Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất một số chế phẩm sinh học dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước KC - 04 - 27 đã thực hiện những nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng một số sản phẩm từ vi sinh vật như chất màu β-caroten, chất nhũ tương

301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài:

Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất một số chế phẩm sinh học dùng trong công

Bản quyền 2006 thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm

Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trưởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu

Danh sách những người tham gia thực hiện đề tàI

Bách khoa Hà Nội

23 ThS Vương Nguyệt Minh Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN

29

Chủ nhiệm đề tài nhánh

TS Phạm Thuý Hồng

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ VN

BàI tóm tắt

Vấn đề đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn các sản phẩm thực phẩm hiện nay đang được Nhà nước Việt Nam đặc biệt quan tâm Xu hướng sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, an toàn, không độc hại, có lợi cho sức khoẻ cả về giá trị dinh dưỡng và chức năng phòng chống bệnh tật được cả thế giới quan tâm Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước KC - 04 - 27 đã thực hiện những nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng một số sản phẩm từ vi sinh vật như chất màu β-caroten, chất nhũ tương và hoạt động bề mặt glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs), dẫn xuất của axít amin S-adenosyl L-methionine (SAM) trong chế biến một số sản phẩm thực phẩm

Trong quá trình thực hiện, đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thông dụng trong lĩnh vực công nghệ vi sinh, lên men, chế biến thực phẩm Các phương pháp phân tích vi sinh vật, hoá lý, sắc ký đã được thực hiện trên các thiết bị thông dụng và hiện đại như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký cột tinh sạch protein, quang phổ hấp thụ nguyên tử …để đảm bảo các số liệu nghiên cứu là chính xác và đáng tin cậy Phương pháp xử lý giống vi sinh vật bằng hoá chất đột biến đã được thử nghiệm để nâng cao

khả năng tổng hợp β-caroten của chủng nấm sợi Blakeslea trispora Các thiết bị nuôi

cấy vi sinh vật theo phương pháp chìm, hiếu khí đã được sử dụng có hiệu quả ở quy mô phòng thí nghiệm như các loại máy lắc, bình lên men 14 lít và quy mô xưởng thực nghiệm như hệ thống thùng lên men 80, 500 và 1500 lít

Đề tài đã khảo sát, lựa chọn, sử dụng các biện pháp công nghệ, các thiết bị và

chế độ lên men phù hợp để nâng cao hoạt tính 3 chủng nấm sợi Blakeslea trispora tổng hợp β-caroten đạt từ 2580-4930 mg/L, 2 chủng nấm men Pseudozyma antarctica

và P aphidis sinh chuyển hoá tổng hợp MELs đạt 80-130 g/L và 3 chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae và S carlbergensis tổng hợp SAM đạt 10-18,5% so với sinh

khối khô Các kết quả này đã bằng và vượt các số liệu nghiên cứu đã được công bố trên thế giới trong các điều kiện nghiên cứu và sản xuất tương tự Các phương pháp tách chiết, tinh sạch, phân tích đã được nghiên cứu lựa chọn để ứng dụng trong phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm để tạo các sản phẩm và bán sản phẩm β-caroten MELs, SAM đạt các chỉ tiêu về thành phần chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm

Lần đầu tiên, đề tài đã nghiên cứu và ứng dụng thành công công nghệ vi nang hoá sử dụng phương pháp nhũ hoá-sấy phun để tạo được bột màu β-caroten tan trong nước từ nguyên liệu β-caroten tan trong dầu sản xuất theo quy trình công nghệ vi sinh

Các sản phẩm nghiên cứu, sản xuất thử của đề tài đã được nghiên cứu ứng dụng

và sản xuất đại trà 3,5 tấn kẹo, 6,65 tấn bánh quy kẹp kem, xốp kem dùng các sản phẩm sản xuất theo công nghệ vi sinh là β-caroten thay phẩm màu tổng hợp hoá học, MELs thay cho chất nhũ hoá Lecithin, và chứa hoạt chất sinh học SAM có lợi cho sức khoẻ người tiêu dùng tại Công ty Cổ phần bánh kẹo Hải Hà, Tràng An, Hữu Nghị, Hương Sen, Phát Việt và Tùng Lâm

Ngoài các kết quả đạt được trong nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng trong công nghiệp chế biến bánh kẹo, đề tài đã tham gia đào tạo 13 sinh viên tốt nghiệp đại học, 5 thạc sĩ trong đó có 3 là cán bộ khoa học của cơ quan chủ trì đề tài, và góp phần nâng cao trình độ cán bộ khoa học của các cơ quan hợp tác thực hiện đề tài trong các lĩnh vực vi sinh, lên men, phân tích và chế biến thực phẩm

Với các kết quả đã đạt được, đề tài mong muốn tiếp tục được nghiên cứu hoàn thiện công nghệ, dây chuyền thiết bị sản xuất và thực hiện các thử nghiệm lâm sàng tác dụng chức năng của các sản phẩm β-caroten, MELs và SAM đối với sức khoẻ con người Để có thể đưa các sản phẩm β-caroten, MELs và SAM ra được thị trường, đề tài mong muốn Bộ Khoa học và Công nghệ ủng hộ để thực hiện Dự án sản xuất trong giai

đoạn 2007-2010

Mục lục

1.1 Giới thiệu về carotenoit và β-caroten 4

1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten trên thế giới 10

1.1.4.3 Quá trình tổng hợp β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora 21 1.1.5 ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh

tổng hợp β-caroten của Blakeslea trispora

21

1.2 giớI thiệu về chất hoạt động bề mặt sinh học

glycolipit mannosylerythritol lipit (MELs )

32

1.2.2.2 Mét sè qu¸ tr×nh s¶n xuÊt glycolipit 38

1.2.3.5 Nh÷ng nghiªn cøu vµ øng dông trong c«ng nghiÖp thùc phÈm vµ

1.3.5.1 T×nh h×nh nghiªn cøu s¶n xuÊt vµ øng dông SAM trªn thÕ giíi 68

1.3.5.2 T×nh h×nh nghiªn cøu s¶n xuÊt vµ øng dông SAM ë ViÖt Nam 69

nghiªn cøu

71

2.1.4 Tæng hîp c¸c th«ng tin vÒ c¸c chñng gièng vi sinh vËt nhËp ngo¹i 75

2.2.1 C¸c ph−¬ng ph¸p xö lý dÞch lªn men, t¸ch chiÕt sinh khèi nÊm sîi,

ph©n tÝch vµ t¹o s¶n phÈm chÊt mµu β-caroten tõ nÊm sîi

Blakeslea trispora

76

2.2.2 C¸c ph−¬ng ph¸p thu nhËn, t¸ch chiÕt, ph©n tÝch vµ t¹o s¶n phÈm

MELs tõ nÊm men Pseudozyma

77

2.2.3 C¸c ph−¬ng ph¸p thu nhËn, t¸ch chiÕt, ph©n tÝch vµ t¹o s¶n phÈm

chøa SAM tõ nÊm men Saccharomyces

3.1 KÕt qu¶ nghiªn cøu, s¶n xuÊt vµ øng dông chÊt

mµu β-caroten tõ nÊm sîi Blakeslea trispora

92

3.1.1 Kh¶o s¸t, lùa chän vµ nghiªn cøu n©ng cao ho¹t tÝnh tæng hîp

β-caroten cña c¸c chñng nÊm sîi Blakeslea trispora

92

3.1.1.1 Kh¶o s¸t kh¶ n¨ng ph¸t triÓn vµ sinh tæng hîp β-caroten tõ c¸c

chñng nÊm sîi B trispora trªn m«i tr−êng nh©n gièng vµ lªn men

92

cơ bản

3.1.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện

nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten của các chủng B

3.1.1.3.1 Nghiên cứu bổ sung một số chất đặc biệt như chất hoạt động bề

mặt, tiền chất có cấu trúc vòng β

107

3.1.1.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp β-caroten của chủng B

trispora WH2 bằng phương pháp xử lý đột biến

108

3.1.1.4 Kết quả nuôi cấy các chủng nấm sợi B trispora trên môi trường và

điều kiện nuôi cấy chọn lọc quy mô phòng thí nghiệm

111

3.1.2 Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô

phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm sợi giàu β-caroten

3.1.3 Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích

và tạo sản phẩm bột màu thực phẩm β-caroten từ nấm sợi

Blakeslea trispora quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực

3.1.3.3 Thu hồi dung dịch đậm đặc và tạo sản phẩm β-caroten tan trong

dầu

119

3.1.3.4 Nghiên cứu các điều kiện công nghệ để tạo sản phẩm bột màu thực

phẩm β-caroten từ nấm sợi B trispora quy mô phòng thí nghiệm

và xưởng TN

120

3.1.3.4.1 Tạo vi nang bằng phương pháp bốc hơi dung môi 120

3.1.3.4.3 Tạo bột β-caroten bằng công nghệ vi nang hoá : nhũ hoá - sấy

phun

127

3.1.4 Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm bột màu β-caroten từ

nấm sợi Blakeslea trispora quy mô xưởng thực nghiệm trên các hệ

thống thiết bị lên men dung tích 500 và 1500 lít

131

3.1.5 Kiểm tra, phân tích các chỉ tiêu, chất lượng vệ sinh an toàn thực

phẩm của sản phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora

134

3.1.6 Nghiên cứu ứng dụng chất màu β-caroten từ nấm sợi Blakeslea

trispora trong chế biến, sản xuất một số loại bánh, bánh kem, kẹo

quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp

137

3.1.7 Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và

ứng dụng sản phẩm bột màu β-caroten từ vi sinh vật Đăng ký, giới

thiệu, chào bán công nghệ và sản phẩm

140

3.2 Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất

nhũ tương hoá và hoạt động bề mặt glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs)

143

3.2.1 Khảo sát lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính của các chủng

giống nâm men sinh tổng hợp chuyển hóa glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs)

143

3.2.1.2 Xác định đặc tính sinh lý sinh hoá của chủng nấm men lựa chọn 146 3.2.1.3 Nghiên cứu điều kiện nâng cao hoạt tính các chủng giống nấm

men sinh tổng hợp glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs)

149

3.2.2 Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men quy mô phòng

thí nghiệm và xưởng thực nghiệm để sinh chuyển hóa MELs

151

3.2.2.1 Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men sinh chuyển

hóa MELs quy mô máy lắc

nghiệm để tách chiết, tinh sạch, phân tích MELs

3.2.3.1 Xác định điều kiện tách chiết - Lựa chọn dung môi thích hợp 159

3.2.6 Nghiên cứu ứng dụng MELs từ nấm men trong chế biến sản xuất

một số bánh, bánh kem quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công

nghiệp

169

3.2.7 Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và

ứng dụng các sản phẩm MELs trong chế biến một số mặt hàng

thực phẩm

169

3.3 Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng

S-adenosyl L – methionil (SAM) từ nấm men

Saccharomyces cerevisiae

171

3.3.1 Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp

S-adenosyl L – methionil (SAM) của các chủng nấm men

3.3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện

nuôi cấy nấm men Saccharomyces tổng hợp SAM trong điều kiện

phòng thí nghiệm

173

3.3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường 173 3.3.1.2.2 Khảo sát chế độ thông khí trong nuôi cấy nấm men tổng hợp SAM 174

3.3.2 Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô

phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm

men chứa SAM

175

3.3.2.1 Nghiên cứu động học quá trình phát triển tổng hợp SAM của nấm

men Saccharomyces trên qui mô máy lắc và thiết bị lên men 14 lít

175

3.3.2.3 Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men 80 lít tại Xưởng thực

nghiệm

181

3.3.2.4 Kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn c«ng nghÖ lªn men tæng hîp SAM tõ nÊm

men S cerevisiae t¹i X−ëng thùc nghiÖm trªn c¸c thiÕt bÞ lªn men

500 vµ 1500 lÝt

182

3.3.3 Nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn t¸ch chiÕt, trÝch ly, tinh s¹ch, ph©n tÝch

vµ t¹o c¸c s¶n phÈm chøa SAM tõ nÊm men quy m« phßng thÝ nghiÖm vµ x−ëng thùc nghiÖm

183

3.3.3.1 Kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn t¸ch chiÕt SAM tõ nÊm men

Saccharomyces

183

3.3.3.3 Nghiªn cøu thu håi vµ t¹o s¶n phÈm SAM tõ nÊm men

Saccharomyces

193

3.3.4 Hoµn thiÖn c«ng nghÖ vµ s¶n xuÊt chÕ phÈm chøa SAM tõ nÊm

men S cerevisiae quy m« x−ëng thùc nghiÖm trªn c¸c hÖ thèng

thiÕt bÞ lªn men dung tÝch 500 vµ 1500 lÝt

198

3.3.5 Ph©n tÝch, kiÓm tra chÊt l−îng vÖ sinh an toµn thùc phÈm cña c¸c

s¶n phÈm chøa SAM

200

cerevisiae trong chÕ biÕn, s¶n xuÊt mét sè lo¹i b¸nh kÑp kem quy

m« phßng thÝ nghiÖm vµ quy m« c«ng nghiÖp

201

3.3.7 Nghiªn cøu tÝnh to¸n gi¸ thµnh, hiÖu qu¶ kinh tÕ trong s¶n xuÊt vµ

øng dông c¸c s¶n phÈm SAM tõ vi sinh vËt trong chÕ biÕn mét sè mÆt hµng thùc phÈm

c¸c ch÷ viÕt t¾t

mở đầu

Chất lượng của sản phẩm thực phẩm không những bao hàm giá trị dinh dưỡng mà còn bao hàm cả giá trị cảm quan trong đó mầu sắc là một chỉ số quan trọng Mầu sắc của sản phẩm thực phẩm không chỉ có giá trị về mặt hình thức mà còn có tác dụng về mặt sinh lí rõ rệt vì mầu sắc thích hợp sẽ giúp cơ thể đồng hoá thực phẩm đó dễ dàng Do đó trong chế biến thực phẩm người ta thường bổ sung chất màu để làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm

Carotenoit là nhóm chất màu lớn nhất trong tự nhiên Màu đặc trưng của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là dải màu từ vàng đến đỏ là do các hợp chất carotenoit tạo thành Trong các hợp chất carotenoit thì β-caroten được quan tâm nhiều nhất do các đặc tính sinh lý quý báu như tiền chất của vitamin A, chống oxy hoá, ngăn ngừa bệnh ung thư, giảm nguy cơ các bệnh tim mạch, giảm các bệnh về mắt… Một phân tử β-caroten sau khi thuỷ phân cho hai phân tử vitamin A Vì vậy, β-caroten được đánh giá là hợp chất có hoạt tính sinh học cao và quan trọng nhất trong nhóm carotenoit

Mặt khác vấn đề an toàn thực phẩm đang trở thành mối quan tâm của toàn cầu hiện nay ở Việt nam tình trạng ngộ độc thức ăn ngày càng tăng Theo kết quả điều tra vệ sinh dịch tễ của Bộ Y tế Việt Nam cho thấy 90% chất mầu sử dụng cho thực phẩm hiện nay trên thị trường là không được phép Tình trạng trên cho thấy việc sử dụng chất mầu độc hại đang lan tràn trên thị trường

Có thể thu nhận chất mầu bằng các con đường: tổng hợp hoá học, khai thác từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, từ vi sinh vật Chất mầu có nguồn gốc tự nhiên ngày càng

được các công trình khoa học khuyến cáo nên dùng Những công trình này đã chỉ những

ưu thế của chất mầu tự nhiên: chịu được nhiệt độ, ánh sáng, có khả năng ngăn ngừa quá trình oxy hoá và đặc biệt là không ảnh hưởng tới sức khoẻ của con người

Trong thực tế, β-caroten có thể nhận được bằng tổng hợp hoá học, tách chiết từ thực vật hay sản xuất từ vi sinh vật Trên thế giới đã có một số nước như Đức, Hàn Quốc, Italia, Nhật, Anh, Nga, Australia, Bồ Đào Nha, Hy Lạp, Trung Quốc …có nghiên cứu sản xuất carotenoit, đặc biệt là β-caroten từ vi sinh vật như vi tảo, nấm men đỏ ở một số nước, nấm men đỏ đã được nghiên cứu tạo bột nấm men giàu protein-carotenoit ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô thực nghiệm để bổ sung vào thành phần thức ăn cho gia cầm

Trong các nguồn vi sinh vật có thể sử dụng để sản xuất β-caroten, loài nấm sợi Blakeslea trispora được chú ý nhất vì khả năng sinh tổng hợp carotenoit với hàm lượng β-

caroten cao (85-95% carotenoit) và có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp với nguồn

nguyên liệu rẻ tiền Hiện tại, β-caroten được sản xuất từ nấm sợi Blakeslea trispora trên

qui mô công nghiệp ở một vài quốc gia như Nga, Ukaraina, Hà Lan, Trung Quốc… Năng suất 400-2000 tấn β-caroten tinh khiết/năm

Hiện nay thị trường thế giới đòi hỏi một nhu cầu lớn về chất hoạt động bề mặt Glycolipit là nhóm phổ biến nhất trong các chất hoạt động bề mặt sinh học được sinh tổng

hợp bởi vi sinh vật thuộc tất cả các nhóm vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc Các vi

sinh vật này có khả năng chuyển hoá hydratcarbon, n- alkan (C10- C20), chất béo (C10-

C22) thành glycolipit Có nhiều nghiên cứu đã công bố về Candida bombicola có khả năng sản xuất sophorose lipit, Rhodococcus erythropolis sản xuất trehalose lipit, Pseudomonas sp sản xuất ra rhamnose lipit, Acinetobacter calcoaceticus sản xuẩt ra emulsan (lipoheteropolysaccharide), Candida antarctica, Ustilago maydis, Kurtzmanomyces sp có khả năng sản xuất mannosylerythritol lipit (MELs)

Các hợp chất trên có đặc điểm giống nhau là có cấu trúc gồm 2 cấu phần: phần ưa nước (hydrophylic) và phần kị nước (hydrophorbic) Do đó glycolipit có tính chất là chất nhũ tương và huyền phù hóa, và là chất hoạt động bề mặt Những ưu thế của các chất này

so với các chất tổng hợp hoá học là xuất phát từ tự nhiên, chịu phân huỷ sinh học, có tính

năng hoạt động tốt ở rải pH và nhiệt độ rộng, đa dạng và không có tính độc Do vậy chất hoạt động bề mặt sinh học có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau

Trong công nghiệp thực phẩm chất hoạt động bề mặt sinh học được sử dụng như chất nhũ tương hoá Quá trình nhũ tương hoá đóng vai trò quan trọng trong việc đồng hoá các thành phần, tạo độ đặc và kết cấu của sản phẩm Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ,

chúng có tính làm nhũ tuơng hoá những mô mỡ vỡ trong bột nhào Glycolipit từ Candida utilis được sử dụng trong nước trộn salát

Rất nhiều sản phẩm có hoạt tính sinh học được tổng hợp nhờ công nghệ lên men Một

trong số các hoạt chất này là S - adenosyl L- methionil (SAM) - được tổng hợp nhiều

trong nấm men SAM tham gia vào trên 40 phản ứng sinh hoá và còn là nguồn dược liệu quý trong lĩnh vực Y - Dược SAM được sử dụng để điều trị một số bệnh như suy nhược lâm sàng, làm giảm nguy cơ ung thư ruột và gan và có vai trò quan trọng ngăn ngừa bệnh tim, viêm khớp, chứng đột qụy và thiểu năng thần kinh…

Tuy vậy cho đến nay SAM mới chỉ được ưa sử dụng ở một số nước phát triển như

Mỹ, ý và một số nước Châu âu khác vì giá thành của sản phẩm rất cao Còn ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào cũng như chưa có nơi nào sản xuất SAM

Để tạo ra các sản phẩm bột màu β-caroten tự nhiên, chất hoạt động bề mặt glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs) và dẫn xuất của axít amin S - adenosyl L – methionil

(SAM) có nguồn gốc từ vi sinh vật, đề tài KHCN cấp Nhà nước KC-04-27 đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

1 Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp β-caroten của các

chủng nấm sợi Blakeslea trispora, các chủng nấm men sinh tổng hợp chuyển hoá

glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs) và các chủng nấm men sinh tổng hợp S-adenosyl L – methionil (SAM);

2 Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô phòng thí nghiệm

và xưởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm sợi giàu β-caroten, sinh tổng hợp chuyển hoá MELs và sinh khối nấm men chứa SAM;

3 Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích và tạo sản phẩm

bột màu thực phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora; chất hoạt động bề mặt

sinh học MELs và các sản phẩm chứa SAM từ nấm men quy mô phòng thí nghiệm

và xưởng thực nghiệm;

4 Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm bột màu β-caroten, MELs và chế phẩm chứa SAM từ vi sinh vật quy mô xưởng thực nghiệm trên các hệ thống thiết

bị lên men dung tích 500 và 1500 lít;

5 Kiểm tra, phân tích các chỉ tiêu, chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản

phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora; MELs và SAM từ nấm men;

6 Nghiên cứu ứng dụng chất màu β-caroten, MELs và SAM từ nấm men trong chế biến, sản xuất một số loại bánh, bánh kem, kẹo quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp

7 Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và ứng dụng các sản phẩm β-caroten, MELs và SAM từ vi sinh vật trong chế biến một số mặt hàng thực phẩm Đăng ký, giới thiệu, chào bán các công nghệ và sản phẩm β-caroten, MELs và SAM từ vi sinh vật

Chương 1

tổng quan

1.1 Giới thiệu về carotenoit và β-caroten

1.1.1 Khái quát về carotenoit và β-caroten

Carotenoit là nhóm chất màu isoterpen không no, không tan trong nước, tan trong

chất béo, có màu từ vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65 - 70 sắc tố tự nhiên, và là một trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm Carotenoit thường được phân làm 2 nhóm Thứ nhất là nhóm các caroten hydrocacbon như là β-caroten, torulen và nhóm còn lại là xantophyl bị ôxy hoá như là torularhodin và astaxantin (Sutter và Whitaker 1981)

Bản chất tự nhiên của carotenoit là các hợp chất tetratecpen (C40H56) chứa 8 gốc isoprene (Lampila và cộng sự, 1985) Cấu trúc cơ bản của các carotenoit là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon được cấu thành từ 8 đơn vị 5-cacbon isoprenoit liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm, một số khác chứa các vòng sáu cạnh, còn một số khác nữa chứa thêm oxy như các gốc rượu, aldehyde, ketone, carboxylic, epoxide Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen Chính cấu trúc này đã tạo nên các đặc tính quan trọng như: dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng (đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất (màu càng

đậm khi hệ thống dây nối càng dài) (Sutter và Whitaker 1981)

Từ cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: cộng hợp H2 hoặc dehydro hoá, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt thành nhiều chuỗi nhỏ…Tạo nên một lượng lớn các cấu trúc khác nhau Kết quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã được tách chiết và xác định đặc tính Một số cấu trúc chính của các ca rotenoit như lycopen, caroten được trình bày ở hình 1.1.1

Lycopen: Lycopen có trong quả cà chua, dưa hấu, nho hồng và ổi Mầu đỏ của cà

chua chín chủ yếu là do có mặt của lycopen mặc dầu trong cà chua còn một loạt trong các carotenoit khác nữa Trong quá trình chín, hàm lượng lycopen trong cà chua tăng lên 10 lần Tuy nhiên chất mầu này không có hoạt tính vitamin Lycopen là tiền β-caroten, nó có tác dụng chống lại ung thư tuyến tiền liệt, có tác dụng chống oxy hoá mạnh Trong cơ thể tuyến tiền liệt, tinh hoàn, ngực là nơi chứa nhiều lycopen Lycopen có ở dạng cis và trans, Bằng cách tạo vòng ở một đầu hoặc cả hai đầu của phân tử lycopen thì sẽ được các đồng phân α, β, γ-caroten

Caroten: Trong các loại rau quả như cà rốt, quả mơ, bí ngô, bắp cải, rau spinach có chứa

nhóm caroten Trong nhóm caroten thì β-caroten có vai trò quan trọng nhất, α-caroten có cấu trúc rất giống β-caroten, chỉ khác nhau ở vị trí nối đôi Hiện nay các nghiên cứu chỉ tập trung vào β-caroten, chỉ biết một chút về α-caroten Những test thử đã cho thấy α-caroten có thể có hiệu quả hơn β-caroten trong việc chống lại các tác nhân gây ung thư Một nghiên cứu về dịch tễ học cho rằng nếu đưa vào cơ thể một lượng α-caroten lớn có khả năng giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư phổi

Crypthoxanthin: Crythoxanthin có công thức nguyên là C40H56O (3 hoặc 4- hydroxyl-β-caroten) Màu da cam rất đẹp của quýt, của cam chủ yếu là do

crypthoxanthin

Trong số các hợp chất carotenoit, α, γ, β-caroten và crypthoxanthin là những tiền chất vitamin A quan trọng, cung cấp vitamin A cho cơ thể người và động vật Một phân tử γ, α-caroten và crypthoxathin vào cơ thể động vật, sau khi thuỷ phân cho một phân tử vitamin A, nhưng một phân tử β-caroten sau khi thuỷ phân cho hai phân tử vitamin A Vì vậy β-caroten được đánh giá là chất có hoạt tính sinh học mạnh và quan trọng nhất của nhóm các carotenoit (Young và cs, 2003)

1.1.2 Tính chất, chức năng và ứng dụng của β-caroten

1.1.2.1 Tính chất của β-caroten

- Công thức hoá học của β-caroten C40H56 Khối lượng phân tử: 536,88

- β-caroten là một dẫn xuất isoprene chưa bão hoà β-caroten có dạng tinh thể hình kim, màu nâu đỏ

- β-caroten bền trong môi trường kiềm và không bền trong môi trường axít

- β-caroten tan trong dầu và các dung môi hữu cơ như axeton, etyl-ete, metanol v.v…đặc biệt tan tốt trong dầu, ête, hecxan, β-caroten không tan trong nước

- Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-caroten có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxi hoá, đồng phân hoá khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt

độ

- Quang phổ hấp thụ cực đại của β-caroten là ở 450 nm [Goodwin, 1980]

Trong tự nhiên, cơ thể sinh vật có thể tự tổng hợp carotenoit nhằm mục đích bảo vệ, chống lại các tác động bên trong (bao gồm các gốc tự do) và bên ngoài (tia tử ngoại ánh sáng mặt trời v.v ) Người và động vật không xương sống sử dụng 50 trong 600 hợp chất carotenoit để tổng hợp chuyển đổi thành vitamin qua niêm mạc ruột vào gan và nhiều tổ chức cơ thể khác Trong số các carotenoit này β-caroten có hoạt tính sinh học cao hơn

hẳn, gấp 2-3 lần so với các carotenoit khác [Ausich, 1997] và có rất nhiều chức năng và ứng dụng như:

- β-caroten tham gia vào quá trình tạo sắc tố (tiền Vitamin A)

- Các hợp chất carotenoit, caroten tan trong nước hoặc tan trong dầu được dùng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, tạo màu hoặc chuẩn hoá màu của magarin, dầu

ăn, bơ, trong các sản phẩm nước giải khát, bắp rang, các loại súp đóng hộp, bánh kẹo, kem, mỳ ăn liền

- Là chất dinh dưỡng chống oxi hoá có tác dụng điều hoà sự đáp ứng miễn dịch trong cơ thể bằng cách trao đổi thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc

và chức phận của màng tế bào và tăng sự đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể

- Làm tăng hiệu quả sinh sản do có khả năng tăng cường quá trình tổng hợp một số hoocmon giới tính

- Ngoài ra β-caroten còn ngăn cản quá trình tạo khối u, gây đột biến và trao đổi nhiễm sắc thể chị em, làm giảm các nguy cơ của bệnh tim mạch, động mạch vành cũng như đột quỵ

- Do là một loại sắc tố nên β-caroten tham gia vào phản ứng quang hoá tăng cường

hoạt động của một số enzim ví dụ như cytochrom P450

Cơ chế chống oxi hoá :

Trong cơ thể, carotenoit nói chung và β-caroten nói riêng có khả năng triệt tiêu các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây chuyền Nhờ có hệ thống nối liên hợp, nó vô hiệu hoá phân tử oxi bị kích hoạt (1O2) Một phân tử β-caroten có thể hấp thụ năng lượng của hàng ngàn phân tử 1O2 rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại

1

O2 + β-caroten ặ β-caroten * + β-caroten *ặ β-caroten + Q( vô hại)

Nhờ có những đặc tính ưu việt như vậy, β-caroten được ứng dụng trong rất nhiều trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và trong y tế Beta-caroten

được sử dụng phổ biến làm chất màu trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm, là nguồn bổ sung chất dinh dưỡng quan trọng trong khẩu phần ăn Để đáp ứng nhu cầu về β-caroten

có thể sử dụng 2 phương pháp sản xuất chính Đó là sản xuất theo con đường hoá học và sản xuất theo con đường sinh học Sản phẩm β-caroten tổng hợp theo con đường nhân tạo chỉ có một loại đồng phân duy nhất trong khi đó sản phẩm β-caroten tổng hợp theo con

đường tự nhiên không những có chứa β-caroten mà còn có α-caroten và γ-caroten do đó

hệ số tiêu hoá của sản phẩm caroten tổng hợp nhân tạo chỉ bằng 10% hệ số của caroten tổng hợp theo con đường tự nhiên Hơn nữa, hoạt tính sinh học của sản phẩm tự nhiên cao hơn so với hoạt tính sinh học của sản phẩm tổng hợp

Trong lĩnh vực dược phẩm và y học, β-caroten được coi là một loại biệt dược rất hữu hiệu trong việc phòng, chữa trị các bệnh nan y và còn được coi như một liều thuốc làm tăng tuổi thọ cho loài người Những nghiên cứu gần đây cho thấy β-caroten nhân tạo có liên quan đến hiện tượng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ ưng thư trong khi đó thì β-caroten tự nhiên lại có khả năng chống lại sự sai khác này do đó có khả năng ngăn ngừa được bệnh ưng thư Tính độc của β-caroten cũng được quan tâm nhiều, đối với các sản phẩm tự nhiên do có thêm một số các đồng phân khác nên không gây độc tính dù sử dụng với liều lượng cao trong khi đó β-caroten tổng hợp hóa học lại chỉ bao gồm toàn bộ cấu hình trans nên gây độc khi sử dụng với liều cao Vì vậy xu hướng hiện nay chủ yếu tập trung vào sản xuất β-caroten theo con đường sinh tổng hợp tự nhiên.

Đối với β-caroten khi ở dạng tiền vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da để chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại Người ta khuyên nên dùng bổ sung β-caroten trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời Nó có thể giúp da phòng chống không những các tia tử ngoại gây hại mà còn phòng chống lại bệnh ung thư da khi dùng trong thời gian dài

Dựa trên các nghiên cứu những gốc tự do người ta thấy rằng, gốc tự do là một phân tử nguy hiểm, bởi vì nó không bền và hoạt động mạnh Nó có khả năng kết hợp rất nhanh

đối với các phân tử khác đặc biệt là lipid và có thể gây nên một phản ứng dây chuyền cực

kỳ nguy hiểm đối với tế bào Chính các gốc tự do này là nguyên nhân gây nên phản ứng

dị ứng, ung thư, các bệnh tim mạch, tai mũi họng, da, niệu bộ, các trạng thái suy nhược, mệt mỏi, giảm trí nhớ, giảm khả năng tư duy, quá trình lão hoá Cùng với vitamin C, E,

đồng, mangan, thì vitamin A và β-caroten có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do này (Young và cs 2003)

Đối với động vật có vú, β-caroten giữ chức năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể như: phát triển thị giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản

và tạo tinh trùng Tác động chủ yếu của carotenoit không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi thông tin từ tế bào này đến tế bào khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể Chính vì vậy mà carotenoit

được xác định là chất điều hoà dinh dưỡng

Đặc biệt β-caroten không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài Dùng vitamin A kéo dài và liều cao sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan Nguyên nhân là do cơ thể chuyển hoá β-caroten chuyển thành vitamin A khi có nhu cầu Chỉ 1/6 lượng β-caroten chuyển thành vitamin A [Goodwin, 1980]

β-caroten có hai đồng phân: trans β-caroten và cis β-caroten, trong đó trans β-caroten

có thể chuyển thành dạng cis β-caroten Trong hai đồng phân trên thì trans β-caroten có vai trò rất quan trọng do cơ thể con người có thể hấp thụ được Hiện tại các nghiên cứu chỉ ra sử dụng β-caroten tự nhiên (có cả dạng cis và trans) tốt hơn là sử dụng β-caroten tổng hợp bằng con đường hoá học chỉ chứa dạng trans

Bác sĩ Phillip Gaffney là một nhà khoa học hàng đầu ở bệnh viện Royal Brisbane đã khám phá ra rằng nếu người bệnh được cung cấp β-caroten đã làm tăng mức HDL (HDL

là dạng rất tốt của cholesterol) giảm rủi ro cho các bệnh về tim mạch Một nghiên cứu khác với 22000 bác sĩ nam được cung cấp β-caroten đã giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch hơn hẳn nhóm không được cung cấp β-caroten [Goodwin, 1980]

thay đổi này có thể bị gây ra bởi virus, môi trường, đề kháng yếu, yếu tố về gen, tất cả các yếu tố trên xuất hiện trên cơ thể chúng chưa phát triển đến khi có những tác động của

điều kiện môi trường chúng mới phát triển mạnh mẽ Sự đột biến này xẩy ra ở một tế bào hoặc một nhóm các tế bào Các tế bào này tự nhân lên đến khi tạo thành một vùng lớn của chuỗi gây bệnh Sau một thời gian các tế bào ung thư phát triển ở khắp mọi nơi trên cơ thể theo hệ thống bạch cầu hoặc đường máu Ung thư phổi khó phát hiện hơn ung thư da do chúng phát triển ở bên trong cơ thể rất khó phát hiện hoặc cảm thấy được trên cơ thể người bệnh Có hàng trăm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, trong đó tế bào được cho tiếp xúc với những chất gây ung thư, virus và các tia phóng xạ Vitamin A và β-carotencho thấy chúng có khả năng ngăn cản các tế bào chuyển thành các tế bào gây ung thư [Goodwin, 1980]

β-caroten cũng có những tác dụng chống ung thư riêng cho nó, không phụ thuộc vào vitamin A Các nghiên cứu invitro đã cho thấy rằng β-caroten và capthaxanthin (một carotenoit không phải tiền chất của vitamin A) có tác dụng ức chế sự chuyển sang dạng

CH2OH Carotenase

2

Vitamin A

tân sản của các tế bào invitro dưới tác dụng của các tác nhân vật lý và hoá học Điều này

có nghĩa là tác dụng chống oxy hoá là một tính chất quan trọng của các carotenoit

Trong các nghiên cứu trên động vật, vitamin A cũng cho thấy sự ngăn cản sự thành

lập khối u trên động vật thử nghiệm khi tiếp xúc với các chất gây ung thư và làm chậm lại

sự phát triển của khối u đã bị biến đổi

Ngoài bệnh ung thư phổi, rất nhiều nghiên cứu trên những tập thể người sống ở khắp

nơi trên thế giới từ Mỹ, Anh, Nhật, Phần Lan…đã cho thấy mối liên hệ giữa nguồn thực

phẩm giàu vitamin A và β-caroten với tỉ lệ thấp mắc các bệnh ung thư khác như: ung thư

khí quản, màng trong dạ con, bàng quang, cổ tử cung, vú, tuyến tiền liệt, trực tràng, manh

tràng và dạ dày, kể cả melanoma (một loại ung thư da nguy hiểm) Các kết quả thay đổi từ

giảm 8 lần trong ung thư phổi đến giảm 80% trong ung thư cổ tử cung

1.1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten

β-caroten sản xuất theo con đường hoá học hiện nay chiếm khoảng 70%- 80% sản

lượng trên thế giới, tập trung chủ yếu ở: Thuỵ sỹ, Mỹ (Công ty Hofmanroche) và ở Đức

(Công ty Basf) Sản lượng của các nhà máy này được xây dựng vào những năm đầu của

thập kỷ 90 đạt khoảng 400- 500 tấn/năm β-caroten tinh khiết 98% Các nghiên cứu trích

ly β-caroten từ nguyên liệu thực vật đã được nghiên cứu và sản xuất với quy mô nhỏ tại

Mỹ, Nhật, Phần Lan, Anh từ các loại cà rốt chuyển gene chứa khoảng 5,2-12,2

mg/100gam cà rốt tươi, dầu cọ chứa hàm lượng carotenoit khoảng 5mg/100gam dầu cọ thô

với khoảng 1/2 là β-caroten và α-caroten

Trên thế giới ở một số nước: Đức, Hàn Quốc, ý, Nhật, Anh, Nga, úc, Bồ Đào Nha,

Hy Lạp, Trung Quốc…đã có những nghiên cứu sản xuất carotenoit đặc biệt là β-caroten

từ vi sinh vật Một số vi tảo như tảo lam Dunaliella salina, Heamatococcuss pluvialis,

Mantoniella squamata đã được nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết các hợp chất carotenoit có

chứa β-caroten và các dẫn xuất như: asthaxanthin, zeaxanthin, violaxanthin (Công ty

Nutralite Ltd, Microalgae International Company, Cyanotech INC- Mỹ; Betatene Ltd,

Western Biotechnology- úc) Các chủng nấm men tự nhiên hoặc là gây đột biến có sắc tố

đỏ như: Rhodotorula glutinis, R Mucilaginosa, R rubra cũng được nghiên cứu nhiều ở

các nước như: ấn Độ, Canada, Pháp, Nga song còn gặp nhiều hạn chế (Lampila và cs

1985)

β-caroten đã được tổng hợp sinh học từ nấm sợi Blakeslea trispora trên qui mô pilot

và quy mô công nghiệp ở Nga, Ukaraina, Hà Lan, Trung Quốc… Năng suất 400-2000 tấn

β-caroten tinh khiết/năm Hiệu suất tổng hợp β-caroten đạt 900-1200 mg/lít trong phòng

thí nghiệm và 1350-3500 mg/lít ở quy mô công nghiệp Sản phẩm bột màu từ vi sinh vật

đã được thương mại hoá ở Châu âu, Trung Quốc và đã được công nhận là chất màu thực phẩm, chất vi dinh dưỡng và được sử dụng với liều lượng không hạn chế (trên 5% trong thực đơn bữa ăn) (Tài liệu của HĐ thực phẩm Châu âu, 2000)

1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten ở Việt Nam

ở Việt Nam, các nghiên cứu thu nhận β- caroten như tiền vitamin A từ các nguồn thực vật như gấc, vi sinh vật như tảo, nấm men đã được bắt đầu từ những năm 70-80 của thế kỷ trước và vẫn được tiếp tục trong những năm gần đây (Lâm Xuân Thanh, 2003)

Công ty TNHH chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam (VNPOFOOD) Đại

diện tại Tp.HCM là Công ty Dược phẩm Quận 10 đã sản xuất dầu gấc viên nang

VINAGA chiết xuất từ gấc có chứa β-caroten 1,5 mg/g và lycopen 0,12 mg/g

Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Trung tâm Dinh dưỡng Trẻ em Tp.HCM đã nghiên cứu

nuôi cấy tảo Spirulina có hàm lượng β-caroten 1,7 mg/g sinh khối khô và Viện Công nghệ Sinh học nuôi cấy tảo Dunaliella salina 5,4mg/g β-caroten trên quy mô phòng thí nghiệm

(Nguyễn Ngọc Doãn và Lê Văn Tri, 1998)

Viện Công nghiệp thực phẩm trong những năm gần đây đã tiến hành một số các đề

tài cấp Bộ Công nghiệp nghiên cứu tổng hợp màu đỏ từ nấm mốc đỏ Monascus sp theo phương pháp bề mặt trong bình tam giác qui mô phòng thí nghiệm; nghiên cứu tổng hợp

và tạo chế phẩm bột giàu protein - carotenoit từ nấm men đỏ Rhodotorula sp theo phương

pháp lên men chìm ở máy lắc hoặc các bình thuỷ tinh dung tích 10 lít có sục khí Tuy nhiên, hàm lượng chất màu, β-caroten tách chiết từ sinh khối vi sinh vật còn rất thấp và chưa có các nghiên cứu tạo được chất màu thương phẩm (Phạm Việt Cẩm và Nguyễn Ngọc Tú, 2000; Phan Tố Nga và Phan Thị Sửu, 2001)

Gần đây Viện Lúa ĐBSCL đã thông báo chọn lựa được nhiều dòng lúa mà trong phôi nhũ có hàm lượng caroten cao Những dòng lúa này đang được khảo nghiệm trên diện rộng, hy vọng những năm tới sẽ có những giống lúa vừa cho năng suất cao vừa giàu vitamin A (Le T Vuong, 2000)

1.1.4 Giới thiệu về nấm sợi Blakeslea trispora

1.1.4.1 Giói thiệu chung chung về nấm sợi Blakeslae trispora

Nấm sợi Blakeslea trispora thuộc Lớp Nấm tiếp hợp, Ngành Nấm tiếp hợp, Bộ

Mucorales theo sơ đồ phân loại trình bày ở hình 1.1.2 (Mantzouridou và cs, 2002)

Lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes

Năm 1973 theo hệ thống của Takhtadjan giới nấm mới được công nhận (Hesseltine

và Ellis)

Ngành nấm tiếp hợp có hai lớp nấm là Zygomycetes và Trichomycetes Lớp nấm Zygomycetes chỉ chiếm 1% trong giới nấm và sự dụng nguồn cácbon chủ yếu là đường và tinh bột Theo từ điển của nấm mốc, Zygomycetes bao gồm 10 bộ, 32 họ, 124 chi, 870

loài (Thaxter 1914) Trong đó 2 bộ Basidiobolales và Mortierellales đã được miêu tả bởi

Cavalier-Smith, tám bộ còn lại đã được thảo luận và minh họa trong các bài báo của Benjamin (1966, 1979), Benny và Donnell (1978) Đặc điểm của lớp nấm này là hữu tính,

hệ sợi không có vách ngăn, phổ biến ở bộ Mucorales và Zoopagales, nhưng hệ sợi có vách ngăn lại phổ biến ở bộ Dimargaritales và Kickxellales (Benny 2001) Sinh sản vô

tính thường ở các loài không chuyển động, bào tử đơn bào trong các nang bào tử là đa hoặc đơn bào

Họ Choanephoraceae

Theo Hesseltine và Ellis (1893) họ Choanephoraceac chỉ có một chi là Choanephora

Sau đó một số tác giả đã tìm ra một vài chi trong các họ sau không có mối liên hệ với nhau Cunninghamella (Cunninghamellaceae), Radiomyces (Radiomycetaceae), Cokeromyces (Thamnidiaceae), Mycotypha (Mycotyphaceae) và Gilbertella (Gilbertellaceae), Rhopalomyces (Helicocephabidaceace), Simoideomyces và Thamnocephalis (Sigmoideomycetaceae) (Kirk 1984, Kirk và cs 2001) Sau một quá trình sắp xếp thì hiện nay họ Choanephoraceac gồm hai chi là Blakeslea và Choanephora

Giới : Nấm (fungi)

Ngành: Nấm tiếp hợp (Zygomycota)

Lớp: Nấm tiếp hợp (Zygomycetes)

Bộ: Mucorales

Chi: Blakeslea Họ: Choanephoraceae

Loài: trispora

Hình 1.1.2 Sơ đồ phân loại nấm sợi Blakeslea trispora

Chi Blakeslea

Blakeslea có hai loại nang bào tử tách ra từ cuống nang Nang bào tử lớn chứa từ 1-8

nang bào tử nhỏ hình cầu Có đường nối giữa thành tế bào và các bào tử trong các bào tử nhỏ vì vậy các bào tử dễ dàng tách ra khỏi vỏ nang, thậm chí khi chỉ có một bào tử trong

đó Các bào tử hình ô van dài, có sắc tố, có khía, có râu ở hai đầu bào tử, bào tử sinh ra bằng sinh sản hữu tính hoặc vô tính (Thaxter 1914)

Các loài của Blakeslea bao gồm:

- Blakeslea monospora do Mehrotra và Baijal (1968) phân lập được tại ấn Độ và

Đài Loan

- Blakeslea sinensis do Zheng và Chen (1986) phân lập ở hoa và đất tại Trung Quốc

- Blakeslea trispora do Thaxter (1914) phân lập được đầu tiên từ loài sâu gây bệnh

trên cây đậu đũa ở Gainesville, Florida, Mỹ Sau đó một vài chủng khác cũng được phân lập từ đất ở Florida và một vài nơi khác ở vùng Đông Nam nước Mỹ và Châu

á như ấn Độ, Trung Quốc (Hsiao và Chang 2003, Ho và Chang 2003)

Nấm sợi là loại tế bào Eukaryote có cấu tạo tương đối phức tạp, có cấu tạo từ các bộ phận chính như: vỏ tế bào, nhân, ty lạp thể, nguyên sinh chất và không bào là những thành phần có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học, còn các phần khác như: màng nguyên sinh chất, lưới nội chất…chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi điện tử Tế bào của

nấm là một tế bào thực sự (eucyte) bao gồm màng tế bào, chất nguyên sinh, tế bào chất,

thể hạt nhỏ, ribôxôm, nhân, không bào, các hạt dự trữ

Nấm mốc sống theo kiểu dị dưỡng, hấp thụ thức ăn qua vách tế bào của cơ thể nấm Màng tế bào của nấm mốc không có lớp xenluloza mà là chất kitin Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, các chất dinh dưỡng đi vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đi từ

tế bào ra môi trường xung quanh qua những lỗ nhỏ này Bên ngoài thành tế bào không có

lớp nhầy vì thế mà các tế bào không bị dính lại với nhau Thành tế bào Blakeslea trispora

có cấu trúc sợi nhỏ từ chitin, chitosan và 1 tổ chức giống gel bao gồm polyglucuronic axít, glucuronomannoproteins và polyphosphate

Lượng hydrát cácbon dự trữ trong cơ thể dưới dạng glycogen Cơ thể nấm mốc không

có cơ quan thần kinh Nấm mốc phát triển chủ yếu ở phần ngọn của sợi nấm điều này phụ thuộc vào cấu tạo bên trong của ngọn sợi nấm và thành sợi nấm Phần ngọn sợi nấm tập trung các hoạt động liên quan tới quá trình tổng hợp prôtít Đây là yếu tố điều khiển,

xử lý các dây chuyền tổng hợp: nhân tế bào, hệ thống các axit nucleic, hệ thống enzim cần thiết Prôtít ngoài việc duy trì hoạt động sống của cơ thể nấm mốc còn dùng để xây dựng phần nấm sợi mới Thành của sợi nấm ở phần đỉnh mỏng hơn các phần khác Nhưng phần đỉnh vẫn được coi là phần bảo vệ, nó phải tiếp xúc với vật cản đầu tiên, khi cần là mũi nhọn luồn lách vật cản Một bào tử nấm mốc có ít nhất 2-3 sợi nấm non (cũng có thể

coi đây là ống nảy sợi), từ một sợi nấm non sẽ hình thành hàng trăm sợi nấm khác, đây là hiện tượng mọc nhánh của sợi nấm

Nguyên sinh chất của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào chất và nhân: + Màng nguyên sinh chất nằm sát bên trong thành tế bào và làm nhiệm vụ hấp thụ các chất dinh dưỡng

+ Tế bào chất là hệ thống keo phức tạp được tạo thành từ protein, gluxit, lipit, các chất khoáng phân tán trong môi trường nước Trong tế bào chất có các ty thể, riboxom, thể golgi, mạng lưới nội chất, thể màng biên (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999)

Trong sợi nấm dòng nguyên sinh chất chuyển động theo hướng từ phần sợi nấm đã trưởng thành tới ngọn sợi nấm Phần ngọn sợi nấm các thành phần cấu tạo liên quan đến quá trình tạo chất tế bào và các nguyên liệu cần thiết cho quá trình này cũng nhiều hơn các thành phần khác của sợi nấm Nhân tế bào có vai trò quan trọng đối với nhiều hoạt

động của sợi nấm, thành phần cơ bản của nhân tế bào gọi là prôtít nhân (hay nucleprotein) Nhân của tế bào là hình cầu có màng bao bọc, trong nhân có nhân con (nucleolus) bao gồm có protein, ADN, ARN và enzim Chức năng của nhân là quyết định tính di truyền và tham gia điều kiện hoạt động sống Các enzim không những tham gia có tính chất quyết định vào các hoạt động sinh lý cơ bản bên trong sợi nấm mà còn đóng góp quyết định vào quá trình hấp thụ thức ăn bên ngoài Enzim đóng vai trò cắt các phân tử tinh bột thành các phân tử đường, các phân tử chất xơ thành đường, phân tử prôtít động thực vật thành các axit amin Trong các sợi nấm có chất dự trữ là gluxít, một số loài dự trữ

ở dạng lipit Lipit có trong thành phần của vách sợi nấm (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999)

Nấm mốc hấp thụ các axit amin tạo nên các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào dưới dạng các thành phần (các bazơ nitơ) của axit nhân (axit nucleic) Thứ tự bazơ nitơ trong phân tử mốc đối với mỗi loại mốc là khác nhau Các thể riboxom nằm rải rác trong chất nguyên sinh, đây là nơi sản xuất ra protein Ty thể của tế bào nấm nhiều và đa dạng Không bào chứa dịch tế bào (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999)

Thức ăn không chỉ cung cấp các nguyên liệu để cơ thể nấm mốc sản xuất thường xuyên chất nguyên sinh, sợi nấm, chất dự trữ mà còn cung cấp năng lượng cho các hoạt

động của cơ thể sống, trong đó có các hoạt động "sản xuất" các thành phần cấu tạo nên cơ thể Thức ăn và các thành phần cấu tạo nên cơ thể gồm một hoặc một số các hợp chất hoá học như: gluxít, prôtít, lipid, axit nhân, vitamin, muối phốtphát, nitrát Mỗi hợp chất hoá học đều do nhiều thành phần liên kết với nhau Các hợp chất đơn giản như nước, muối vô cơ các phần này chỉ là các nguyên tố: H2, O2, P, S Năng lượng tạo ra các liên kết đó là hoá năng Mỗi dạng liên kết tương đương với một số năng lượng nhất định Một số mối liên kết của các hợp chất trong cơ thể sống giữ một lượng năng lượng đặc biệt lớn, đó là những liên kết cao năng Sự phát triển của nấm mốc còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện

môi trường: nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999)

1.1.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh sản loài Blakeslea trispora

Blakeslea trispora là nấm sợi, giữa hệ sợi không có vách ngăn, sinh sản vô tính hoặc

hữu tính (Hình 1.1.3.)

* Sinh sản hữu tính

Trong tất cả các thí nghiệm đã thực hiện, sự sinh sản hữu tính sảy ra khi khuẩn lạc của 2 chủng có giới tính đối lập phát triển tạo sợi nấm Hai sợi nấm song song vói nhau mang giới tính đối lập (-) và (+) hay còn gọi là giao tử đực và giao tử cái, sợi nấm phát triển dài ra theo hướng phía trước và hình thành túi giao tử non ở đầu các sợi nấm Vách ngăn trong túi giao tử non phát triển vào tạo tạo nang giao tử, các nang giao tử này sẽ dung hợp giới tính với nhau tạo thành trứng, đầu mỗi nhánh phình to ra, chỗ tiếp xúc của hai đầu nhánh xuất hiện một khối cầu mầu đen xù xì Khi nhánh của mỗi sợi nấm chạm

đầu vào nhau có nghĩa là giao tử đực và giao tử cái tiếp xúc với nhau (Lampila và cs 1985)

Khi đó vách tế bào ở chỗ tiếp xúc bị tiêu huỷ để hai giao tử thông với nhau Chất tế bào và nhân tế bào ở giao tử đực bị hút sang giao tử cái sau đó cả chất tế bào và nhân tế bào của 2 giao tử hoà trộn với nhau để thành 1 tế bào trong cái vỏ của giao tử cái Tế bào mới này chính là trứng đã được thụ tinh, trứng này phòng to, lớn lên, vỏ cũng dầy lên và càng ngày càng đen, càng sù sì, khối sù xì này là bào tử tiếp hợp, bào tử này không nảy mầm ngay thành cơ thể mới mà phát triển thành nhánh thẳng đứng, sau đó tiếp tục phát triển thành nang bào tử kín Nang bào tử kín vỡ ra tung bào tử kín ra bên ngoài Rất khó phân biệt được bào tử kín có giới tính đối lập (+) và (-) vì không có đặc điểm khác biệt Các bào tử tiếp tục nẩy mầm và có thể phối hợp hữu tính tiếp tục hoặc phát triển riêng biệt theo phương pháp vô tính Bào tử tiếp hợp có chức năng tổng hợp các sản phẩm sinh học trong khi sợi nấm (hyphae) không có vai trò gì trong việc sản xuất β-caroten Như vậy có

sự tương ứng tuyến tính giữa vùng không gian của bào tử tiếp hợp và hàm lượng

β-caroten Blakeslea trispora là loại vi nấm đa hình (polymorphíc) tổng hợp β-caroten với

chu trình vòng đời bao gồm sợi nấm (hyphae), sợi nấm tiếp hợp (zygophores) và bào tử

tiếp hợp (zygospo res)(Lampila và cs 1985)

H×nh 1.1.3 Chu tr×nh sinh s¶n v« tÝnh vµ h÷u tÝnh

cña Blakeslea trispora Trøng h×nh thµnh trong chu tr×nh sinh s¶n h÷u tÝnh cña Blakeslea trispora trªn m«i tr−êng PDA

* Sinh sản vô tính:

Trong sinh sản vô tính, bào tử được hình thành ở phía trong do có cấu tạo túi bào tử Túi bào tử có cấu trúc điển hình hơn cả chúng có dạng hình cầu nhỏ đường kính khoảng 80-120 àm chứa từ một đến hàng nghìn bào tử Những bào tử chứa đầy ở bên trong khoang của túi (Ho và Chang 2003)

* Các giai đoạn hình thành và phát triển của Blakeslea trispora

Khuẩn lạc Blakeslea trispora phát triển trên môi trường thạch đĩa, giai đoạn đầu hệ

sợi có màu trắng, phát triển dầy đặc dần, hệ sợi cong có nhánh phủ kín bề mặt đĩa Các giai đoạn phát triển thể hiện như sau (hình 1.1.4.) (Ho và Chang 2003):

1 Cuống nang hình cong trong giai đoạn nang bào tử kín đang phát triển (S)

2 Nang bào tử kín phát triển đến giai đoạn chín, bên trong có nhiều bào tử (S)

3 Trụ nang C và cổ trụ nang Co

4 Thành các nang bào tử kín tách ra (SW) giải phóng các bào tử kín

5 Các nang bào tử kín giải phóng khỏi nang bảo tử lớn, dọc theo chiều dài của nang bào tử kín có phần râu mọc ở 2 đầu (A)

6 Đỉnh của các bào tử kín thắt lại với nhau, gắn lên trên bề mắt hình cầu (V)

Các cuống nang sinh ra các nang bào tử kín mọc ra từ hệ sợi, cuống nang mọc thẳng, không phân nhánh, cuống nang cao 1- 4mm, rộng 13-20 àm, nang bào tử kín khi còn nhỏ hình cầu có đường kính (30-) 60-90 (-210) àm Giai đoạn đầu màu trắng sau đó có màu nâu đen

Khi trưởng thành nang bào tử lớn có màng bên ngoài bao bọc, mầu nâu, lớp vỏ ngoài chắc, sau đó nứt ra làm hai nửa, cuống nang biến mất khỏi các nang bào tử nhỏ, tại thời

điểm đó các nang bào tử nhỏ có hình quả lê, trong suốt dài (40-) 55- 90 (-100) àm, rộng 30-40 àm, thường có núm

7 Giai đoạn phát triển nang bào tử hình cầu (V), sau đó tách thành các nang hình cầu nhỏ bám trên bề mặt hình cầu lớn

8 Ba bào tử được tách ra

9 Phá vỡ thành tế bào để các bào tử tách ra

10 Các bào tử tách ra có cuống noãn

11 Bào tử tiếp hợp cùng với cuống noãn

Bào tử từ nang bào nhỏ hình ellíp, phần rộng của ellíp khoảng (5-) 6-8 àm màu nâu đỏ, chiều dài (10-) 12-18 àm Hai đầu bào tử có râu, râu dài gấp 2 lần chiều dài bào

tử Cuống nang sinh ra nang bào tử từ hệ sợi cao 1-5 mm, rộng 13-20 àm, ở phía đầu không phân nhánh, thành hệ sợi trơn nhẵn, trong suốt không có vách ngăn, các nhánh bắt

đầ thắt lại và giai đoạn cuối tạo ra một hình cầu lớn có đường kính 22-35 àm, các nang bào tử sinh ra trên bề mặt của đoạn phình hình cầu lớn, mỗi cuống nang sinh ra (1-) 8-

16 (-32) hình cầu nhỏ Nang bào tử nhỏ hình ellip, gắn vào hình cầu lớn là các cuống của

hình cầu nhỏ dài 3-5àm, rộng 2,5 àm, mỗi hình cầu nhỏ chứa 3 bào tử (thậm chí còn có thể lên tới 4 bào tử) chúng rất mảnh nhưng chắc, trong suốt, khi trưởng thành phá vỡ

đường nối thành hai đoạn

Các bào tử từ nang bào tử hình ellip, chiều rộng của ellip có màu nâu đỏ, dài 15(-18) àm, rộng 6-7.5(-8) àm, phần râu có chiều dài bằng chiều dài của bào tử Bào tử tiếp hợp được tạo thành ở dưới bề mặt của môi trường, có đường kính 40-80 àm, hình cầu, mảnh, phẳng, ở tâm hình cầu có giọt dầu nhỏ ở giai đoạn trưởng thành, lớp thành phía ngoài mỏng hơn, có đường kẻ sọc Thành bên trong dầy, nhẵn, cuống noãn kẹp ép vào, không có phần phụ, sinh ra từ vòng xoắn của sợi nấm, đường kính khoảng 10-80 àm mảnh

12.5-1 2

Hình 1.1.4.Các giai đoạn phát triển của bào tử Blakeslea trispora

1 Cuống nang hình cong trong giai đoạn nang bào tử kín đang phát triển (S)

2 Nang bào tử kín phát triển đến giai đoạn chín, bên trong có nhiều bào tử (S)

3 Trụ nang C và cổ trụ nang Co

4 Thành các nang bào tử kín tách ra (SW) giải phóng các bào tử kín

5 Các nang bào tử kín giải phóng khỏi nang bảo tử lớn, dọc theo chiều dài của nang bào

tử kín có phần râu mọc ở 2 đầu (A)

6 Đỉnh của các bào tử kín thắt lại với nhau, gắn lên trên bề mắt hình cầu (V)

8

Hình 1.1.4 Giai đoạn phát triển của bào tử

7 Giai đoạn phát triển nang bào tử hình cầu(V), sau đó tách thành

các nang hình cầu nhỏ bám trên bề mặt hình cầu lớn

8 Ba bào tử đ−ợc tách ra

9 Phá vỡ thành tế bào để các bào tử tách ra

10 Các bào tử tách ra có cuống noãn

11 Bào tử tiếp hợp cùng với cuống noãn

1.1.4.3 Quá trình tổng hợp β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora

Các terpenoit đều bắt nguồn từ tiền chất chung là isopentenyl pyrophosphate Chất này được tổng hợp theo chu trình Mevalonate (Hình 1.1.5.) 3-Hydroxymethylglutaryl

coenzim A (HMG-CoA) và mevalonate là các chất trung gian của chu trình mevalonate

Gene mã hoá cho hai enzim đầu tiên của chu trình mevalonate là HMG-CoA synthase và

HMG-CoA reductase đã được tách dòng ở Phycomycetes và nó đã được giải trình tự từ bốn chủng thuộc bộ Mucorales Sinh tổng hợp terpenoid được hình thành thông qua quá

trình trùng ngưng mạch 5 cacbon tạo thành các phân tử lớn hơn như geranyl pyrophosphate, farnesyl pyrophosphate, geranylgeranyl pyrophosphate Qúa trình tổng hợp carotenoid cần 2 phân tử geranylgeranyl-PP sau đó enzim dehydrogenase xúc tác phản ứng dehydro liên tiếp 4 lần trên phytoen Khi giải phóng nhóm pyrophosphate đầu tiên sẽ tạo ra tiền phytoene pyrophosphate và giải phóng nhóm pyropohossphate thứ hai tạo nên phytoene Theo các tài liệu nghiên cứu công bố gần đây, quá trình bão hoà được tạo nên thông qua các phản ứng dehydrogen trong đó hydrogen chuyển đến phân tử NADP hoặc FAD Một enzim khác là cyclase vòng hoá lycopen hình thành α-caroten,

tiếp tục vòng hoá α-caroten tạo β-caroten (Goodwin, 1980)

1.1.5 ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten

của Blakeslea trispora

Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy là nhân tố quyết định tới quá trình sinh

trưởng phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp β-caroten của B trispora Thành phần

môi trường bao gồm các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, các chất khoáng và vi lượng, chất hoạt động bề mặt …(Mantzouridou và cs 2002)

ảnh hưởng của nguồn cacbon:

Cacbon là nguyên tố quan trọng chiếm tới 45-50% trọng lượng khô của tế bào Các nguồn cácbon khác nhau sẽ có ảnh hưởng khác nhau tới quá trình sinh tổng hợp β-

caroten Blakeslea trispora có khả năng sử dụng tốt các loại đường 6 cacbon (Lampila và

cs 1985) Theo Rouska và Mantzouridou (2001), tiến hành thí nghiệm nuôi cấy Blakeslea trispora trên môi trường có nguồn cácbon khác nhau thì sự hình thành bào tử và sự phát triển thay đổi Blakeslea trispora phát triển trên nguồn cácbon là glucoza, galactose,

cellobioza tốt hơn là trên môi trường có nguồn cácbon là tetraloza, maltoza

ảnh hưởng của nguồn nitơ:

Nitơ chiếm tới 10-15% khối lượng khô của tế bào Nguồn nitơ cung cấp cho tế bào có thể là nguồn vô cơ (các muối vô cơ như nitrit, nitrat, amoni …) hoặc hữu cơ (các axit

amin, peptit, protein …) Trong các nguồn nitơ, B.trispora có khả năng sử dụng cao ngô,

H×nh 1.1.5 Qu¸ tr×nh h×nh thµnh β-caroten tõ nÊm sîi B trispora

dịch thuỷ phân protein, pepton, cao nấm men, bột đậu tương và các loại muối vô cơ như

NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3… (Mantzouridou và cs 2002)

ảnh hưởng của nguồn khoáng:

Các chất khoáng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý của tế bào Các nguyên tố khoáng cần thiết cho sinh trưởng và phát triển tế bào là P và S, một lượng nhỏ Fe, Mn, Ca,

Mg Các nguồn khoáng được cung cấp dưới dạng các muối vô cơ như KH2PO4, MgSO4hay các tạp chất có trong các thành phần khác của môi trường (Mantzouridou và cs 2002)

ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt:

Hình thái sợi nấm của Blakeslea trispora đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp β-caroten Sau khi nuôi cấy bào tử Blakeslea trispora có thể quan sát được

quá trình biến thể của hệ sợi nấm trên kính hiển vi Bổ sung thêm một số chất hoạt động

bề mặt vào môi trường nuôi cấy có khả năng làm tăng lượng sinh khối nấm sợi và sự tổng hợp chất màu

ảnh hưởng của các tiền chất:

Một số các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy Bl trispora một số tiền chất có cấu trúc vòng β hoặc có tác dụng kích thích sự tổng hợp chất

màu carotenoit như kerosene, β-ionone, isoniazit sự giảm phân sẽ xẩy ra trong đa số hoặc trong một số ít bào tử tiếp hợp và chúng sẽ nảy mầm tạo nang bào tử (bào tử túi) hoặc tạo các sợi nấm (Mantzouridou và cs 2002) Bào tử túi được tách ra như tế bào độc lập và có chức năng như bào tử phân tán và các không bào hình trụ được hình thành Các không bào

là vị trí lưu giữ quan trọng khi tổng hợp β-caroten

ảnh hưởng của dầu thực vật:

Trong các loại dầu tự nhiên như dầu ôliu, dầu hạt bông, dầu đậu tương, dầu vừng

mà trong thành phần của chúng có chứa axít linoleic bổ sung vào môi trường nuôi cấy

nấm sợi Blakeslea trispora sẽ làm tăng sự tổng hợp chất màu Tuy nhiên, nếu chỉ bổ sung

dầu tự nhiên không cũng không làm tăng sự tổng hợp chất màu mà cần phải kết hợp cả chất chống ôxy hoá thì sự tổng hợp chất màu đạt cao nhất Điều đó có thể được giải thích

là dầu tự nhiên có tác dụng chống sự ôxy hoá của axít linoleic trong quá trình lên men Hoặc trong thành phần của dầu tự nhiên có một vài thành phần có tác dụng thúc đẩy quá trình tổng hợp chất màu (Rouska và Mantzouridou, 2001)

ảnh hưởng của axít trisporic (AT) và cấu trúc của nó tới sự tạo thành carotenoit:

Lampila và cộng sự (1985) đã thu được 3 chất có khả năng kích thích gen tạo

carotenoit ở Blakeslea trispora Các nhà khoa học này đã nghiên cứu cấu trúc hoá học của

từng chất này và thấy rằng thành phần quan trọng nhất (80%) là trisporic axít C Cùng lúc, Sebeck và Jager cũng thu nhận và xác định 4 yếu tố kích thích sự sản sinh caroten là các

axít trisporic từ dịch lên men chủng Blakeslea trispora có giới tính cái (-) Trisporic axit

C là axit béo không no có nhiều nối đôi (C18 – keto axít) Các tác giả này đã nghiên cứu

các chủng Blakeslea trispora đột biến sản sinh một lượng β-caroten không cao và đã kết

luận rằng sự làm suy yếu gen tạo carotenoit là do sự ức chế tạo trisporic axít (AT) Trisporic axit B: R = - C – CH3, trisporic axit C: R = - CHOCH3

AT được bổ sung vào dịch nuôi cấy các chủng đực cái riêng biệt sau khi lên men Kết

quả cho thấy AT kích thích chủng Blakeslea trispora có giới tính cái (-) sản sinh caroten

nhiều hơn Điều đó có thể dự đoán rằng AT có thể đã có tác động kích thích tích cực đến

hệ thống enzim (Lampila và cs 1985)

ảnh hưởng của pH ban đầu:

Hàm lượng β-caroten nếu pH dịch lên men kiềm, dải hoạt động pH của các chủng

Blakeslea trispora rất rộng có thể phát triển từ pH axit yếu tới pH kiềm mạnh Như vậy có

thể nói rằng pH tối ưu cho tổng hợp β-caroten phụ thuộc vào một vài thông số lên men như cơ chất, giống VSV, hệ thống lên men và tổng quát là các điều kiện mà ở đó tiến hành mẻ lên men (Rouska và Mantzouridou 2001)

ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy:

Nấm mốc là vi sinh vật ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển từ 25-350C Nếu lên men ở nhiệt độ thấp làm chậm quá trình sinh trưởng của bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten thấp, thời gian lên men rất dài, không hiệu quả kinh tế Nếu nhiệt độ tăng cao, bào tử phát triển kém, nhỏ, hệ sợi chuyển sang mầu trắng trong môi trường PDA, còn trong môi trường lên men hệ sợi dài mảnh, xuất hiện nhiều bào tử hơn là hệ sợi, hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten thấp (Lampila và cs 1985)

ảnh hưởng của ánh sáng:

ánh sáng cũng góp phần vào việc sinh sản sinh lý của một số nấm mốc Nuôi cấy

Blakeslea trispora với điều kiện chiếu sáng tạo bào tử tốt hơn và tạo nhiều màu vàng hơn

là nuôi cấy trong bóng tối, nhưng độ chênh lệch nhau không nhiều Không có sự ảnh hưởng chắc chắn của sự cảm ứng ánh sáng với các gen tạo carotenoit Trong một số sinh vật, ánh sáng định lượng làm tăng khả năng tổng hợp carotenoit, trong khi ở các loài khác

nó gây ra quá trình tạo gen tổng hợp carotenoit Sự nhậy cảm ánh sáng được hoạt hoá bằng một cơ quan nhận cảm ánh sáng mà nó hấp thụ năng lượng ánh sáng Nói chung, gen tạo caroten cảm nhận ánh sáng trong các sinh vật là rất khác nhau với các bước sóng

và độ dài của sự chiếu sáng Một số các carotenoit được tạo ra khi sự chiếu sáng gần tới mức bão hoà (Lampila và cs 1985)

ảnh hưởng của oxy:

Ôxy là điều cần thiết cho sự phát triển và sản sinh β-caroten khi nuôi cấy Blakeslea

trispora, C cucurbitarum và Nearospora Vai trò của oxy trong sự cảm ứng ánh sáng đã

được coi như một chất nhận điện tử (giữ các thành phần oxy hoá khử như flavin hay sắc tố

tế bào – cytochrome trong giai đoạn oxy hoá riêng biệt) hay như một phân tử tham gia thẳng vào phản ứng của cơ quan thụ cảm ánh sáng (Lampila và cs 1985)

Hàm lượng ôxy hoà tan cao cũng làm cho vi sinh vật bị ảnh hưởng, có thể dẫn đến sự phá huỷ protein, DNA và lipids Các kết quả trên cho thấy không thể sử dụng các thành phần môi trường thích hợp khi nuôi cấy trên máy lắc để lên men trên các thiết bị lên men

mà cần phải có sự nghiên cứu, thay đổi cho phù hợp hơn

Độ bền của β-caroten trong quá trình lên men khác với nó trong quá trình sấy khô Một số tác giả đã nghiên cứu các yếu tố tự kích thích, tự điều chỉnh bên trong của vi sinh vật, các yếu tố tự điều chỉnh này được tạo ra trong quá trình lên men, từ các thành phần môi trường hoặc từ các chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Các yếu tố

tự điều chỉnh này đã được xác định có bản chất hoá học như các eters với một nhóm

alcohol Blakeslea trispora đã được xác định là một trong những vi sinh vật có khả năng

tạo được các chất tự điều chỉnh β-caroten được giữ lại trong hệ sợi, và nếu quá trình lên

men quá kéo dài thì hiệu suất thu nhận chất màu cũng bị giảm đi

1.1.6 Vi nang và các phương pháp tạo vi nang

β-caroten là hợp chất được con người tổng hợp đầu tiên và cho tới nay vẫn còn là một loại chất màu được sử dụng nhiều nhất Nhưng việc sử dụng chất màu này trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc vẫn tồn tại 2 vấn đề chưa giải quyết được đó là khả năng tan trong nước và độ ổn định của sản phẩm khi bảo quản rất kém Công nghệ vi nang hoá

là một công nghệ đang được đánh giá là đặc biệt ưu việt và đang được các nhà sản xuất trong và ngoài nước quan tâm sử dụng

1.1.6.1 Giới thiệu về công nghệ vi nang hoá và vi nang

Có thể định nghĩa vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không

xác định Hiện nay không có một tiêu chuẩn nào quy định về kích thước vi nang Tuy nhiên, nhiều tài liệu thường phân loại như sau: < 10 àm gọi là nanocapsule và >1000 àm gọi là macrocapsule Các vi nang hiện co trên thị trương có kích thước nằm trong khoảng

từ 3 àm tới 800 àm và chứa 10-90% vật liệu lõi (Lamprecht và cs 2000)

Quá trình tạo vi nang là quá trình bao gói một hay một hỗn hợp chất nào đấy gọi là chất nhân (lõi) trong một màng bao liên tục (vỏ) thường là một polyme hay kết hợp hai polyme (trong phương pháp đông tụ phức hợp)

Vi nang có thể có nhiều cấu trúc khác nhau Một số loại có hình cầu (thường là vi nang tạo thành theo phương pháp tách pha đông tụ) với nhân liên tục bao quanh bởi một lớp màng liên tục Một số khác có hình dạng bất kỳ chứa nhiều hạt nhân bên trong

Vi nang có những ưu điểm như:

- Các chất thể lỏng, nhớt có thể chuyển sang trạng thái rắn giống như bột: ví dụ như dầu cá, dầu vaselin, các VTM tan trong dầu như VTM A, D, E v.v… ở dạng tồn tại này, các chất kỵ nước có thể phân tán tốt hơn trong chất mang thân nước

- Có thể che dấu các mùi khó chịu và tính kích ứng của một số được chất khi dùng theo đường uống như phenylbutazon, tetracylin v.v…

- Hạn chế sự bay hơi của một số chất dễ bay hơi, thăng hoa như tinh dầu, long não, methylsalicylat v.v…

- Tăng khả năng ổn định, bền vững về mặt vật lý, hoá tính của một số chất nhờ hạn chế các quá trình không mong muốn như oxy hoá khử, thuỷ phân, tương tác giữa các chất như VTM C, VTM A v.v…

- Có thể kiểm soát được khả năng sử dụng của các chất Chẳng hạn như có thể làm tăng hay giảm tốc độ giải phóng của dược chất, thiết lập các điều kiện để kéo dài thời gian tác dụng

Tạo vi nang bao gồm toàn bộ những kỹ thuật cho phép tạo ra các phần tử nhỏ bé riêng biệt có cấu tạo gồm một vật liệu vỏ có chứa vật liệu cần bao (thường là chất hoạt

động) Các phần tử nhỏ hay vi nang có kích thước 1àm đến 1mm và có 5 đến 90% w/w là vật liệu cần bao Những chất cần bao gói rất đa dạng: dược phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật, tinh dầu thơm, vi sinh vật, tế bào, chất xúc tác phản ứng Vật liệu vỏ thường là các polyme nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp hoặc là các lipit Các phần tử nhỏ này thường có 2 dạng hình thái chủ yếu:

- Dạng vi nang (microcapsule) trong đó mỗi phần tử có chứa chất hoạt động dạng lỏng (ít nhiều có độ nhớt) hay rắn ở trung tâm, bao quanh là một vỏ dạng rắn làm bằng vật liệu vỏ

- Dạng vi cầu trong đó mỗi phần tử được tạo nên bởi một mạng lưới liên tục của các

đại phân tử hay lipit tạo thành một khối, trong đó có sự phân bố đồng đều của chất hoạt động ở dạng các phân tử hoặc dạng phần tử rắn hay tồn tại ở dạng giọt nhỏ Trong công nghiệp, người ta tạo vi nang nhằm mục đích: bảo vệ, tạo sự tương quan và tăng độ bền vững của chất hoạt động trong khi phối trộn nhằm tạo ra dạng đồng nhất, tạo

vi nang còn nhằm che dấu mùi vị, thay đổi và kiểm soát cách thức giải phóng chất hoạt

động nhằm mục đích kéo dài thời gian tác dụng

Trong ngành thực phẩm và trong lĩnh vực thực phẩm chức năng, việc tạo vi nang có tác dụng che dấu vị đắng (của vitamin B); thậm chí lớp vỏ bao còn có thể được bổ sung thêm hương liệu để tăng hiệu quả

Tạo vi nang còn giúp ngăn ngừa những tương tác giữa các thành phần trong thực phẩm cũng như bảo vệ các chất hoạt động (chất cần bao nang) khỏi những tác động của

quá trình oxy hóa (bảo vệ các chất thơm), của độ ẩm (tạo vi nang cho muối, đường ), của

ánh sáng, môi trường axit hay kiềm, quá trình bay hơi (với các chất dễ bay hơi như tinh dầu) Tạo vi nang cho các enzym hay các probiotic là nhằm kiểm soát và làm chậm quá trình giải phóng chúng Quá trình tạo vi nang cũng tạo điều kiện cho thao tác sản xuất vì

nó cho phép tạo ra sản phẩm lỏng dưới dạng bột dễ sử dụng

Có nhiều cách để giải phóng chất được bao: dùng nhiệt (làm nóng chảy lớp vỏ bao), dùng enzym (chất bao sẽ được giải phóng nhờ hoạt động của enzym lipaza của tuyến tụy), dùng phương pháp cơ học (phá vỡ lớp vỏ bao trong khi nhai)

Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, việc tạo vi nang cho các chất hoạt động ưa nước hay kị nước (vitamin, tinh dầu, chất hydrat hóa) không chỉ có tác dụng bảo vệ mà còn giúp các chất trên được giải phóng từ từ và giúp chúng tác động đến đúng mục tiêu

Trong ngành sản xuất thức ăn gia súc, tạo vi nang được dùng để tạo các hỗn hợp thức

ăn dạng bột hay để che dấu mùi vị sản phẩm, để gia súc chấp nhận loại thức ăn đó

Đối với ngành in thì các vi nang có khả năng bám dễ dàng lên giấy, bìa carton hay plastic nhờ các kỹ thuật in offset khô hay ẩm, mực thơm Kỹ thuật này được dùng chủ yếu trong quảng cáo, nhất là với những phần tử có mùi thơm Hương thơm sẽ được giải phóng khi vi nang bị phá vỡ bằng cơ học hay bằng cách thấm dần qua vỏ

Như đã biết, thành phần của vi nang gồm hai phần: phấn lõi và phần vỏ Phần lõi rất phong phú, có thể ở dạng rắn, lỏng, hỗn hợp, nhũ tương v.v… Phần vỏ vi nang chiếm từ 1-70% khối lượng quyết định tính chất của vi nang

Phần vỏ được lựa chọn phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Phải phù hợp với mục đích, mục tiêu đặt ra khi đưa chất cần bao vào vi nang như: bền, ổn định, giảm được sự bốc hơi, cải thiện hương vị, kiểm soát tốc độ giải phóng chất hoạt động

- Phải phù hợp với phương pháp cũng như với máy móc thiết bị dùng trong quá trình tạo vi nang

- Đảm bảo một số tính chất cơ lý phù hợp: độ bền, độ cứng, độ dẻo, khả năng thấm

và độ ổn định

- Phải tạo được lớp màng liên tục, đồng nhất bao quanh lõi

- Phải tương hợp với chất hoạt động cần bao nang

1.1.6.2 Các phương pháp tạo vi nang

Có rất nhiều phương pháp đưa ra để tạo vi nang và có khoảng hơn 200 phương pháp

đã được giới thiệu trong các tài liệu (Gouin, 2004) Các phương pháp này có sự khác biệt nhau về nhiều mặt như khả năng hòa tan của polyme tạo vỏ, kích thước vi nang, độ dày vỏ

và tính thấm của màng bao, các tính chất vật lý v.v Tuy nhiên người ta phân ra 3 nhóm phương pháp chính:

- Phương pháp hóa lý: tách pha đông tụ, bốc hơi dung môi, tĩnh điện, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn