xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen mfn2 gây bệnh chacort marie tooth loại 2

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN MFN2 GÂY BỆNH CHACORT-MARIE-TOOTH LOẠI Mã số: < > Chủ nhiệm đề tài: TS BS Mai Phƣơng Thảo Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/ 2016 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN MFN2 GÂY BỆNH CHACORT-MARIE-TOOTH LOẠI Mã số: < > Chủ nhiệm đề tài TS BS Mai Phƣơng Thảo Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/ 2016 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ tên Chuyên ngành Lê Đông Sinh lý động Trúc TS Nguyễn Công nghệ Tấn Trung sinh học TS Đỗ Đức Chức Minh cấu trúc gen Cơ quan công tác ĐH khoa học tự nhiên ĐH Bách Khoa TPHCM ĐH Y Dƣợc TPHCM Đơn vị phối hợp chính: Nơi thực đề tài: Trung tâm Y Sinh học phân tử, ĐHYD TPHCM Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện ĐHYD TPHCM i MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU v MỞ ĐẦU 1.1 Bệnh Charcot-Marie-Tooth 1.2 Bệnh Charcot-Marie-Tooth loại Biểu lâm sàng Di truyền phân tử Gen MFN2 đột biến CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu CHƢƠNG KẾT QUẢ-BÀN LUẬN 12 3.1 Xây dựng quy trình giải trình tự DNA gen MFN2 12 3.2 Khảo sát đột biến lặp/mất đoạn exon gen MFN2 kỹ thuật MLPA 16 KẾT LUẬN 17 KIẾN NGHỊ 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 PHỤ LỤC 20 ii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại CMT dựa vào vận tốc dẫn truyền thần kinh (NCV) theo đặc điểm di truyền Bảng 1.2 Tổng hợp đột biến gen MFN2 liên quan CMT2 Bảng 2.1 Thông tin đoạn mồi sử dụng nghiên cứu Bảng 3.1 Tổng hợp đột biến gen MFN2 đối tƣợng nghiên cứu 15 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AD Autosomal Dominant AR Autosomal Recessive BLAST Basic local alignment tool BN Bệnh nhân CMT Charcot-Marie-Tooth ĐB Đột biến DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid GTT Giải trình tự IDT Intergrated DNA Technologies MC Mẫu chứng MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NCS Nerve Conduction Studies (Khảo sát dẫn truyền thần kinh) NCV Nerve Conduction Velocities (Vận tốc dẫn truyền thần kinh) NST Nhiễm Sắc Thể OMIM Online Mendelian Inheritance in Man PCR Polymerase chain reaction iv THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Xây dựng quy trình chẩn đốn đột biến gen MFN2 gây bệnh ChacortMarie-Tooth loại - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: TS BS Mai Phƣơng Thảo Điện thoại: 091 832 9999 Email: maithao292@gmail.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Bộ môn Sinh lý - Thời gian thực hiện: Mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA toàn exon vùng lân cận exon gen MFN2 Nội dung chính: Khảo sát toàn gen MFN2 ghi nhận đột biến kỹ thuật PCR Giải trình tự Sanger Phân tích kết phần mềm CLC Workbench so sánh kết với nghiên cứu trƣớc Kết đạt đƣợc: Ghi nhận SNP exon (c.-367A>G), intron (c.474+65C>T) exon 19 (c.*58A>G); đột biến chƣa xác định intron 11 (c.1160+45A>G) intron 16 (c.1873-64T>G) Thiết lập thành cơng kỹ thuật giải trình tự DNA xác định đột biến gen MFN2 gây bệnh CMT2 Quy trình ứng dụng để chẩn đốn gen MFN2 đối tƣợng khác v MỞ ĐẦU Bệnh lý thần kinh di truyền Charcot-Marie-Tooth (CMT) nhóm rối loạn đa dây thần kinh vận động cảm giác mạn tính Bệnh biểu triệu chứng lâm sàng nhƣ teo chi, kèm theo cảm giác gây biến dạng chi hay chi dƣới dạng bàn chân hình vịm, giảm phản xạ gân xƣơng [2] Một số trƣờng hợp nặng, bệnh có biểu giảm thính giác thị giác [9] Mặc dù không gây tử vong nhƣng tổn thƣơng vận động, cảm giác kèm biến dạng chi gây nhiều khó khăn cho ngƣời bệnh sinh hoạt thƣờng ngày Chẩn đoán bệnh CMT đƣợc thực dựa triệu chứng bệnh thay đổi khảo sát điện sinh lý CMT thƣờng đƣợc phân nhóm dựa vào kiểu tổn thƣơng tốc độ dẫn truyền thần kinh (Nerve Conduction Studies), CMT2-nhóm tổn thƣơng sợi trục (NCV ≥ 38m/s) phân nhóm bệnh [1], [11] Các nghiên cứu giới ghi nhận đột biến khoảng 14 gen khác chịu trách nhiệm cho CMT2, bao gồm: KIF1B (CMT2A1), MFN2(CMT2A2), RAB7 (CMT2B), TRPV4 (CMT2C), GARS (CMT2D), NEFL (CMT2E), HSPB1 (CMT2F), MPZ (CMT2I/J), GDAP1 (CMT2K), HSPB8 (CMT2L), DNM2 (CMT2M), AARS (CMT2N), LAMIN A (AR-CMT2A) MED25 (AR-CMT2B) [2], [9] Trong đó, đột biến gen MFN2 đƣợc ghi nhận nhiều (chiếm 33%) tổng số ca đƣợc chẩn đoán mắc CMT2 [16], [25] Nhận diện đƣợc đột biến gây bệnh có vai trị quan trọng việc chẩn đoán xác định tƣ vấn di truyền Mặc dù bệnh không gây tử vong nhƣng việc chẩn đốn xác bệnh vơ cần thiết tránh việc sử dụng thuốc điều trị không gây tốn đem lại tác dụng phụ không mong muốn cho ngƣời bệnh, đồng thời tƣ vấn nguy mắc bệnh qua hệ Đột biến gen MFN2 đƣợc miêu tả lần vào năm 2004 Züchner cs [25] Các nghiên cứu sau cho thấy đột biến gen MFN2 nguyên nhân phổ biến CMT2 [22] Do đó, gen MFN2 đƣợc chọn khảo sát trƣờng hợp chẩn đoán CMT2 lâm sàng MFN2 mã hoá cho protein màng ngồi ty thể, đóng vai trị quan trọng trình dung hợp ty thể, tạo lƣợng ATP cho tế bào thần kinh Cho đến nay, có 50 đột biến gen MFN2 gây bệnh CMT2 đƣợc mơ tả tồn giới Hầu hết, đột biến ghi nhận MFN2 đột biến điểm, đồng hợp dị hợp, di truyền trội nhiễm sắc thể thƣờng Chỉ có trƣờng hợp ghi nhận đột biến lặn đột biến dị hợp tử kép Tần suất mắc bệnh khác tùy vào dân tộc, Na-Uy Tây Ban Nha 3,4% -16% Bên cạnh đó, báo cáo Mỹ đƣa tỉ lệ xuất đột biến có liên quan CMT2 MFN2 21%, xấp xỉ với nghiên cứu trƣớc Anh 22% 33% tỉ lệ xuất đột biến MFN2 khảo sát đối tƣợng CMT2 Hàn Quốc Đến nay, chƣa có nghiên cứu bệnh Charcot-Marie-Tooth đƣợc thực Việt Nam Chúng tiến hành đề tài nhằm xây dựng quy trình giải trình tự DNA để khảo sát đƣợc toàn exon vùng lân cận gen MFN2, tiến đến ứng dụng chẩn đoán bệnh CMT2 cho ngƣời Việt Nam CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Charcot-Marie-Tooth Charcot-Marie-Tooth (CMT) nhóm bệnh ảnh hƣởng hệ thần kinh ngoại biên với tần suất mắc bệnh ƣớc tính khoảng 1/2500 [2], [8] Bệnh gây yếu cơ, giảm khả vận động hay cảm giác nhiều phần thể, chủ yếu tay chân Các chi bị teo, kèm theo cảm giác, tiến triển lâu ngày gây biến dạng chi hay chi dƣới dạng bàn chân hình vịm (pes cavus), giảm phản xạ gân xƣơng [2], [11] Trong số trƣờng hợp nặng, bệnh có biểu giảm thính giác thị giác [29] Mặc dù không gây tử vong nhƣng tổn thƣơng vận động, cảm giác kèm biến dạng chi gây nhiều khó khăn cho ngƣời bệnh sinh hoạt thƣờng ngày Dựa đánh giá triệu chứng lâm sàng, vận tốc truyền thần kinh (nerve conduction velocities - NCV) giải phẫu bệnh (histopathology), CMT đƣợc chia thành loại [8], [9], [14]: - Loại (CMT1): có tƣợng huỷ bao myelin sợi thần kinh (demyelinating form) Bao myelin lớp màng bao bên ngồi sợi trục thần kinh, hình thành từ tế bào Schwann, có vai trị quan trọng dẫn truyền xung động thần kinh (Hình 1.1) CMT1 đặc trƣng suy giảm nghiêm trọng vận tốc dẫn truyền thần kinh với NCV < 38m/s - Loại (CMT2): tổn thƣơng (thoái hoá) sợi trục thần kinh (axonal form) (Hình 1.1) Tổn thƣơng sợi trục làm sụt giảm biên độ đáp ứng vận động - cảm giác, vận tốc dẫn truyền thần kinh chậm nhƣng không đáng kể nhƣ CMT1, với NCV ≥ 38m/s Nhân tế bào Sợi nhánh Sợi trục Thân tế bào Bao Myelin Luồng thần kinh Tận synapse Hình 1.1 Cấu trúc tế bào thần kinh Exon 19 Exon Exon Exon M-19F M-19R M-19FS3 M-19FS2 M-3FN M-3RN M-4FN M-4RN M-5FN M-5RN TGT GTG TCA AGC GTC CTT AG GCA GGA TGG AAC AGT GAG TC GTG TAA GGG ACG ATT GGA GTT TC CTC CCT GAT CTC CAG AAC CTT CG TCT TGA TTC TCC CCA AAG CA GCA GAG CAT TTC TAA GGC TA AGG TGG ACT CGT TTA GGG TA AAG CAT GTC CCT GCC TGG AA GCT GGT ATC TGC GTT GTG AA TCT CCC ATT CAC CTC CAC AG 2370 509 823 522 Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tương ứng với cặp mồi: Mỗi tube PCR tích 25 l chứa thành phần: PCR buffer, dNTP (200 M cho loại), mồi xuôi ngƣợc (0,4 M cho loại), 0,6 U Taq PCR (New England Biolab, Anh) 50 ng genomic DNA Chu trình luân nhiệt cho PCR đƣợc thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 95°C phút, theo sau 30 chu kỳ gồm biến tính 94°C phút, gắn mồi 56°C phút, tổng hợp chuỗi DNA 68°C 90 giây, kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 68°C phút Phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% có nhuộm ethium bromide quan sát dƣới soi gel GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ), sản phẩm PCR mong muốn cho băng có kích thƣớc so với thang chuẩn 50 bp hay 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) Giải trình tự phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR đƣợc tinh đƣợc thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo chiều xuôi ngƣợc Sản phẩm sau đƣợc kết tủa ethanol, hịa tan Hi-Di formanide, biến tính 95C trƣớc làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đƣợc đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết giải trình tự đƣợc phân tích phần mềm CLC Main Workbench 5.5 Khảo sát đột biến lặp/mất đoạn kỹ thuật MLPA- Multiplex Ligation Probe Amplification 10 Phản ứng MLPA sử dụng Kit P250-B1 DiGeorge (MRC-Holland) chứa 38 mẫu dò lai đặc hiệu với 38 đoạn gen thƣờng xảy đột biến, ngồi cịn có đoạn nội chuẩn giúp kiểm chuẩn phản ứng PCR Các mẫu dò đƣợc thiết kế với trình tự acid nucleic giống hai đầu gắn mồi, vậy, cần sử dụng cặp mồi để khuếch đại toàn 38 mẫu dò tƣơng ứng với 38 gen khác với đoạn nội chuẩn Phản ứng MLPA đƣợc thực theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di máy ABI 3130 Genetic Analyzer Kết đƣợc phân tích phần mềm Coffalyser 11 CHƢƠNG KẾT QUẢ-BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng quy trình giải trình tự DNA gen MFN2 Gen MFN2 nằm nhiễm sắc thể 1, gồm 19 exon với chiều dài 33kb Đột biến genomic DNA khơng có tính khu trú vào vùng định mà phân bố khắp chiều dài gen, làm cho việc khảo sát đột biến gen phức tạp tốn Chúng tơi tiến hành khuếch đại tồn 19 exon gen MFN2 14 phản ứng PCR với 14 cặp mồi cụ thể đƣợc trình bày Bảng Sản phẩm thu đƣợc có kích thƣớc phù hợp với kích thƣớc đoạn gen mong muốn Các cặp mồi M-1F/M-1R, M-3F/M-3R, M-4F/M-4R M5F/M-5R khuếch đại exon 1, 3, 4, chƣa không khuếch đại đƣợc sản phẩm mục tiêu (giếng 1, 3, 4, 5) (Hình 3.1A) Sau thay đổi chu trình nhiệt, với cặp mồi khuếch đại exon 3, 4, không thu đƣợc sản phẩm mục tiêu Chúng tơi thay đổi trình tự mồi khuếch đại exon (Bảng 2.1) Cặp mồi M-12F/M-14R, M-16F/M17R, M-19F/M-19R (giếng 10, 12, 14) (Hình 3.1B) ngồi khuếch đại sản phẩm cịn xuất thêm băng phụ Tăng nhiệt độ lai Ta=60oC, thu đƣợc sản phẩm đặc hiệu Riêng exon vùng giàu GC, tiến hành tăng thời gian nhiệt độ biến tính chu kỳ phản ứng khuếch đại, cụ thể 95°C phút; 40 chu kỳ gồm 95°C phút, 60°C phút; 68°C phút; kết thúc 68°C phút Phản ứng cho sản phẩm đặc hiệu với băng ~ 686 bp; phù hợp với kích thƣớc đoạn gen cần khuếch đại (Hình 3.1C) Để thuận tiện tiến hành thí nghiệm, chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc đƣa chu trình sau: Exon 1: 95°C phút; 40 chu kỳ gồm 95°C phút, 60°C phút; 68°C phút; kết thúc 68°C phút Các exon lại: 95°C phút; 40 chu kỳ gồm 95°C 30 giây, 60°C 30 giây; 68°C 90 giây; kết thúc 68°C phút 12 A B C D Hình 3.1A PCR khuếch đại tồn 19 exon gen MFN2 Thang 1Kb plus Giếng 1-14: exon 1-19 (kích thước sản phẩm PCR trình bày Bảng 1) Hình 3.1B PCR khuếch đại exon 3, 4, 5, thang, giếng 1, 2, 3: exon 3, 4, Hình 3.1C PCR khuếch đại exon 1, thang, giếng 1: exon Hình 3.1D.Giải trình tự gen MFN2 Các sản phẩm PCR sau tinh đƣợc tiến hành giải trình tự chuỗi DNA theo kỹ thuật Sanger hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer cho kết trình tự chuỗi phù hợp với trình tự gen MFN2 (Hình 3.1D), chứng tỏ cặp mồi thiết kế khuếch đại đặc hiệu trình tự gen MFN2 Ứng dụng quy trình kỹ thuật thiết lập để khảo sát đột biến cho bệnh nhân đƣợc chẩn đoán nghi ngờ CMT2 Chúng ghi nhận số Single Nucleotide Polymorphism (SNP) [3] exon 1, intron 5, exon 19 đột biến intron 11 intron 16 (Bảng 3.1) 13 3.2A 3.2B 3.2D 3.2C 3.2E Hình 3.2A: Một đoạn kết giải trình tự exon gen MFN2 (đột biến c.-367A>G) Hình 3.2B: Một đoạn kết giải trình tự intron gen MFN2 (đột biến c.474+65C>T Hình 3.2C: Một đoạn kết giải trình tự intron 11 gen MFN2 (đột biến c.1160+45A>G) Hình 3.2D: Một đoạn kết giải trình tự intron 16 gen MFN2 (đột biến c.1873-64T>G) Hình 3.2E: Kết giải trình tự exon 19 gen MFN2 (đột biến c.*58A>G) 14 Bảng 3.1 Tổng hợp đột biến gen MFN2 đối tượng nghiên cứu Exon Intron Thành viên Vị trí đột biến Loại đột biến BN01 BN03 BN04 BN05 c.-367A>G Đồng hợp Exon 5’UTR Intron Intron 11 Intron 16 Exon 19 c.-367A>G Dị hợp BN01 c.474+65C> T Đồng hợp BN03 BN04 BN05 c.474+65C> T Dị hợp BN01 c.1160+45A >G Đồng hợp BN03 BN04 BN05 c.1160+45A >G Dị hợp BN01 c.187364T>G Đồng hợp c.187364T>G Dị hợp c.*58A>G Đồng hợp c.*58A>G Dị hợp BN03 BN04 BN05 BN01 BN03 BN04 BN05 Kết GTT SNP Nghiên cứu giới Hình 3.2A rs223605 Casasnovas cs, 2010 Hình 3.2B rs223605 Casasnovas cs, 2010 Hình 3.2C Chƣa ghi nhận Hình 3.2D Chƣa ghi nhận Hình 3.2E rs104284 Casasnovas cs, 2010 Các đột biến đƣợc di truyền từ ngƣời bố không mắc bệnh cho ngƣời Ba đột biến c.-367A>G, c.474+65C>T c.*58A>G đƣợc báo cáo SNP nghiên cứu Casasnovas cs.[5] Do đó, cho đột biến nguyên nhân gây bệnh BN03, BN04 BN05 Hai đột biến lại nằm intron 11 (c.1160+45A>G) intron 16 (c.1873-64T>G) , chƣa đƣợc báo cáo sở liệu đột biến MFN2 giới Do nằm vùng intron nên đột biến ảnh hƣởng đến trình sau phiên mã thay đổi hàm lƣợng protein Mfn2 tạo Mfn2 giảm/mất chức Chúng kiểm tra vị trí đột biến khơng nằm motif DNA bảo tồn cho trình ghép nối (splicing) intron 11 intron 16 Tuy nhiên để hiểu rõ hai đột biến ảnh hƣởng đến trình ghép nối, cần có thí nghiệm kiểm tra mRNA gen MFN2 có tồn loại mRNA với độ dài khác q trình splicing khơng thể diễn intron 11 intron 16 Đồng thời, cần phải tiến hành giải trình tự vùng đột biến ngƣời bình thƣờng cỡ mẫu lớn để xác định đột biến có xuất cá thể bình thƣờng hay không (do không thấy xuất ngƣời mẹ) để có kết luận xác 15 3.2 Khảo sát đột biến lặp/mất đoạn exon gen MFN2 kỹ thuật MLPA Các đột biến điểm, đột biến đoạn hay lặp đoạn exon có khả dẫn tới thay đổi trình tự acid amin đƣợc dịch mã, từ ảnh hƣởng đến chức protein Các đột biến lặp/mất đoạn exon gen MFN2 đƣợc phát kỹ thuật MLPA Trong báo cáo Polke cs ghi nhận đột biến hoàn toàn exon 7-8 khảo sát gen MFN2 gia đình kỹ thuật MLPA, kết đƣợc kiểm tra kỹ thuật long PCR [11] Các nghiên cứu gần Høyer cs tiến hành khảo sát song song gen MPZ MFN2 kỹ thuật MLPA chƣa phát đƣợc thêm đột biến lặp/mất đoạn sau nghiên cứu Polke cs [10], [17] Trong phạm vi đề tài này, chúng tơi tiến hành khảo sát nhằm tìm kiếm đột biến đoạn lặp đoạn có gen MFN2 cho mẫu DNA tồn thành viên gia đình Với thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng mẫu ngƣời bình thƣờng làm đối chứng, mẫu nƣớc làm chứng âm khơng chứa DNA Kết phân tích MLPA thành viên gia đình đƣợc phân tích phần mềm Coffalyser Tuy nhiên, không ghi nhận đột biến mất/lặp đoạn exon gen MFN2 (Hình 3.3A) Tỉ lệ đỉnh tín hiệu mẫu dị mẫu bệnh nhân (BN01, BN02, BN03, BN04, BN05) mẫu đối chứng (MC01, MC02) nằm khoảng bình thƣờng (trên giới hạn xanh lặp đoạn, dƣới giới hạn đỏ đoạn) Không ghi nhận đột biến lặp hay đoạn gen MFN2 kỹ thuật MLPA đối tƣợng đƣợc khảo sát 3.3A 3.3B Hình 3.3 Kết phân tích MLPA gen MFN2 đối tượng nghiên cứu BN03 (A) MC01 (B) Vùng màu xám đại diện cho mẫu dò tham khảo, vùng màu tím đại diện cho mẫu dị phân tích lặp/mất exon gen MPZ, vùng tím nhạt đại diện cho mẫu dị phân tích lặp/mất exon gen MFN2 (đại diện mẫu bệnh nhân CMT2 - BN03, đại diện mẫu chứng MC01) 16 KẾT LUẬN Qua kết đạt đƣợc, đƣa kết luận sau: Tối ƣu hoá phản ứng PCR - Các cặp mồi đƣợc chọn hoàn toàn đặc hiệu để khuếch đại toàn exon vùng lân cận gen mục tiêu MFN2, đảm bảo thông số lý thuyết lẫn thực tiễn - Tối ƣu hoá thành công phản ứng PCR xác định đƣợc độ đặc hiệu phản ứng thơng qua giải trình tự sản phẩm thu đƣợc Ứng dụng phƣơng pháp khảo sát phân tích đột biến gen - Phƣơng pháp khảo sát đột biến gen MFN2 đƣợc áp dụng cho ngƣời bệnh, chƣa phát đƣợc đột biến nhƣng xác định đƣợc SNP gen MFN2 - Kỹ thuật MLPA cho kết tốt ổn định chƣa ghi nhận đƣợc đột biến lặp/mất đoạn gen MFN2 KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu xây dựng thành công ứng dụng đƣợc phƣơng pháp khảo sát phát đột biến điểm gen MFN2 đột biến lặp/mất đoạn gen MFN2 liên quan đến bệnh lý Charcot-Marie-Tooth thể tổn thƣơng sợi trục thần kinh, làm tảng để chẩn đoán nghiên cứu bệnh lý Việt Nam 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO A.E Harding and P K Thomas (1980), “The clinical features of hereditary motor and sensory neuropathy types I and II,” Brain J Neurol., vol 103, no 2, pp 259–280 Bucci C et al (2012), "Charcot–Marie–Tooth disease and intracellular traffic", Progress in Neurobiology, 99(3), pp 191–225 14 Braathen G.J (2010), “MFN2 point mutations occur in 3.4% of Charcot-Marie-Tooth families An investigation of 232 Norwegian CMT families”, BMC Medical Genetics, 11, (48) Calvo J (2009), "Genotype-phenotype correlations in Charcot-Marie-Tooth disease type caused by itofusin mutations", Arch Neurol 66, pp.1511-1516 Casasnovas C et al (2010), "Phenotypic spectrum of MFN2 mutations in the Spanish population", Journal of medical genetics, 47(4), pp 249–256 16 Chung K.W et al (2006), "Early onset severe and late-onset mild Charcot-Marie-Tooth disease wi Darras B.T et al (2014), Neuromuscular Disorders of Infancy, Childhood, and Adolescence: A Clinician’s Approach, Elsevier El-Abassi R et al (2014), "Charcot-Marie-Tooth Disease: An Overview of Genotypes, Phenotypes, and Clinical Management Strategies", PM & R: the journal of injury, function, and rehabilitation, 6(4), pp 342–355 26 Gess B et al (2013), "Charcot-Marie-Tooth disease: frequency of genetic subtypes in a German neuromuscular center population", Neuromuscular disorders: NMD, 23(8), pp 647–651 29 10 Høyer Yer H et al (2015), "Copy Number Variations in a Population-Based Study of Charcot-Marie-Tooth Disease", BioMed Research International, 960404 11 M E Shy, J Y Garbern, and J Kamholz (2002), “Hereditary motor and sensory neuropathies: a biological perspective,” Lancet Neurol., vol 1, no 2, pp 110–118 12 Nicholson G.A (2008), “Severe early-onset axonal neuropathy with homozygous and compound heterozygous MFN2 mutations”, Neurology, 70(19), pp.1678-1759 13 Nicolaou P et al (2010), "Charcot-Marie-Tooth disease in Cyprus: epidemiological, clinical and genetic characteristics", Neuroepidemiology, 35(3), pp 171–177 43 14 Pareyson D and Marchesi C (2009), "Diagnosis, natural history, and management of Charcot-Marie-Tooth disease", The Lancet Neurology, 8(7), pp 654–667 15 Pareyson D and Marchesi C (2009), "Diagnosis, natural history, and management of Charcot-Marie-Tooth disease", The Lancet Neurology, 8(7), pp 654–667 18 16 Paschalis N (2013), "Advances in the molecular diagnosis of Charcot-MarieTooth disease", World J Neurol, 3(3), pp 42-55.47 17 Polke J.M et al (2011), "Recessive axonal Charcot-Marie-Tooth disease due to compound heterozygous mitofusin mutations", Neurology, 77(2), pp.168-173 49 18 Reilly M.M et al (2011), "Charcot-Marie-Tooth disease", Journal of the peripheral nervous system: JPNS, 16(1), pp 1–14 19 Rima El-Abassi, MD, John D England, MD, Gregory T Carter, MD, MS (2014), “Charcot-Marie-Tooth Disease: An Overview of Genotypes, Phenotypes, and Clinical Management Strategies”, the American A cademy of Physical Medicine and Rehabi litation, Vol 6, 342-355 20 Rune Østern (2012), "Charcot-Marie-Tooth disease (CMT)", Neuromuscular Disorders,22, pp 511–521 21 Saporta A.S.D et al (2011), "Charcot-marie-tooth disease subtypes and genetic testing strategies", Annals of Neurology, 69(1), pp 22–33 22 Szigeti K and Lupski J.R (2009) "Charcot–Marie–Tooth disease", European Journal of Human Genetics, 17(6), pp 703–710 23 Verhoeven K et al (2006), "MFN2 mutation distribution and genotype/phenotype correlation in Charcot-Marie-Tooth type 2", Brain: a journal of neurology, 129(8), pp 2093–2102 61 24 Züchner S and Vance J.M (2006), "Mechanisms of Disease: a molecular genetic update on hereditary axonal neuropathies", Nature Clinical Practice Neurology, 2(1), pp 45–53 25 Züchner S et al (2004), "Mutations in the mitochondrial GTPase mitofusin cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A", Nature Genetics, 36(5), pp 449–451 19 PHỤ LỤC (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (B) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (C) Phụ lục Kết điện di sp PCR cặp mồi khuếch đại exon 1- 19 khảo sát nhiệt độ (A)56 oC; (B)58 oC; (C)60oC Thang chuẩn Giếng 1: Mồi 1F/R - 686bp 2: Nước (-) 3: Mồi 2F/R - 435bp 4: Nước (-) 5: Mồi 3F/R - 509bp 6: Nước (-) 7: Mồi 4F/R - 823bp 8: Nước (-) 9: Mồi 5F/R - 522bp 10: Nước (-) 11: Mồi 6F/R - 451bp 12: Nước(-) 13: Mồi 7F/8R - 666bp 14: Nước(-) 15: Mồi 9F/R - 320bp 16: Nước(-) 17: Mồi 10F/11R - 667bp 18: Nước(-) 19: Mồi 12F/14R - 1242bp 20: Nước(-) 21: Mồi 15F/15R - 416bp 22: Nước(-) 23: Mồi 16F/17R - 933bp 24: Nước(-) 25: Mồi 18F/19R - 370bp 26: Nước(-) 27: Mồi 19F/19R - 2370bp 28: Nước(-) 20 (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (B) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (C) Phụ lục Kết PCR cặp mồi khuếch đại exon 1-19 khảo sát (A)30; (B)35; (C)40chu kỳ Thang chuẩn Giếng 1: Mồi 1F/R - 686bp 2: Nước (-) 3: Mồi 2F/R - 435bp 4: Nước (-) 5: Mồi 3F/R - 509bp 6: Nước (-) 7: Mồi 4F/R - 823bp 8: Nước (-) 9: Mồi 5F/R - 522bp 10: Nước (-) 11: Mồi 6F/R - 451bp 12: Nước(-) 13: Mồi 7F/8R - 666bp 14: Nước(-) 15: Mồi 9F/R - 320bp 16: Nước(-) 17: Mồi 10F/11R - 667bp 18: Nước(-) 19: Mồi 12F/14R - 1242bp 20: Nước(-) 21: Mồi 15F/15R - 416bp 22: Nước(-) 23: Mồi 16F/17R - 933bp 24: Nước(-) 25: Mồi 18F/19R - 370bp 26: Nước(-) 27: Mồi 19F/19R - 2370bp 28: Nước(-) 21 (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (B) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (C) Phụ lục Kết PCR cặp mồi khuếch đại exon 1- 19 khảo sát lƣợng DNA (A)50; (B)70; (C)90ng Thang chuẩn Giếng 1: Mồi 1F/R - 686bp 2: Nước (-) 3: Mồi 2F/R - 435bp 4: Nước (-) 5: Mồi 3F/R - 509bp 6: Nước (-) 7: Mồi 4F/R - 823bp 8: Nước (-) 9: Mồi 5F/R - 522bp 10: Nước (-) 11: Mồi 6F/R - 451bp 12: Nước(-) 13: Mồi 7F/8R - 666bp 14: Nước(-) 15: Mồi 9F/R - 320bp 16: Nước(-) 17: Mồi 10F/11R - 667bp 18: Nước(-) 19: Mồi 12F/14R - 1242bp 20: Nước(-) 21: Mồi 15F/15R - 416bp 22: Nước(-) 23: Mồi 16F/17R - 933bp 24: Nước(-) 25: Mồi 18F/19R - 370bp 26: Nước(-) 27: Mồi 19F/19R - 2370bp 28: Nước(-) 22 (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (B) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2000 1000 500 200 75 (C) Phụ lục Kết PCR cặp mồi khuếch đại exon – 19 khảo sát nồng độ mồi (A)0,4; (B)0,5; (C)0,6µM Thang chuẩn Giếng 1: Mồi 1F/R - 686bp 2: Nước (-) 3: Mồi 2F/R - 435bp 4: Nước (-) 5: Mồi 3F/R - 509bp 6: Nước (-) 7: Mồi 4F/R - 823bp 8: Nước (-) 9: Mồi 5F/R - 522bp 10: Nước (-) 11: Mồi 6F/R - 451bp 12: Nước(-) 13: Mồi 7F/8R - 666bp 14: Nước(-) 15: Mồi 9F/R - 320bp 16: Nước(-) 17: Mồi 10F/11R - 667bp 18: Nước(-) 19: Mồi 12F/14R - 1242bp 20: Nước(-) 21: Mồi 15F/15R - 416bp 22: Nước(-) 23: Mồi 16F/17R - 933bp 24: Nước(-) 25: Mồi 18F/19R - 370bp 26: Nước(-) 27: Mồi 19F/19R - 2370bp 28: Nước(-) 23 Phụ lục 5: Thang DNA đƣợc sử dụng đề tài 24 ... 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 20 00 1000 500 20 0 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 20 00 1000 500 20 0 75 (B) (kb) Thang 10 11 12 13... Nước(-) 27 : Mồi 19F/19R - 23 70bp 28 : Nước(-) 22 (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 20 00 1000 500 20 0 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ... Nước(-) 27 : Mồi 19F/19R - 23 70bp 28 : Nước(-) 21 (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 20 00 1000 500 20 0 75 (A) (kb) Thang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25