Bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán khuếch đại gen HER2 trong ung thư vú tại Việt Nam bằng kỹ thuật Real-time PCR

Bài viết Bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán khuếch đại gen HER2 trong ung thư vú tại Việt Nam bằng kỹ thuật Real-time PCR xây dựng quy trình phát hiện tình trạng khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật Realtime PCR.

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN KHUẾCH ĐẠI GEN HER2 TRONG UNG THƯ VÚ TẠI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Bùi Võ Minh Hoàng1, Lê Hồng Phúc1, Lưu Thị Thu Thảo1, Đặng Hồng Minh1, Đồn Thị Phương Thảo1 TĨM TẮT 38 Đặt vấn đề: Ung thư vú loại ung thư thường gặp loại ung thư gây tử vong hàng đầu phụ nữ giới Tình trạng HER2 dương tính ghi nhận 20-30% trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn có liệu pháp điều trị trúng đích chẩn đốn sớm Mục tiêu: Xây dựng quy trình phát tình trạng khuếch đại gen HER2 kỹ thuật Realtime PCR Đối tượng phương phápNghiên cứu cắt ngang mô tả thực 41 mẫu mô vùi nến Mỗi mẫu mô thực đồng thời hai kỹ thuật Real-time PCR lai huỳnh quang chỗ cặp tín hiệu HER2/CEP17 Kết quả: Cặp gen HER2/EIF5B có độ nhạy khơng cao trường hợp: mẫu HER2 3+, mẫu HER2 2+ tổng số mẫu Khi phân tích cặp gen HER2/GAST, kết Real-time PCR phù hợp với số nghiên cứu trước nhóm HER2 0-1+ 3+, với độ nhạy 100% độ đặc hiệu 100% Đối với nhóm 31 mẫu HER2 2+, cặp gen HER2/GAST cho độ nhạy 50% độ đặc hiệu 84% Trong tổng số 41 mẫu nghiên Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Chịu trách nhiệm chính: Lê Hồng Phúc Email: phucle16@outlook.com Ngày nhận bài: 24.10.2022 Ngày phản biện: 20.10.2022 Ngày duyệt bài: 24.10.2022 cứu, cặp gen HER2/GAST cho độ nhạy 73% độ đặc hiệu 87% Kết luận: Bước đầu thành cơng xây dựng quy trình phát khuếch đại gen HER2 thực kỹ thuật Real-time PCR cặp gen HER2/GAST Tuy nhiên, nghiên cứu với số mẫu hạn chế, cần thêm nhiều nghiên cứu với số mẫu lớn số lượng gen chứng đa dạng nhằm cải thiện khả phát tình trạng khuếch đại gen HER2 Từ khóa: Ung thư vú, HER2, Real-time PCR, FISH SUMMARY OPTIMIZING DIAGNOSTIC PROTOCOL OF HER2 AMPLIFICATION IN BREAST CANCER IN VIETNAM USING REALTIME PCR Background: Breast cancer has very high incidence and mortality in women in the world HER2 positive is accounted for 20-30% of invasive ductal carcinoma, the targeted therapy is available if diagnosed in time Objective: Optimizing diagnostic protocol of HER2 amplification using Real-time PCR Methods: Cross-sectional study on 41 Formalin-fixed, Paraffin-embedded (FFPE) section Each section will be analyzed in Realtime PCR and Flouresence in sity Hybridization (FISH) Results: The ratio of HER2/EIF5B has significant low sensitivity in all three 269 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 circumstances: HER2 3+ group, HER2 2+ group and samples from all groups of immunohistochemistry (IHC) The result of HER2/GAST in Real-time PCR has the same result of previous studies in HER2 0-1+ and 3+ group, with both sensitivity and specificity are 100% In 31 samples of HER2 2+ group, the HER2/GAST ratio has 50% sensitivity and 84% specificity In all 41 samples of our study, the HER2/GAST ratio has 73% sensitivity and 87% specificity Conclusion: The protocol is optimized using two genes HER2 and GAST Unfortunately, the sample size is limited, so there is a need for many further studies with larger size and also include more reference gene to enhance the detection of HER2 amplification Keywords: Breast cancer, HER2, Real-time PCR, FISH I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú đa số xuất phát từ tế bào biểu mô vú Bệnh có yếu tố tiên lượng quan trọng phục vụ cơng tác điều trị như: kích thước khối u ngun phát, số lượng hạch di căn, phân loại mô bệnh học, tình trạng thụ thể nội tiết, tình trạng thụ thể HER2 tuổi bệnh nhân Sau có phân loại mô bệnh học, bệnh nhân ung thư vú tiến hành khảo sát tình trạng thụ thể nội tiết, tình trạng thụ thể HER2 xét nghiệm phân tử (nếu có); sau phân nhóm phân tử nhằm xác định hướng điều trị phù hợp theo Hướng dẫn chẩn đoán điều trị ung thư vú Bộ Y tế ban hành năm 2020[1] Tình trạng HER2 kết luận dương tính có khuếch đại gen HER2 tăng biểu thụ thể HER2 màng tế bào ung thư vú, chiếm 20-30% trường hợp ung thư biểu mô tuyến vú xâm lấn Sự khuếch đại gen HER2 làm tăng khả xâm lấn, tăng chu kỳ nhân đôi tế bào giảm chết theo chu trình tế bào ung thư vú [3] Hiệp hội ung thư lâm sàng Hoa Kỳ Hiệp hội Giải phẫu bệnh Hoa Kỳ (ASCO/CAP), năm 2018, công bố khuyến cáo chẩn đốn điều trị ung thư vú, thể vai trị hai kỹ thuật hóa mơ miễn dịch kỹ thuật lai chỗ đánh giá tình trạng HER2 ung thư vú, khuyến cáo ứng dụng rộng rãi toàn cầu[8] Bảng Tiêu chuẩn chẩn đốn HER2 dương tính theo ASCO/CAP 2018 [8] Hóa mơ miễn dịch HER2 Lai huỳnh quang chỗ (FISH)cặp tín hiệu HER2/CEP17 3+ Bất kỳ HER2/CEP17 < 2+ Tín hiệu gen HER2/tế bào ≥ HER2/CEP17 ≥ Bất kỳ Tín hiệu gen HER2/tế bào ≥ Kỹ thuật khảo sát tình trạng biểu phẩm, người phân tích kết phải đào HER2 Việt Nam tuân thủ tạo cần nhiều kinh nghiệm; theo hướng dẫn ASCO/CAP 2018 Tuy tính phức tạp kỹ thuật, hiệu suất thực nhiên, kỹ thuật lai chỗ tồn nhiều hạn mẫu bệnh phẩm bị hạn chế đáng chế, yêu cầu người thực mẫu bệnh kể Kết phân tích mang tính 270 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 chất chủ quan người đọc, nên theo ASCO/CAP trường hợp nghi ngờ cần phải kiểm tra chéo nhằm đưa kết luận xác tình trạng bệnh [8] Vì vậy, việc xây dựng quy trình Real-time PCR định lượng số gen HER2 cần thiết để tạo khách quan, thuận tiện nhanh chóng đưa chẩn đốn xác phục vụ cho bệnh nhân bác sĩ lâm sàng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu mô ung thư vú vùi nến (FFPE) bệnh nhân ung thư vú chẩn đoán mới, có kết mơ bệnh học, Bộ mơn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn chọn bệnh Tất mẫu mơ vùi nến có kết nhuộm hóa mơ miễn dịch khảo sát tình trạng biểu thụ thể HER2 Số mẫu theo phân nhóm hóa mơ miễn dịch: • HER2 0-1+ : mẫu • HER2 2+ : 31 mẫu • HER2 3+ : mẫu Tiêu chuẩn loại trừ Đối với mẫu có kết hóa mơ miễn dịch: • Mẫu chứng khơng đạt chất lượng • Mẫu có nhiều hình ảnh gây nhiễu • Nhuộm hóa mơ bắt màu đậm vùng ống tuyến vú bình thường Tiêu chuẩn loại trừ mẫu khơng phù hợp cho FISH: • Đoạn dị CEP17 lên tín hiệu • Người phân tích khơng đọc tín hiệu hai vùng khối u di • > 25% tín hiệu phát màu yếu • > 10% tín hiệu nằm bào tương, ngồi nhân • Hình ảnh màng nhân khơng rõ nét • Phần mô tự phát màu huỳnh quang mạnh Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang mô tả hàng loạt ca Các bước tiến hành Các mẫu FFPE thuộc nhóm kết hóa mơ miễn dịch HER2 từ năm 2016-2022 Khảo sát tình trạng khuếch đại gen HER2 kỹ thuật Real-time PCR Các mẫu FFPE tiến hành thu thập 4-10 lát cắt µm, tách chiết sinh phẩm “GeneJET FFPE DNA Purification Kit” Sản phẩm DNA sau tiến hành phản ứng Realtime PCR gen mục tiêu HER2, GAST EIF5B Nhằm hạn chế ảnh hưởng thay đổi CEP17 lên kết real-time PCR, chọn gen đối chứng GAST nằm nhiễm sắc thể 17, không thuộc vùng khuếch đại gen HER2 cho kết định lượng cặp gen HER2/GAST tương đồng với cặp gen HER2/CEP17 [2, 3, 7] Chúng đồng thời sử dụng gen đối chứng thứ hai EIF5B, mục tiêu sử dụng gen EIF5B nhằm đánh giá tiêu số lượng trung bình gen HER2 tế bào ung thư vú khảo sát[5] Real-time PCR sử dụng hóa chất FastStart PCR Master chạy hệ thống LighCycler 480 II, phản ứng PCR vởi cặp mồi HER2, GAST EIF5B đọc kênh màu FAM, HEX Cy5 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time PCR gồm 95oC – 10 phút, 45 chu kỳ (95oC – 10 giây, 60oC – 30 giây, đọc tín hiệu 60oC) 271 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 Bảng Trình tự đoạn mồi Mồi Trình tự (5’-3’) HER2-F ATCTGCCTGACATCCACG HER2-R GCAATCTGCATACACCAGTTC HER2-Probe 5’-/56-FAM/AGCTTATGC/ZEN/CCTATGGCT/3IABkFQ/-3’ GAST-F TCTGAAGCTTCTTGGAAGCC GAST-R CCAGCTGCCTTCGATGA GAST-Probe 5’-/5HEX/AGATGCACC/ZEN/CTTAGGTACA/3IABkFQ/-3’ EIF5B-F GGCCGATAAATTTTTGGAAATG EIF5B-R GGAGTATCCCCAAAGGCATCT EIF5B-Probe 5’-/5Cy5/TTCAGCCTT/TAO/CTCTTCTCATGCAGTTGTCAG/3IAbRQSp/-3’ Ở mẫu FFPE, nhóm ghi nhận kết xuất Kết tỉ số hai đoạn dò HER2 chu kỳ ngưỡng (Ct) gen tương ứng CEP17 khuyến cáo phân tích phân tích tự động theo chế độ “Abs 20 nhân tế bào: Quant/2nd Derivative Max“ tính tỉ lệ số • Ghi nhận tỉ lệ HER2/CEP17 gen HER2 so với gen chứng, • Ghi nhận giá trị trung bình số tín hiệu HER2/GAST HER2/EIF5B, theo công gen HER2 tế bào thức tác giả Pfaffl[6] Đánh giá kết Ct gen R = Số lượng gen HER2 = Các biến số: kết hóa mơ miễn dịch, chứng (GAST EIF5B) – Ct gen HER2 kết FISH, kết Real-time PCR • R ≥ 2: có tình trạng khuếch đại gen Dữ liệu thô quản lý mã hóa HER2 phần mềm Microsoft Excel • R < 2: khơng có khuếch đại gen Nghiên cứu dựa vào kỹ thuật FISH làm HER2 tiêu chuẩn vàng đánh giá tình trạng thụ thể Nghiên cứu sử dụng kit “HER2 HER2 IQFISH pharmDx” với hai đoạn dò bắt vào Y đức mục tiêu HER2 CEP17, mẫu FFPE Nghiên cứu Hội đồng đạo đức tiến hành khảo sát lam nhuộm nghiên cứu y sinh học Trường Đại H&E xác định vùng mô ung thư vú chuẩn học Y Dược TP.HCM xét duyệt thơng qua bị lát cắt µm, trình lai huỳnh số 06/HĐĐĐ-ĐHYD ngày 10/01/2022 quang thực theo quy trình nhà sản III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng Kết HMMD, FISH, tình trạng HER2 theo ASCO/CAP 2018 Real-time PCR HMMD HER2/ FISH Tình trạng Real-time PCR Real-time PCR STT MẪU HER2 Tế bào HER2/CEP17 HER2 RHER2/GAST RHER2/EIF5B BC01 âm tính 1,26 0,70 BC02 âm tính 0,79 0,35 BC09 âm tính 0,69 0,28 272 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 BC10 BC13 BC03 BC06 BC07 BC08 BC49 BC11 BC12 BC14 BC15 BC16 BC17 BC18 BC20 BC21 BC22 BC23 BC25 BC26 BC27 BC31 BC32 BC33 BC34 BC36 BC37 BC38 BC39 BC41 BC42 BC44 BC45 BC46 BC47 BC48 BC50 BC51 0 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3,05 1,80 2,10 3,80 3,33 2,35 3,00 4,60 3,45 5,25 4,45 3,38 3,05 2,50 2,14 3,59 1,91 2,80 8,59 2,07 2,50 4,10 6,19 1,85 2,50 10,8 2,69 1,64 3,15 1,88 2,21 1,63 1,08 1,17 0,63 1,44 1,31 1,76 2,09 1,92 3,00 1,65 1,42 2,18 1,43 1,13 2,24 1,09 1,07 1,85 1,17 0,85 2,00 2,45 1,28 1,50 1,80 0,93 1,05 1,75 1,07 1,39 âm tính âm tính dương tính dương tính dương tính dương tính dương tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính dương tính âm tính dương tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính dương tính âm tính âm tính dương tính dương tính âm tính âm tính dương tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính 1,18 0,76 12,04 11,88 4,20 5,10 3,14 1,27 1,36 4,26 1,31 1,69 1,18 1,54 16,45 1,30 1,40 2,35 1,40 2,22 1,01 1,18 1,69 0,78 0,81 2,23 0,77 0,85 0,68 2,48 0,90 0,73 0,92 2,48 0,81 0,74 0,96 1,00 0,20 0,15 3,46 3,63 0,85 1,35 4,92 0,39 0,19 0,16 2,30 0,86 0,42 0,47 1,18 0,62 0,44 0,21 0,19 0,18 0,13 0,25 0,14 - 273 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 Bảng ghi nhận thơng tin liên quan đến tình trạng HER2 mẫu tương ứng: • Kết Hóa mơ miễn dịch: 0-1+, 2+ 3+ • Kết FISH: - HER2/tế bào: Số trung bình số tín hiệu gen HER2 tế bào - FISH HER2/CEP17: tỉ lệ số tín hiệu HER2 CEP17 tế bào khảo sát • Kết luận tình trạng HER2 theo hướng dẫn ASCO/CAP 2018, dựa vào kết hóa mơ miễn dịch FISH • Kết Real-time PCR: - Giá trị RHER2/GAST - Giá trị RHER2/EIF5B Khi phân tích tình trạng HER2 theo hướng dẫn ASCO/CAP 2018, nhóm nghiên cứu ghi nhận hai trường hợp BC36 BC45 có khuếch đại gen HER2 có số trung bình gen HER2 tế bào ≥ 6, tỉ lệ HER2/CEP17 < Bảng Kết Real-time PCR mẫu có kết HMMD HER2 0-1+ HER2 3+ Kết HMMD HER2 Real-time PCR Độ nhạy Độ đặc hiệu HER2 HER2 3+ 0-1+ ≥2 RHER2/GAST 100% 100%