Xây dựng quy trình khảo sát gen gây bệnh dựa trên đặc điểm lâm sàng và vận tốc dẫn truyền thần kinh gợi ý bệnh lý CMT thể sợi trục với tốc độ dẫn truyền bình thường.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH THẦN KINH NGOẠI BIÊN DI TRUYỀN CHARCOT-MARIE-TOOTH Mai Phương Thảo* TÓM TẮT Mở đầu: Bệnh Charcot-Marie-Tooth (CMT) bệnh lý thần kinh ngoại biên di truyền thường gặp với tần suất mắc bệnh 1/2500 Bệnh đặc trưng tổn thương vận động bao gồm yếu liệt teo cơ, tổn thương cảm giác gây giảm cảm giác giảm phản xạ gân xương Bệnh khởi phát độ tuổi với mức độ biểu lâm sàng khác Mặc dù không gây tử vong bệnh gây biến dạng xương khớp làm ảnh hưởng nặng nề đến chất lượng sống người bệnh Tại Việt Nam, chẩn đoán bệnh dựa đặc điểm lâm sàng kết điện ký, gợi ý bệnh lý thần kinh ngọai biên di truyền Việc xây dựng quy trình chẩn đốn bệnh dựa triệu chứng lâm sàng, kết điện ký, định hướng phân tích gen theo trình tự có ý nghĩa quan trọng việc chẩn đốn xác định bệnh CMT, phân loại subtype, đồng thời giảm thiếu chi phí q trình làm xét nghiệm chẩn đốn bệnh Mục tiêu: Xây dựng quy trình khảo sát gen gây bệnh dựa đặc điểm lâm sàng vận tốc dẫn truyền thần kinh gợi ý bệnh lý CMT thể sợi trục với tốc độ dẫn truyền bình thường Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Phân tích đặc điểm lâm sàng, kết điện ký, khảo sát gen MFN2 GDAP1 kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent Probe Amplification), phương pháp PCR giải trình tự gen gia đình bệnh nhân nghi ngờ bệnh lý thần kinh ngoại biên di truyền CMT đến khám phòng khám Thần kinh Bệnh viện ĐH Y Dược TPHCM Kết quả: Phân tích gen ghi nhận SNPs (single-nucleotide polymorphism) c.-367A>G exon gen MFN2 đột biến chèn đoạn nucleotides c.[656-661insTTGCA] exon gen GDAP1 Kết luận: Việc thiết lập quy trình khảo sát gen phân subtype dựa vào đặc điểm lâm sàng khảo sát dẫn truyền thần kinh giúp giảm thiều chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân, phục vụ chẩn đoán xác định bệnh tư vấn cho bệnh nhân Từ khóa: bệnh lý thần kinh ngoại biên di truyền, Charcot-Marie-Tooth, điện ký, MFN2, GDAP1, giải trình tự, MLPA ABSTRACT GENETIC TEST STRATEGY FOR HEREDITARY PERIPHERAL NEUROPATHIES CHARCOT-MARIETOOTH Mai Phuong Thao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: - Background - Objectives: Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease is a group of hereditary peripheral neuropathies, affecting approximately in 2500 people It is clinically characterized by motor disturbances (muscle weakness and atrophy), decreased or loss of sensory, and decreased or loss of deep tendon reflexes Onset of symptoms appears at any age with different level expressions Although the disease does not cause death, it leads to skeletal deformities that affecting patient life quality In Vietnam, the diagnosis is based on clinical findings and electromyography characteristics It’s important to identify the genes to confirm diagnosis, strategies for treatment of secondary complications by a team of various specialists, and genetic counseling In this study, we established a procedure for the genetic diagnosis of patients with clinically CMT disease and normal conduction velocities * Bộ sinh Sinh lý học, ĐH Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS Mai Phương Thảo, ĐT: 0918329999, Thần kinh Email: maithao292@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Methods: Analysis of clinical symptoms, nerve conduction studies and molecular genetic testing of MFN2 and GDAP1 in a suspected family of CMT in Neurology clinic, University Medical center in Hochiminh city Results: Analysis of database, there are a SNP as c.-367A>G on MFN2 and a mutation which has not been mentioned on database yet c [656-661 insTTGCA] + [656-661 insTTGCA] on GDAP1 Conclusion: Establishment a genetic test strategy for patients with axonal CMT based on clinical symptoms and nerve conduction studies are useful in identification of CMT subtypes, hereditary counseling and lowering the cost for diagnosis test Keywords: hereditary peripheral neuropathies, Charcot-Marie-Tooth, nerve conduction studies, MFN2, GDAP1, gene sequencing, MLPA với tỉ lệ xấp xỉ 1/2.500(3) Đột biến lặp ĐẶT VẤN ĐỀ đoạn 17p11.2 gây CMT1A chiếm 60 -70% Bệnh lý thần kinh di truyền thường gọi trường hợp CMT1, CMT1X chiếm khoảng 20% chung nhóm bệnh Charcot-Marie-Tooth ca CMT1 CMT1B chiếm 38m/s kèm tổn thương sợi trục > 38m/s kèm tổn thương sợi trục Bình thường giảm Do đa số thể CMT có tổn thương vận động (VĐ) cảm giác (CG), CMT1 CMT2 thường phân thành bệnh TKVĐ – CG di truyền (HMSN) type I type II Khảo sát điện sinh lý TK xác định nhóm khác CMT trung gian với tốc độ dẫn truyền TK mức độ trung gian (lớn nhỏ 38 m/s) Các thể CMT nặng mà không ghi nhận tiền sử gia đình trước cho di truyền lặn NST thường xếp thành HMSN III hội chứng Dejerine-Sottas(8) Nhờ tiến kỹ thuật phân tử góp phần làm sáng tỏ phần Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 chế hầu hết trường hợp HMSN III đột biến ngẫu nhiên gen bệnh di truyền trội Hiện thuật ngữ HMSN III khơng sử dụng nữa; nhiên hội chứng Dejerine-Sottas sử dụng để thể bệnh CMT nặng trẻ sơ sinh với tốc độ dẫn truyền thần kinh chậm Nghiên cứu Y học sớm cho dù đặc điểm di truyền nào(8) Sinh lý thần kinh Sinh bệnh học Khảo sát tốc độ dẫn truyền TK giúp phân biệt bệnh lý thần kinh huỷ myelin bệnh TK sợi trục Trong thực hành lâm sàng, khoảng 60% bệnh nhân CMT CMT thể tổn thương huỷ myelin (CMT1) 20% làm CMT thể thoái hoá sợi trục (CMT2) Khảo sát điện sinh lý thường hữu ích việc nhận diện tổn thương cảm giác Ngồi giúp phân loại tổn thương TK sợi trục di truyền thành bệnh TK sợi trục vận động cảm giác (CMT2), tổn thương sợi trục vận động đơn (dHMN) tổn thương đơn sợi trục cảm giác (HSAN/HSN)(2,4,13) Một đặc điểm chung hầu hết gen đột biến gây CMT gen đóng vai trò quan trọng việc trì cấu trúc chức thành phần tế bào cấu tạo hệ TK ngoại biên, tế bào Schwann sợi trục dây TK ngoại biên Phần lớn bệnh nhân CMT1, hay CMT1A có vận tốc dẫn truyền chậm đồng khoảng 20 m/s Tuy nhiên, chậm không đối xứng đặc điểm HNPP gặp bệnh nhân có đột biến sai nghĩa (missense dominant) gen PMP22, MPZ, EGR2, GJB1(13) Đặc điểm lâm sàng ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Mặc dù kiểu hình thay đổi, diễn tiến lâm sàng điển hình bệnh nhân CMT1 CMT2 bao gồm: phát triển bình thường trước yếu cảm giác xuất thập niên đầu đời, gọi “kiểu hình cổ điển” (classical phenotype) Những đứa trẻ bị bệnh thường chạy chậm gặp khó khăn hoạt động cần thăng Phẫu thuật chỉnh hình chân thường thực thập niên thứ Các cử động khéo léo bàn tay bị ảnh hưởng bàn tay bị tác động bàn chân Đa số bệnh nhân có đời sống tuổi thọ bình thường(9) Đối tượng khảo sát Việc phát gen gây bệnh dẫn đến thay đổi cách phân loại CMT dựa gen Mỗi nhóm CMT chia nhỏ dựa vào gen gây bệnh đặc hiệu Hiện giới xác định đột biến 70 gen nguyên nhân gây bệnh lý TK di truyền Một số bệnh nhân có kiểu hình nặng chậm phát triển vận động khởi phát giai đoạn sơ sinh, gọi bệnh lý Dejerine-Sottas, trường hợp nặng đặc biệt phân loại huỷ myelin bẩm sinh q trình myelin hố q trinhg phát triển phôi thai bị ngừng trệ Nhiều bệnh nhân có bất thường trội NST thường (de-novo) thuật ngữ Dejerine-Sottas sử dụng để kiểu hình lâm sàng khởi phát Thần kinh Điện ký Khảo sát dẫn truyền thần kinh vận động cảm giác máy điện Medtronic A/S Tonshakken 16-18 DK- 2740 Skovlunde – Denmark Kỹ thuật khảo sát thực theo chuẩn hướng dẫn Preston Shapiro Các dây thần kinh chi gồm: dây thần kinh vận động-cảm giác, dây thần kinh trụ vận động-cảm giác, dây thần kinh quay cảm giác Các dây thần kinh chi khảo sát gồm có dây thần kinh chày vận động, dây thần kinh mác sâu vận động, dây thần kinh mác nông cảm giác, dây thần kinh bắp chân cảm giác Phân tích di truyền học Tách chiết DNA từ mẫu máu ngoại vi, phản ứng PCR khuyếch đại giải toàn trình tự gen MFN2 GDAP1, kỹ thuật MLPA xác định lặp đoạn gen MFN2 thực Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm lâm sàng điện ký Gia đình người Việt, dân tộc Kinh, có thành viên: bố (BN1), mẹ (BN2) không biểu triệu chứng thần kinh, 03 người (2 nữ, nam: BN3, BN4, BN5) có biểu diễn tiến bệnh tương tự (Hình 1): Bệnh khởi phát từ lúc 27 tháng, gia đình ghi nhận bệnh nhân chậm biết đi, không vững, dễ té, chạy được, phát triển tâm thần bình thường Hình 1: Phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân CMT BN1(bố), BN2(mẹ), BN3,4,5 (các con) Khám thần kinh ghi nhận triệu chứng trình bày bảng 2, hình Các quan khác không ghi nhận bất thường Bảng 2: Đặc điểm lâm sàng điện ký đối tượng bệnh nhân BN1 BN2 BN3 BN4 BN5 Đặc điểm lâm sàng Không ghi nhận triệu chứng bất thường vận động – cảm giác Dẫn truyền thần kinh Bình thường Điện kim Bình thường Bất thường vận động – cảm giác Mất đáp ứng vận động – cảm giác đối xứng dây thần kinh khảo sát Không khảo sát Tổn thương kiểu sợi trục thần kinh, vận tốc dẫn truyền bình thường > 50m/s Mất phân bố tái phân bố thần kinh Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Bảng 3: Triệu chứng vận động cảm giác dương tính âm tính bệnh nhân BN03 Tay Chân Triệu chứng vận động -Teo nội bàn tay -Sức chi 1/4, gốc chi 4/4 -Co rút bàn tay -Phản xạ gân nhị đầu, tam đầu -Teo bàn chân, cẳng chân -Sức chi 1/4, gốc chi 4/4 -Bàn chân hình vòm (pes cavus) -Phản xạ gối-gót Triệu chứng cảm giác -Cảm giác nơng, cảm giác đau -Rung âm thoa giảm Ưu chi gốc chi -Cảm giác nông, cảm giác đau -Rung âm thoa giảm Ưu chi gốc chi Hình 2: Biểu lâm sàng bệnh nhân BN3 (A,B) Teo nội bàn tay, (C) Teo vùng cẳng chân, bàn chân hình vòm (pes cavus) ngun nhân thường gặp gây CMT type 2A(14), Kết khảo sát gen MFN2 GDAP1 chiếm 2/3 số trường hợp CMT thể sợi trục Trên sở phân tích đặc điểm lâm sàng Chúng tơi tìm thấy SNP exon c.kết điện ký nghi ngờ gia đình bệnh nhân 367A>G (rs2236054) nằm vùng khơng mã hóa có bệnh thần kinh ngoại biên di truyền protein chức năng: BN1 dị hợp tử, BN2 bình Charcot-Marie-Tooth thể sợi trục khởi phát thường, BN3, 4, biểu đồng tử lứa tuổi nhỏ (27 tháng) Để xác định chẩn đoán, Bằng kỹ thuật MLPA phát lặp/mất đoạn tiến hành khảo sát gen MFN2 gen, chưa ghi nhận đột biến lặp Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 đoạn gen MFN2 thành viên (Hình 3) Nghiên cứu Y học chứng vận động, tuổi khởi phát sớm, diễn tiến mạn tính, bất thường khảo sát dẫn truyền thần kinh kiểu tổn thương sợi trục đột biến gen GDAP1 giúp chẩn đốn phân subtype xác bệnh nhân CMT type 4A(11) Chúng đưa quy trình khảo sát gen thực Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TPHCM đối tượng nghi ngờ Charcot-Marie-Tooth sau (Hình 5) Hình 3: Phân tích gen MFN2 (Trái) Kết giải trình tự gen phát SNP exon (c.367A>G, rs2236054) (Phải) Khảo sát lặp đoạn gen kỹ thuật MLPA chưa phát đột biến Kết khảo sát gen GDAP1 Tuy nhiên, với biểu đột biến 05 thành viên gia đình, gợi ý kiểu hình bình thường, nguyên nhân gây bệnh lý thần kinh đối tượng BN 03-04-05 Chúng tiếp tục khảo sát gen GDAP1(1), ghi nhận đột biến chèn đoạn nucleotide c.[656-661 insTTGCA] (Hình 4) nằm exon gen GDAP1 gây lệch khung dịch mã protein, BN1 BN2 đột biến chèn đoạn allele, BN3-4-5 biểu chèn đoạn allele Đột biến chưa công bố y văn giới(1,10) KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Dựa đặc điểm lâm sàng có bất thường vận động cảm giác với triệu chứng đối xứng hai chi, ưu chi gốc chi, trội triệu Thần kinh Hình 4: Đột biến c.[656-661 insTTGCA]+[656-661 insTTGCA] GDAP1 phát kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA Khảo sát gen quy trình chẩn đốn Xét nghiệm gen thực sau hỏi tiền gia đình, thăm khám thần kinh khảo sát điện sinh lý kĩ Đánh giá phân tử tiêu chuẩn vàng để xác định chẩn đoán bệnh TK di truyền Chiến lược khảo sát gen mục tiêu dựa vào đặc điểm di truyền, kiểu hình lâm sàng tốc độ dẫn truyền TK vận động Trong nghiên cứu này, đưa quy trình khảo sát gen gây bệnh CMT thể sợi trục, với vận tốc dẫn truyền ≥ 45m/s đáp ứng vận động (CMAP) Nguyên nhân phổ biến CMT thể sợi trục CMT2A với triệu chứng lâm sàng xuất giai đoạn sơ sinh trẻ nhỏ Nếu Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 khảo sát âm tính, dấu hiệu lâm sàng giúp gợi ý nhà lâm sàng định khảo sát gen khác nhau(5,6,11) khơng phải khơng có sai sót, chẳng hạn NST X vùng giàu G – C khơng bao phủ giải trình tự tồn genome hay giải trình tự exome Ngay giải trình tự Sanger coi tiêu chuẩn vàng kỹ thuật phân tử sót đột biến chèn đoạn nhỏ (đột biến phát kỹ thuật giải trình tự hệ mới) Ở đây, vùng phiên mã gen gây bệnh CMT khảo sát Nhiều gen có MFN2 gây CMT2A có nhiều polymorphism khơng gây bệnh Mặc dù đạt nhứng tiến to lớn việc hiểu biết chế sinh học bệnh thần kinh di truyền dựa phát triển sinh học phân tử mơ hình động vật chuyển gen, chưa có phương thức điều trị hữu hiệu cho thể CMT TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình Sơ đồ khảo sát gen bệnh nhân Charcot-Marie-Tooth có vận tốc dẫn truyền thần kinh ≥ 45m/s(9) Khi xét nghiệm gen thực bệnh nhân, thành viên khác gia đình khơng cần xét nghiệm gen mà xác định đánh giá lâm sàng với khảo sát dẫn truyền TK Chúng không khảo sát nhiều gen CMT lúc, xem xét phân tích gen gây bệnh thành viên gia đình có biểu bệnh lâm sàng kiểu hình họ khơng giống với thể bệnh CMT gia đình Chúng tơi tiến hành khảo sát điện sinh lý giới hạn, khơng khảo sát điện kim trẻ có triệu chứng CMT bới thay đổi chậm dẫn truyền đồng nhất, khảo sát dây thần kinh thường đủ để hướng dẫn khảo sát gen xác định trẻ có bểu lâm sàng gia đình CMT Với phát triển nhanh kỹ thuật giải trình tự hệ thực hành lâm sàng cho phép xác định trình tự tồn genome exome vài ngày Tuy nhiên, kỹ thuật 6 10 Baxter RV, Vance JM, et al (2002) Ganglioside-induced differentiation-associated protein-1 is mutant in CharcotMarie-Tooth disease type 4A/8q21 Nat Genet 30:21–22 doi: 10.1038/ng796 Dubourg O, LeGuern E, et al (2001) The frequency of 17p11.2 duplication and Connexin 32 mutations in 282 Charcot-MarieTooth families in relation to the mode of inheritance and motor nerve conduction velocity Neuromuscul Disord NMD 11:458–463 Harding AE, Thomas PK (1980) The clinical features of hereditary motor and sensory neuropathy types I and II Brain J Neurol 103:259–280 Harding AE, Thomas PK (1980) Genetic aspects of hereditary motor and sensory neuropathy (types I and II) J Med Genet 17:329–336 Lewis RA, Sumner AJ (1982) The electrodiagnostic distinctions between chronic familial and acquired demyelinative neuropathies Neurology 32:592–596 Lewis RA, Sumner AJ, Shy ME (2000) Electrophysiological features of inherited demyelinating neuropathies: A reappraisal in the era of molecular diagnosis Muscle Nerve 23:1472–1487 Patzko A, Shy ME (2012) Charcot-Marie-Tooth disease and related genetic neuropathies Contin Minneap Minn 18:39–59 doi: 10.1212/01.CON.0000411567.34085.da Plante-Bordeneuve V, Said G (2002) Dejerine-Sottas disease and hereditary demyelinating polyneuropathy of infancy Muscle Nerve 26:608–621 doi: 10.1002/mus.10197 Saporta MA, Shy ME (2013) Inherited peripheral neuropathies Neurol Clin 31:597–619 doi: 10.1016/j.ncl.2013.01.009 Senderek J, Schröder JM, et al (2003) Mutations in the ganglioside-induced differentiation-associated protein-1 Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 11 12 13 (GDAP1) gene in intermediate type autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth neuropathy Brain J Neurol 126:642–649 Shy ME (2011) Inherited peripheral neuropathies Contin Minneap Minn 17:294–315 doi: 10.1212/01.CON.0000396963.75069.66 Skre H (1974) Genetic and clinical aspects of Charcot-MarieTooth’s disease Clin Genet 6:98–118 Thomas PK, Harding AE (1993) Inherited neuropathies: the interface between molecular genetics and pathology Brain Pathol Zurich Switz 3:129–133 Thần kinh 14 Nghiên cứu Y học Verhoeven K, Timmerman V, et al (2006) MFN2 mutation distribution and genotype/phenotype correlation in CharcotMarie-Tooth type Brain J Neurol 129:2093–2102 doi: 10.1093/brain/awl126 Ngày nhận báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 ... giác di truyền bệnh lý thần kinh khác có CMT2A(7) Dựa đặc điểm di truyền liên quan(7) bệnh thần kinh ngoại biên di khảo sát điện sinh lý, CMT chia thành truyền dễ liệt chèn ép (HNPP - Hereditary... loại CMT(9) bệnh TK vận động chi di truyền (dHMN – Kiểu tổn Đặc điểm di Vận tốc dẫn Loại distal Hereditary Motor Neuropathy), bệnh TK thương TK truyền truyền thần kinh cảm giác tự chủ di truyền (HSAN/HSN... chi gồm: dây thần kinh vận động-cảm giác, dây thần kinh trụ vận động-cảm giác, dây thần kinh quay cảm giác Các dây thần kinh chi khảo sát gồm có dây thần kinh chày vận động, dây thần kinh mác sâu