Bài viết trình bày về bảy chủng vi sinh vật (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae và Candida albicans) được định danh đưa vào làm chứng dương để tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT BẰNG PCR ĐA MỒI Lê Hữu Song*; Nguyễn Trọng Chính* Ngơ Tất Trung*; Phan Quốc Hồn* TĨM TẮT Bảy chủng vi sinh vật (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae v Candida albicans) đ-ợc nh danh đưa vào làm chứng dương để tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi Kết cho thấy, PCR (5 lex + lex) phát mầm bệnh với độ đặc hiệu 100% độ nhạy phương pháp 100 CFU/ml * Từ khóa: Nhiễm khuẩn huyết; PCR đa mồi Establishing protocol of multiplex PCR for identifying pathogens caused sepsis summary Colonies of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, and Candida albicans were used as positive control to monitor the success of multiplex-PCR assay The result showed that two set of multiplex - PCR (5lex + lex) can detect these pathogens with 100% of specificity and a sensitivety of 100 CFU/ml * Key words: Sepsis; Multiplex PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn huyết (NKH) nguyên nhân gây tử vong cao Theo thống kê Cơ quan Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ (CDC), bệnh gây tử vong đứng hàng thứ 11 Chỉ tính riêng Mỹ, hàng năm có 20.000 trường hợp > 65 tuổi bị trí NKH [1] Ở nước ta, chưa có số liệu thống kê tình hình NKH sở y tế toàn quốc Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ NKH Khoa Hồi sức Bệnh viện Nhi TƯ 9,4/1000 BN/ngày, tỷ lệ tử vong lên tới 20% số trường hợp NKH [2] Cấy máu cho tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán mầm bệnh NKH [3, 4] Tuy nhiên, việc lấy lượng máu lớn bệnh nhi sơ sinh việc khó khăn, quy trình thực thường kéo dài từ 48 - 72 có kết sơ * Bệnh viện TWQĐ 108 Chịu trỏch nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Nguyễn Thỏi Sơn 173 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Kết nghiên cứu cho thấy, 25% bệnh nhân (BN) xác định nguyên nhân gây NKH cấy máu [5] Vì vậy, việc chẩn đốn NKH chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng, nên khơng phát sớm bệnh, nguy hiểm cho tính mạng BN, đặc biệt trẻ nhỏ người cao tuổi Việc phát ADN vi khuẩn mẫu máu BN cho phương pháp có độ nhạy cao, thực nhanh, có giá trị hỗ trợ cho cấy máu để chẩn đoán NKH Tuy nhiên, từ trước tới nay, hầu hết phương pháp PCR chẩn đoán mầm bệnh thường sử dụng đơn mồi Mỗi lần xét nghiệm phát vi sinh vật Như vậy, để chẩn đoán nhiều mầm bệnh thời gian kinh phí cao Yêu cầu thực tế phải phát triển phương pháp đơn giản, giá thành thấp để phát nhiều mầm bệnh lần xét nghiệm Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu xây dựng PCR đa mồi (multiplex PCR) để phát mầm bệnh thường gây NKH: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae Candida albicans VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Các khuẩn lạc tương ứng chủng vi sinh vật: Candida albicans, Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Escherichia coli phân lập từ Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện TƯQĐ 108, hóa chất chuẩn dùng chạy PCR điện di thạch agarose Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách ADN tổng số: Tách chiết ADN tổng số kit thương mại (QIAamp DNA Blood Mini Kit) Quy trình tách chiết theo hướng dẫn nhà sản xuất * Thiết kế mồi: Thiết kế đặc hiệu cặp mồi cho lồi khơng bắt chéo với khơng bắt cặp với genomics người Trình tự mồi sau: KÍCH THƯỚC AMPLICON BỆNH CĂN DO TÊN MỒI (tên gen) TRèNH TỰ MỒI XUÔI/NGƯỢC 5’-GTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTA-3’ 243 C albicans 411 P aeruginosa P.au AF116285 324 K pneumoniae Kp-aldA 515 S aureus Z48339 STAAROA 5’-CCGTGCCACATTCCTCCGC-3’ 5’-CCCGAATGTCGGCATCATTCTC-3’ 5’-CGGTAGACCTCGCGCTTGAA-3’ 5’-CCTTGTCTTTAAACGCGCGC-3’ 5’-TTTTTCGCCGCAGCGG-3’ 5’-AAGGGCGAAATAGAAGTGCCGG-3’ 5’-ATGGTCGGTTCCTTAGAAAACAAACTTG-3’ 176 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 (1) (2) (3) (4) 5’-TTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG-3’ 599 A baumannii 701 S pneumoniae 701 S pneumoniae 773 E coli Ab (JX470958) 5’-TGGTGCAACAAACTCCCATGGT-3’ 5’-CAACCGTACAGAATGAAGCGGATTAT-3’ Sp LytA 5-capsular gene cluster 5’-GTCCTTGTACTTGACCCAGCCT-3’ 5’-CAACCGTACAGAATGAAGCGGATTA -3’ 5’-GATCGGTATTCTTCTCTATCAAACTGG -3’ 5’-GTCGCGAGTGAAGATCCCTTTC-3’ S-uidA 5’-GCATTAATGGACTGGATTGGGGC-3’ 5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’ 996/155 180 Universal primers β globin Uni-pathogen β globin 5’-ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC-3’ 5’-AGAAGAGCCAAGGACAGGTACG-3’ 5’-TGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGA-3’ * Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu: Kiểm định độ đặc hiệu giải trình tự gen chạy thử mẫu chứng âm Chứng âm nh÷ng mẫu máu BN nhiễm virut viêm gan B (HBV) máu BN chẩn đoán nghi ngờ mang bệnh tự miễn cần làm xét nghiệm HLA-B27 Đánh giá độ nhạy phương pháp cách pha loãng nồng độ vi sinh vật từ 106;105;104;103;102;101;100 CFU/ml KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Độ đặc hiệu mồi đơn cho chủng vi sinh vật Hình 1: Kết phát mầm bệnh PCR đơn mồi 176 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 (Marker: thang chuẩn, băng phía kết mầm bệnh tương ứng; băng phía sản phẩm cặp mồi chung (Universal primer) phẩm Riêng S pneumonia cần có ngưỡng cao (100 CFU/ml) Tuy nhiên, thực hành để có độ tin cậy cao, chúng tơi lấy ngưỡng 100 CFU/ml cho tất mầm bệnh Các sản phẩm PCR cho hình ảnh rõ nét, có khoảng cách xa nhau, đủ để phân biệt Sau thực phản ứng PCR đơn mồi, tiến hành giải trình tự so sánh với trình tự chuẩn ngân hàng gen (www ncbi.nlm.nih.gov) Kết phân tích cho thấy, mồi đơn chúng tơi thiết kế hồn toàn đặc hiệu với 07 chủng vi sinh vật quan tâm Tuy nhiên, tính phức tạp số liệu giải trình tự, nên báo khơng trình bày Tối ƣu hóa điều kiện PCR đa mồi Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu PCR đơn mồi Để đánh giá độ nhạy PCR đơn mồi, tiến hành pha loãng nồng độ chủng vi sinh theo tỷ lệ giảm dần từ 106 CFU/ml đến 100 CFU/ml vào máu người khỏe mạnh, tiến hành tách chiết ADN tổng số PCR mồi đơn cho chuỗi pha lỗng Mục đích cuối tạo định mồi có khả xác định có mặt vi sinh vật quan tâm mẫu bệnh phẩm Để đạt mục đích đó, tiến hành kết hợp mồi đơn với thực phản ứng PCR mẫu genomics ADN tách từ vi khuẩn chuẩn dương Sau thử nghiệm kết hợp mồi đơn khác nhiều thử nghiệm (số liệu khơng trình bày đây), thu set mồi (5 lex + lex - (C albicans + P aeruginosa + S aureus, A baumannii E coli) + (S pneumonia + K pneumonia) lex (C albicans + P aeruginosa + S aureus, A baumannii + S pneumonia E coli) + lex (K pneumonia) có khả chẩn đốn có mặt vi sinh vật chứng dương tương ứng mẫu phân tích Hình 2: Độ nhạy kỹ thuật xét nghiệm PCR đơn mồi cho chủng vi sinh vật Hình 3: Kết sử dụng mồi plex lex chẩn đoán mầm bệnh đơn Kỹ thuật PCR đơn mồi phát vi sinh vật nồng độ CFU/1 ml bệnh Kết PCR đa mồi phát mầm bệnh rõ nét, băng phụ 177 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi Hình 4: Độ đặc hiệu mồi lex (panel trên) mồi lex (panel dưới) (Markers: thang chuẩn; băng chuẩn dương có ghi rõ tên mầm bệnh tương ứng; HLA-b27 (1-9) mẫu máu biết chắn không nhiễm mầm bệnh kể trên; HBV (1-9) mẫu máu bệnh nhân nhiễm virut viêm gan B) Các chứng dương cho kết rõ nét, khơng có trường hợp chứng âm có kết dương tính từ mồi sử dụng BÀN LUẬN Chẩn đoán nhanh, xác mầm bệnh yêu cầu tiên để điều trị hiệu NKH Trong hầu hết trung tâm y tế nước ta áp dụng phương pháp cấy khuẩn với thời gian chờ đợi kết thường 48 - 72 Hơn nữa, cấy khuẩn đòi hỏi lượng máu lớn, bỏ sót nhiều trường hợp dương tính, đặc biệt với BN nhiễm chủng vi sinh vật tiến hành ni cấy khó ni cấy Streptococus pneumonia, Heamophilus influenza [5] Phương pháp chẩn đoán vi sinh vật dựa trình tự đặc thù axít nhân (PCR) nhiều trung tâm y tế lớn giới triển khai Nó có ưu điểm: thời gian chẩn đoán ngắn, độ nhạy kỹ thuật cao; lý thuyết xác định xác có mặt tế bào vi sinh vật mẫu bệnh phẩm [6] Tuy nhiên, chi phí cho xét nghiệm sinh học phân tử phải cân nhắc: tính trung bình giá thành xét nghiệm PCR đơn mồi cho mầm bệnh vi sinh vật khoảng 300 - 350 nghìn, xét nghiệm chẩn đốn đồng thời - 10 mầm bệnh, kỹ thuật PCR đơn mồi, BN trả khoảng - 3,5 triệu đồng Vấn đề quan trọng PCR đa mồi thiết kế mồi tối ưu hóa điều kiện phản ứng Trong nghiên cứu này, cặp mồi đơn thiết kế bắt cặp đặc hiệu vào khu vực bảo tồn cao cho loài gen ribosome 16S 23S gen mã hóa cho protein độc tố đặc trưng lồi Các cặp mồi khơng bắt cặp chéo với (khi thực phản ứng đa mồi) khơng bắt cặp với genomics ADN người Ngồi 178 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 mồi đơn đặc hiệu cho lồi, chúng tơi thiết kế cặp mồi bắt vào khu vực bảo tồn chung tất loài vi sinh vật (universal primer) nhằm kiểm chứng lây nhiễm vi sinh vật tổng số vi sinh vật không nằm danh sách quan tâm Để kiểm tra chất lượng AND, trình tách chiết, sử dụng mồi đặc hiệu cho genomics ADN người (mồi beta globin) Sự khác biệt kích thước đoạn sản phẩm tạo nằm khoảng 80 - 100 bp, đảm bảo đoạn sản phẩm dễ dàng phân biệt điện di gel agarose 1,5 - 2,5% Để kiểm tra tính đặc hiệu mồi thiết kế loại bỏ tượng dương tính giả bắt cặp thành phần hỗn hợp mồi vị trí khác gen người, thực phản ứng PCR đa mồi sử dụng set mồi (5 lex + lex) khuôn (template) ADN bệnh phẩm mang HBV ADN ADN bệnh phẩm chẩn đốn thể đa hình gen HLA - B27 Quá trình thử nghiệm chưa ghi nhận tượng bắt cặp chéo mồi đơn đặc hiệu vi sinh vật với vị trí gen người (hình 4) Kết chứng minh PCR đa mồi xây dựng có độ đặc hiệu cao Chúng tơi thấy quy trình có khả xác định xác vi sinh vật quan tâm Tuy nhiên, thực hành lâm sàng, lấy ngưỡng phát 100 CFU/ml Quy trình xét nghiệm đòi hỏi lần tách ADN bệnh phẩm tổng số phản ứng PCR, đó, giá thành xét nghiệm mức < triệu/BN Đặc biệt, trình chØ thực ngày làm việc (8 giờ), lợi điểm chủ yếu phương pháp KẾT LUẬN Kỹ thuật PCR đa mồi xây dựng thành công cho phép chẩn đốn xác, nhanh hiệu mầm bệnh thường gây NKH TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Kiến Ngãi, T.V.H Colin Partridge, Lê Lan Anh, Nguyễn Hoài Thu, Trần Minh Chi, Meklit Workneh Tỷ lệ mắc số yếu tố liên quan nhiễm khuẩn huyết bệnh viện khoa hồi sức cấp, Bệnh viện Nhi TW http://www.nhp.org.vn/images/data/94-TLM~1.pdf Kenneth D Kochanek, M.A.J.X M.D, Sherry L Murphy, B.S Arialdi M Miniño M.P.H and Hsiang-Ching Kung Deaths: Preliminary data for 2009 National Vital Statistics Reports 2011 Vol 59, No Gerdes J.S Clinicopathologic approach to the diagnosis of neonatal sepsis Clin Perinatol 1991, 18 (2), pp.361-381 Gerdes J.S Clinicopathologic approach to the diagnosis of neonatal sepsis Isr J Med Sci 1994, 30 (5 - 6), pp.430-441 Jordan J.A, et al Evaluating the near-term infant for early onset sepsis: progress and challenges to consider with 16S rDNA polymerase chain reaction testing J Mol Diagn 2006, (3), pp.357-363 Espy M.J, et al Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing Clin Microbiol Rev 2006, 19 (1), pp.165-256 Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 10/11/2012 Ngày giao thảo in: 6/12/2012 179 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 180 ... pneumonia) có khả chẩn đốn có mặt vi sinh vật chứng dương tương ứng mẫu phân tích Hình 2: Độ nhạy kỹ thuật xét nghiệm PCR đơn mồi cho chủng vi sinh vật Hình 3: Kết sử dụng mồi plex lex chẩn đoán mầm bệnh... cặp mồi bắt vào khu vực bảo tồn chung tất loài vi sinh vật (universal primer) nhằm kiểm chứng lây nhiễm vi sinh vật tổng số vi sinh vật không nằm danh sách quan tâm Để kiểm tra chất lượng AND, trình. .. bệnh phẩm chẩn đốn thể đa hình gen HLA - B27 Quá trình thử nghiệm chưa ghi nhận tượng bắt cặp chéo mồi đơn đặc hiệu vi sinh vật với vị trí gen người (hình 4) Kết chứng minh PCR đa mồi xây dựng có