột biến gây bệnh Hemophilia khơng dễ dàng vì các đột biến phần lớn là đột biến điểm nằm rải rác trên suốt chiều dài của gen F8. Do đó, trong các kỹ thuật xác định đột biến gen F8, phương pháp giải trình tự gen thường được sử dụng hơn cả. Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 26 exon của gen F8 trên hai bệnh nhân mắc bệnh Hemophilia A. Ở bệnh nhân thứ nhất, chúng tôi xác định được đột biến mất 4 nucleotid tại codon 1355 trên exon 14 của bệnh nhân này. Mất nucleotide hay mất đoạn trên vùng mã hóa của gen thường gây đột biến dịch khung và một nửa các đột biến này thường xảy ra trên exon lớn là exon 14. Hầu hết các đột biến mất nucleotid trên gen F8 thường làm giảm nồng độ và hoạt tính của protein FVIII và do đó, gây ra bệnh Hemophilia A(6). Bệnh nhân 01 mang đột biến này có biểu hiện bệnh thể nặng trên lâm sàng với nồng độ protein FVIII dưới 1%. Trong 5 trường hợp mang đột biến này đã được công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế, 4 trường hợp đều biểu hiện bệnh ở thể nặng, chỉ có 1 trường hợp biểu hiện ở thể trung bình với nồng độ protein FVIII là 2% công bố vào năm 2010 bởi Abdul‐Ghafar và cộng sự(1). Kết quả giải trình tự gen FVIII của bệnh nhân 02 cho thấy có xuất hiện đột biến thay thế nucleotide T bằng A tại vị trí codon 732 trên exon 14. Đột biến này làm thay đổi trình tự codon TAT mã hóa cho acid amin Tyrosine thành TAA, tạo ra stop codon ngay tại vị trí này. Sự thay đổi này làm cho protein FVIII không được tổng hợp hoàn chỉnh mà chỉ tổng hợp được 732 acid amin. Protein yếu tố VIII chứa 2332 acid amin sắp xếp thành 6 vùng là A1‐A2‐B‐A3‐C1‐C2(7) (Hình 3). Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học Hình 3: Trình tự mã hóa các vùng của protein FVIII trên gen. Protein yếu tố VIII lưu thông trong máu gồm hai chuỗi polypeptide: một chuỗi nhẹ với trọng lượng phân tử 80.000 Da và một chuỗi nặng có trọng lượng phân tử là 200.000 Da. Chuỗi nặng bao gồm tiểu phần A1 (từ codon 1‐ 336), vùng mang tính acid a1 (từ codon 337‐372), vùng A2 (từ codon 373‐710) và vùng mang tính acid a2 (từ codon 711‐740). Vùng A3 (từ codon 1690‐2019), vùng C1 (codon 2020‐2172) và vùng C2 (codon 2173‐2332) tạo nên chuỗi nhẹ. Vùng C2 là vị trí liên kết màng tế bào của protein yếu tố FVIII và cũng là vị trí tương tác với yếu tố von Willebrand(13). Ở bệnh nhân 02, codon đột biến 732 thuộc vùng a2 cấu thành nên chuỗi nặng. Đột biến này làm cho quá trình tổng hợp protein yếu tố VIII dừng ngay tại codon 732, do đó, protein yếu tố VIII của bệnh nhân 02 hồn tồn khơng có những vùng còn lại. Đột biến này khiến cho protein khơng hồn chỉnh và khơng thể thực hiện chức năng trong q trình đơng máu. Điều này khiến cho bệnh nhân biểu hiện bệnh Hemophilia A ở thể nặng. Hiện nay, trên cơ sở dữ liệu thế giới về Hemophilia A và các đột biến trên gen FVIII (F8 Hemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site – HAMSTeRS ‐ database), chưa có cơng bố nào về đột biến vơ nghĩa tại codon 732. Bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp gen F8, chúng tôi đã ghi nhận được đột biến này lần đầu tiên. Trong những nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi sẽ tiếp tục phân tích gen F8 cho mẹ, chị em gái của bệnh nhân 01 và 02, đặc biệt tại các vị trí phát hiện đột biến trên exon 14 nhằm phân tích di truyền cho gia đình có gen bệnh và đưa ra các 23 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 tư vấn di truyền thích hợp, nếu người nhà của gia đình có kế hoạch sinh con. Bên cạnh đó, chúng tơi cũng sẽ xây dựng và chẩn hóa quy trình chẩn đốn truớc sinh các đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A từ dịch ối thai nhi. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã xây dựng thành cơng quy trình chẩn đốn đột biến gen yếu tố FVIII gây bệnh Hemophilia A và phát hiện được hai đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A trên hai bệnh nhân nam, bao gồm một đột biến dịch khung do mất 4 nucleotid và một đột biến vơ nghĩa do tạo thành stop codon. Trong đó, đột biến vô nghĩa chưa từng được công bố trên các cơ sở dữ liệu về Hemophilia A. 10 11 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdul‐Ghafar A, Bogdanova N, Lim LC, Zhao Y, Markoff A, Tien SL (2010). Ten novel factor VIII (F8C) mutations in eighteen haemophilia A families detected in Singapore, Haemophilia, 16(3):551‐3. Anne Goodeve. Moleculer Genetic testing of Hemophilia A (2008). Seminar in thrombosis an Hemostasis; 34 (6): 491‐501. Antonarakis SE, Kazazian HH and Tuddenham EGD (1995). Molecular ethiology of factor VIII deficiency in hemophilia A. Hum. Mutat., 5:1–22. Azza AGTantawy (2010). Molecular genetics of hemophilia A: Clinical perspectives. The Egyptian Journal of Medical Human Genetics 11: 105–114. 13 14 Brower C, Thompson AR (2000). Hemophilia A. In: Pagon RA, Bird TC, Dolan CR, Stephens K, editors. GeneReviews. Seattle (WA): University of Washington, Seattle. Geoffrey KC, Edward GD, Adam IW (1998). The factor VIII structure and mutation resource site: HAMSTeRS Version 4. Nucleic Acids Res, 26:216–9. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, Wion KL, Chen EY, Eaton DH, Vehar GA, Capon DJ, Lawn RM (1984). Characterization of the human factor VIII gene. Nature, 312: 326–330. Hedner, Ulla, Ginsburg, David, Lusher, Jeanne M., High, Katherine A (2000). Congenital Hemorrhagic Disorders: new insights into the pathophysiology and treatment of hemophilia. Hematology 2000: 241–65. http://hadb.org.uk Lin SW, Lin SR and Shen MC (1993). Characterization of genetic defects of hemophilia A in patients of Chinese origin. Genomics 18: 496‐504. Margaglione M, Castaman G, Morfini M, Rocino A, Santagostino E, Tagariello G, et al. Mannucci PM; AICE‐ Genetics Study Group (2008). The Italian AICE‐Genetics hemophilia A database: results and correlation with clinical phenotype. Haematologica, 93(5):722–8. Oldenburg J, El‐Maarri O (2006). New insight into the molecular basis of hemophilia A. Int J Hematol., 83(2):96‐102. Pratt KP, Shen BW, Takeshima K, Davie EW, Fujikawa K, Stoddard BL. (1999). Structure of the C2 domain of human factor VIII at 1.5 Å resolution. Nature, 402: 439–442. Xue F, Zhang L, Sui T, Ge J, Gu D, Du W, et al (2010). Factor VIII gene mutations profile in 148 Chinese hemophilia A subjects. Eur J Haematol., 85(3):264–72. Ngày nhận bài Ngày phản biện nhận xét bài báo Ngày bài báo được đăng: 29/8/2013. 04/9/2013. 18/10/2013 24 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ... sinh các đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A từ dịch ối thai nhi. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã xây dựng thành cơng quy trình chẩn đốn đột biến gen yếu tố FVIII gây bệnh. .. Hemophilia A và phát hiện được hai đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A trên hai bệnh nhân nam, bao gồm một đột biến dịch khung do mất 4 nucleotid và một đột biến vơ ngh a. .. Study Group (20 08) . The Italian AICE‐Genetics hemophilia A database: results and correlation with clinical phenotype. Haematologica, 93(5):722 8. Oldenburg J, El‐Maarri O (2006).