xây dựng quy trình khảo sát đột biến gen fgfr2 và fgfr3 trong dị tật dính liền sớm khớp sọ (craniosynostosis) ở trẻ em

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 TRONG DỊ TẬT DÍNH LIỀN SỚM KHỚP SỌ (CRANIOSYNOSTOSIS) Ở TRẺ EM Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân NGUYỄN THẾ VINH Tp Hồ Chí Minh, 03/2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 TRONG DỊ TẬT DÍNH LIỀN SỚM KHỚP SỌ (CRANIOSYNOSTOSIS) Ở TRẺ EM Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 04/2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Họ tên, học hàm học vị Chức danh trình thực nhiệm vụ Đơn vị công tác CN NGUYỄN THẾ VINH Chủ nhiệm đề tài Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dƣợc TP.HCM PGS.TS HOÀNG ANH VŨ Thành viên Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dƣợc TP.HCM MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TẬT DÍNH LIỀN KHỚP SỌ SỚM 1.2 NGUYÊN NHÂN VÀ CƠ CHẾ SINH BỆNH 1.3 TRIỆU CHỨNG 1.4 ĐIỀU TRỊ 10 1.5 PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 11 1.5.1 PHƢƠNG PHÁP PCR 11 1.5.2 PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ 14 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ 16 2.2.2 HÓA CHẤT 16 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 THIẾT KẾ MỒI 17 2.3.2 PHẢN ỨNG PCR 19 2.3.3 KIỂM TRA SẢN PHẨM PCR BẰNG ĐIỆN DI TRÊN THẠCH AGAROSE 20 2.3.4 TINH SẠCH SẢN PHẨM SAU PCR 20 2.3.5 GIẢI TRÌNH TỰ DNA 20 2.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI 22 3.2 KẾT QUẢ PCR 23 3.3 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN FGFR2 VÀ FGFR3 25 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 27 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH SÁCH HÌNH HÌNH 3.1 PHẢN ỨNG PCR 12 HÌNH 3.1 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN NGẮN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 24 HÌNH 3.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN DÀI GEN FGFR2 25 HÌNH 3.3 ĐỘT BIẾN C.1988G>A (P.G663Q) TRÊN GEN FGFR2 CỦA MẪU CRSY-4 26 DANH SÁCH BẢNG BẢNG 2.1 TRÌNH TỰ MỒI KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN FGFR2 VÀ FGFR3 18 BẢNG 2.2 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG PCR 19 BẢNG 2.3 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG SEQUENCING 20 BẢNG 3.1 KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI GEN FGFR2 VÀ FGFR3 22 BẢNG 3.2 CÁC PHẢN ỨNG PCR THỰC HIỆN KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN NGẮN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 23 BẢNG 3.3 CÁC PHẢN ỨNG PCR THỰC HIỆN KHUẾCH ĐẠI NHỮNG ĐOẠN DÀI GEN FGFR2 24 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 TRONG DỊ TẬT DÍNH LIỀN SỚM KHỚP SỌ (CRANIOSYNOSTOSIS) Ở TRẺ EM - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: CN Nguyễn Thế Vinh Điện thoại: 0935 827 668 Email: vinhnguyen29391@gmail.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017 Mục tiêu: Thiết lập quy trình giải trình tự gen FGFR2 FGFR3 cho bệnh nhân đƣợc chẩn đốn lâm sàng mắc dị tật dính liền sớm khớp sọ Nội dung chính: - Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho kiểu gen FGFR2 FGFR3 - Tối ƣu hoá điều kiện phản ứng PCR - Xây dựng quy trình giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger cho vùng mã hóa gen FGFR2 FGFR3 Kết đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ): Cơng bố tạp chí nƣớc (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại: Dị tật dính liền sớm khớp sọ liên quan đến gen FGFR thuộc nhóm di truyền trội nhiễm sắc thể thƣờng Ngoài việc đánh giá lâm sàng, đánh giá mặt di truyền phân tử quan trọng thân nhân ngƣời mang gen bệnh, can thiệp sớm giảm nhẹ đƣợc hậu dị tật Xét nghiệm tiền sinh cần thiết cho bà mẹ mang thai có nguy cao mang đột biến gây gen FGFR có tiền sử gia đình có ngƣời mắc bệnh Đề tài nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn, phƣơng pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, ứng dụng cho nghiên cứu với cỡ mẫu lớn Ngồi ra, thí nghiệm tƣơng đối đơn giản, giá thành rẻ MỞ ĐẦU Dị tật dính liền sớm khớp sọ trẻ em dị tật bẩm sinh xảy khớp sợ dính vào giai đoạn phát triển sớm trẻ (4) Điều khiến hộp sọ có hình dạng bất thƣờng, phát triển hộp sọ bị hạn chế dẫn đến vấn đề thị giác, thần kinh chậm phát triển tâm thần(5) Nguyên nhân thƣờng gặp dị tật dính liền sớm khớp sọ đột biến gen FGFR2 FGFR3 FGFR2 FGFR3 mã hóa cho protein thuộc họ thụ thể yếu tố tăng trƣởng ngun bào sợi(3) FGFR2 đóng vai trị quan trọng phát triển phôi sửa chữa mô, đặc biệt mơ xƣờng mạch máu FGFR3 có vai trò liên kết với yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi acid base, ảnh hƣởng đến phát triển trì cấu trúc xƣơng(2) Việc điều trị dị tật dính liền sớm khớp sọ chủ yếu dựa vào việc giải phẫu hộp sọ Quá trình điều trị đòi hỏi nhiều khâu phẫu thuật phù hợp với bệnh nhân Một số bệnh nhân cần phẫu thuật sớm giai đoạn tháng tuổi, số giai đoạn muộn khoảng tháng tuổi đến năm tuổi Việc điều trị sớm hạn chế đƣợc nhiều biến chứng cho bệnh nhân nhƣ tràn dịch não, thiểu trí tuệ, vấn đề vệ thị giác Dị tật dính liền sớm khớp sọ liên quan đến gen FGFR thuộc nhóm di truyền trội nhiễm sắc thể thƣờng Ngoài việc đánh giá lâm sàng, đánh giá mặt di truyền phân tử quan trọng thân nhân ngƣời mang gen bệnh, can thiệp sớm giảm nhẹ đƣợc hậu dị tật này(1) Xét nghiệm tiền sinh cần thiết cho bà mẹ mang thai có nguy cao mang đột biến gây gen FGFR có tiền sử gia đình có ngƣời mắc bệnh Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật y sinh học phân tử (PCR, giải trình tự Sanger) để tìm kiếm đột biến gen FGFR2 FGFR3, đƣa thêm phƣơng pháp chẩn đoán phƣơng diện di truyền cho bệnh dị tật dính liền sớm khớp sọ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tật dính liền khớp sọ sớm Dính liền sớm khớp sọ (Craniosynostosis - CSO) kết hợp sớm hay dính liền sớm đƣờng khớp sọ Có thể dính đƣờng khớp chẳng hạn nhƣ đƣờng khớp trán (Tật sọ hình tam giác - trigonocephaly), đƣờng trục dọc (Tật đầu hình thuyền - scaphocephaly), đƣờng khớp trán đỉnh bên (Tật đầu nghiêng - plagiocephaly), đƣờng khớp trán đỉnh hai bên (tật đầu ngắn brachycephaly) nhiều đƣờng khớp lúc Nó làm cho đầu phát triển bất thƣờng phải chỉnh lại vịm đầu biến dạng kèm theo hộp sọ Các hội chứng dính liền sớm khớp sọ dính sớm nhiều đƣờng khớp sọ gây loạt dấu hiệu triệu chứng đặc trƣng hình dạng phát triển bất thƣờng đầu mặt Các hội chứng dính liền sớm khớp sọ điển hình hội chứng Aperts, Crouzons, Pfeiffer, Carpenter, Saethre-Chotzen, hội chứng dị thƣờng Kleeblattschadel (liền tất khớp sọ) Trong hội chứng này, đầu mặt trẻ phát triển bất thƣờng phải phẫu thuật sửa chữa nhiều lần để có hiệu tối ƣu mặt chức thẩm mỹ 1.2 Nguyên nhân chế sinh bệnh Nguyên nhân thƣờng gặp dị tật dính liền sớm khớp sọ đột biến gen FGFR2 FGFR3 FGFR2 FGFR3 mã hóa cho protein thuộc họ thụ thể yếu tố tăng trƣởng ngun bào sợi(3) FGFR2 đóng vai trị quan trọng phát triển phôi sửa chữa mô, đặc biệt mơ xƣờng mạch máu FGFR3 có vai trị liên kết với yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi acid base, ảnh hƣởng đến phát triển trì cấu trúc xƣơng(2) 1.3 Triệu chứng Một số trƣờng hợp “hẹp hộp sọ” tình trạng biến dạng bẹp, phẳng (ví dụ nhƣ tình trạng “lazy lambdoid”, xem phần dƣới) Trong trƣờng hợp nghi ngờ, cần phải hƣớng dẫn cha mẹ quan sát vùng đầu bị phẳng khám lại bệnh nhân 6-8 tuần: tình trạng biến dạng phẳng, đƣợc cải thiện, CSO, cần phải xác định cẩn thận Chẩn đốn CSO đƣợc củng cố bởi: Sờ thấy ụ xƣơng khớp nghi ngờ bị hẹp (ngoại trừ hẹp khớp lamboid) Ấn nhẹ ngón gây di chuyển nhẹ xƣơng hai bên khớp X quang sọ: - Thiếu hụt dấu hiệu sáng rõ khớp Một số trƣờng hợp có X quang bình thƣờng khớp (thậm chí CT) hình thành gai xƣơng nhỏ chỗ - Vòm sọ bị dát mỏng (xem trang 101), tiêu khớp ăn mòn vùng hố yên quan sát đƣợc số trƣờng hợp tăng áp lực nội sọ CT Scan: - Có thể xác nhận đƣợc đƣờng viền xƣơng - Có thể biểu lộ đƣợc độ dày và/hoặc bờ vị trí hẹp - Có thể xác định đƣợc tình trạng dãn não thất có - Có thể biểu thị hình ảnh khoang dƣới nhện vùng trán rộng - Chụp CT ba chiều giúp có nhiều thơng tin bất thƣờng Trong trƣờng hợp nghi ngờ, phải chụp xạ đồ xƣơng (technetium bone) • Độ tập trung xƣơng vùng quanh khớp giảm tuần sau đẻ • Trong trƣờng hợp khớp đóng sớm, có tăng hoạt động tế bào xƣơng so với khớp (bình thƣờng) • Trong trƣờng hợp khớp đóng khơng kín, khơng có dấu hiệu hấp thu phóng xạ vùng quanh khớp Chụp MRI: thƣờng đƣợc định cho trƣờng hợp kèm với bất thƣờng nội sọ Thƣờng không hữu dụng nhƣ chụp CT Đo đạc, chẳng hạn nhƣ chu vi trán-đỉnh khơng bất thƣờng chí trƣờng hợp hộp sọ biến dạng CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 2.1 Nghiên cứu đƣợc thực mẫu DNA bệnh nhân đƣợc chẩn đốn lâm sàng có dị tật dính liền khớp sọ sớm Kết trình tự gen FGFR2 FGFR3 mẫu DNA đƣợc phát phƣơng pháp giải trình tự gen Sanger hệ thống may ABI 3500 Mẫu genomic DNA đƣợc thu nhận từ máu bệnh nhân đƣợc chẩn đốn dị tật dính liền khớp sọ sớm Mẫu máu bệnh nhân đƣợc đánh mã số CRSY-4 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ  Máy ly tâm thƣờng (Eppendorf, Đức)  Máy PCR (Mastercycler® vapo protect, Eppendorf, Đức)  Máy spin (Hanil, Đức)  Máy vortex (Heidolph, Đức)  Máy Real time AG 22331 Hamburg (Erpendorf, Đức)  Tủ ATSH cấp II (ESCO Labculture®, Hoa Kì)  Cân điện tử (Sartorius, Hoa Kì); lị vi sóng (SANYO, Nhật)  Máy điện di (ADVANCE, Mupid®-exU System, Đức)  Máy đọc gel UV (UVP, GelDoc-It® 310, Hoa Kì)  Tủ mát 4oC tủ đơng -30oC, -80oC (SANYO, Nhật)  Máy giải trình tự gen ABI 3500  Vật liệu tiêu hao 2.2.2 Hóa chất - Kit PCR TaKaRa®Taq HS (Takara, Nhật)  TaKaRa HS Taq (5 units/µl)  10X PCR buffer  100mM Tris-HCl (pH8.3)  500mM KCl  15mM MgCl2  Thành phần dNTP  2,5mM cho loại dNTP  Hòa tan nƣớc có pH 7-9 - Nƣớc PCR (MiliQ), dung dịch EDTA 0.5 pH = (Merck, Đức) - Kit giải trình tự gen BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) - Kit tinh sản phẩm PCR Exo-Sap (GE healthcare) 2.2.2.1 2.3 Điện di  Dung dịch 5X TBE  Tris (Merck, USA): 54g  Acid boric (Merck, USA): 27.5g  0.5M EDTA pH8: 20ml  Nƣớc: thêm đủ 1000 ml (từ dung dịch 5X pha thành 0.5X)  Dung dịch nạp mẫu 6X (Thermo Scientific, Hoa Kì)  Agarose dạng bột (Promega, Hoa Kì)  GelRed Dye (Thẻmo Scientific, Hoa Kì)  Thang DNA 1kbplus (0.5 µg/µL) (Thermo Scientific, Hoa Kì) Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế mồi Sử dụng phần mềm CLC main workbench tải trình tự gen FGFR2 FGFR3 ngƣời từ NCBI (NG_012449.2 NG_012632.1), sau sử dụng cơng cụ thiết kế mồi sẵn có phần mềm để thiết kế mồi PCR cho exon gen FGFR2 FGFR3 Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại giải trình tự gen FGFR2 FGFR3 Mồi xi (5’-3’) Mồi ngƣợc (5’-3’) Tên mồi FGFR22F FGFR23F FGFR25F FGFR26F FGFR27F FGFR210F FGFR214F FGFR216F FGFR217F FGFR28F FGFR211R FGFR213F2 Tên mồi FGFR22R FGFR24R FGFR25R2 FGFR26R FGFR29R FGFR213R2 FGFR215R FGFR216R FGFR218R2 FGFR29F FGFR212R FGFR218F2 FGFR32F FGFR33F FGFR35F FGFR38F1 FGFR311F FGFR3- Trình tự GTTTTATCCCACTTGGGCTG TTCTCCTGGGAATAAGCAGG CCAGCTGGATTAGACTTCTG CAAGAAAGCACAGTACTTGG TTTCTGGCATGAGGTCACTG AGATTCGATACTCTGGCTGG TTTGTTCTGGCGGTGTTTTG GGTGTTTATGTCTCAGCTGG TACACCACGTCCCCATATTG TGCATGTGTAGGAGGTGAAG AGTTCACATGCCACAAAAGG CTGAATTGCCCAAGGGGAGA CTCCTCCTGTAGTCTCCCGA ACTGCTGTGTCTGTAAACGG ACACAGGACGGGAAACTGAG ATCGCTCTGCTCTCTCTTTG CTCTTCGTCCTTACGAGCAG AGTGACGTGTACGTGTCCTG FGFR32R2 FGFR34R FGFR37R FGFR310R FGFR315R FGFR3- Trình tự Kích thƣớc sản Vùng exon phẩm khuếch đại (bp) CGATCTGGTGCTCTTAGAAG 455 GACAAGAAGACAGGTGACAG 1382 3, TGCAGTGAACCGAGATCGCA 472 GGGAGAAACAGGACTTAACG 285 AGGACAAGATCCACAAGCTG 5225 TGCGAGGGCTTGATCTAGCA 7604 7, 8, 10, 11, 12, 13 GCAGCCACTAAAGAAGGAAG 908 14, 15 GGAGAGGTATTACTGGTGTG 284 16 AACAAGGAAGGCAGAACGCA 4349 17, 18 TGCTATGATGCGTCAGTCTG TTAAACATGCACACAGGGTG CACCTTGTTATCCTGACCCA Mồi sử dụng giải trình tự TCGCACTTGGAGGGTAGCTG 436 CATCTAGAGCCATGTCAGTG 805 3, CCTAGACCCAAATCCTCACG 874 5, 6, GCTCGTAAGGACGAAGAGTG 1546 GTAGAAACCACACCCAGGAG CATCTGCACTGAGTCTCATG 1245 1037 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19 16F FGFR38R 18R Mồi sử dụng giải trình tự TAACGCCAGTGAGTCTAGAG 2.3.2 Phản ứng PCR Thực PCR thƣờng: Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tạo vùng trình tự ngắn: tube PCR tích 15 l chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mồi xuôi ngƣợc (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nƣớc cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình luân nhiệt cho PCR đƣợc thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 98oC phút, với 40 chu kỳ lặp lại bƣớc 98oC : 10 giây, 58oC : 20 giây, 72oC : phút 20 giây; với bƣớc 72oC : phút Trữ sản phẩm PCR 4oC Thực Long range PCR: Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tạo vùng trình tự dài: tube PCR tích 15 l chứa thành phần: 1,5μl 10X LA PCR buffer (Mg+ plus); 2,5μl dNTP mixture 2,5mM; 0,75μl mồi xuôi ngƣợc (10nM/μl), 0,15μl TaKaRa LA TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 1,5μl genomic DNA (20-50ng/μl) 7,85μl nƣớc cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình luân nhiệt cho PCR đƣợc thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 98oC phút, với 30 chu kỳ lặp lại bƣớc 98oC : 10 giây, 68oC : phút; với bƣớc 68oC : phút Trữ sản phẩm PCR 4oC Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần 10X buffer PCR Thể tích (µl) 1.5 Nồng độ phản ứng 1X dNTPs 250nm 1.5 20 nM Primer forward (10µM) 0,75 500 nM Primer reverse (10µM) 0,75 500 nM Taq Takara HS 0,1 DNA 50-100 ng H2 O 8,4 Vừa đủ 15 µl 2.3.3 Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose Sử dụng thạch agarose 2% cho sản phẩm PCR kích thƣớc ngắn( ≤ 2000bp), thạch agarose 0,75% cho sản phẩm PCR có kích thƣớc dài ( ≥ 2000bp), thạch agarose nhuộm với Gel Red quan sát hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) 2.3.4 Tinh sản phẩm sau PCR Trƣờng hợp có băng phụ xuất hiện, sản phẩm PCR mong muốn đƣợc cắt từ gel tinh Sản phẩm PCR trực tiếp cắt từ gel sau đƣợc tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hƣớng dẫn sử dụng nhà sản xuất Tinh trực tiếp sản phẩm PCR enzyme Exo Sap 2.3.5 Giải trình tự DNA Sản phẩm PCR đƣợc tinh đƣợc thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi ngƣợc Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Sequencing Thành phần 1X buffer sequencing Thể tích (µl) 6.4 Nồng độ phản ứng 1X BigDye 20 nM Primer (5µM) 0,6 500 nM Sản phẩm PCR 50-100 ng Sản phẩm sau đƣợc kết tủa ethanol tuyệt đối, lạnh, với hỗ trợ tủa muối NH4OAC, hòa tan Hi-Di formaldehyde, biến tính 96C trƣớc làm lạnh đột ngột 4oC Trình tự DNA đƣợc đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu Thời gian thực nghiên cứu từ tháng 6/2016 đến tháng 6/2017 Địa điểm thực nghiên cứu: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - ĐH Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, P11, Q5, Tp Hồ Chí Minh CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết thiết kế mồi Cặp mồi đƣợc thiết kế phần mềm CLC Main Workbench 5.5; vùng thiết kế dựa trình tự vùng mã hóa gen FGFR2 FGFR3 Tổng số mồi thiết kế 19 cặp mồi, khuếch đại vùng mã hóa protein gen FGFR2 FGFR3 Bảng 3.1 Kết thiết kế mồi gen FGFR2 FGFR3 Kích thƣớc sản phẩm (bp) Mồi xuôi (5’-3’) Mồi ngƣợc (5’-3’) Tên mồi Trình tự Tên mồi GTTTTATCCCACTTGGGCTG FGFR2-2R CGATCTGGTGCTCTTAGAAG 455 TTCTCCTGGGAATAAGCAGG 1382 3, CCAGCTGGATTAGACTTCTG FGFR2-4R GACAAGAAGACAGGTGACAG FGFR25R2 TGCAGTGAACCGAGATCGCA 472 CAAGAAAGCACAGTACTTGG FGFR2-6R GGGAGAAACAGGACTTAACG 285 TTTCTGGCATGAGGTCACTG FGFR2-9R FGFR213R2 FGFR215R FGFR216R FGFR218R2 AGGACAAGATCCACAAGCTG 5225 7, 8, TGCGAGGGCTTGATCTAGCA 7604 10, 11, 12, 13 GCAGCCACTAAAGAAGGAAG 908 14, 15 GGAGAGGTATTACTGGTGTG 284 16 AACAAGGAAGGCAGAACGCA 4349 17, 18 FGFR2-9F FGFR212R FGFR218F2 TGCTATGATGCGTCAGTCTG FGFR22F FGFR23F FGFR25F FGFR26F FGFR27F FGFR210F FGFR214F FGFR216F FGFR217F FGFR28F FGFR211R FGFR213F2 AGATTCGATACTCTGGCTGG TTTGTTCTGGCGGTGTTTTG GGTGTTTATGTCTCAGCTGG TACACCACGTCCCCATATTG TGCATGTGTAGGAGGTGAAG AGTTCACATGCCACAAAAGG CTGAATTGCCCAAGGGGAGA Trình tự Vùng exon khuếch đại TTAAACATGCACACAGGGTG CACCTTGTTATCCTGACCCA Mồi sử dụng giải trình tự FGFR32F FGFR33F FGFR35F FGFR38F1 FGFR311F FGFR316F FGFR38R CTCCTCCTGTAGTCTCCCGA FGFR32R2 TCGCACTTGGAGGGTAGCTG 436 ACTGCTGTGTCTGTAAACGG FGFR3-4R CATCTAGAGCCATGTCAGTG 805 3, CCTAGACCCAAATCCTCACG 874 5, 6, GCTCGTAAGGACGAAGAGTG 1546 ACACAGGACGGGAAACTGAG FGFR3-7R FGFR3ATCGCTCTGCTCTCTCTTTG 10R FGFR3CTCTTCGTCCTTACGAGCAG 15R FGFR3AGTGACGTGTACGTGTCCTG 18R GTAGAAACCACACCCAGGAG CATCTGCACTGAGTCTCATG TAACGCCAGTGAGTCTAGAG 3.2 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 1245 16 1037 17, 18, 19 Mồi sử dụng giải trình tự Kết PCR Để khuếch đại tồn vùng trình tự mã hóa gen FGFR2 FGFR3 chúng tơi sử dụng kết hợp 12 cặp mồi, khuếch đại thành công với sản phẩm có kích thƣớc mong muốn phản ứng kèm với chứng âm âm tính (các giếng số chẵn), nhằm tiết kiệm chi phí thời gian, nhƣng đảm bảo đƣợc tính trung thực kết thí nghiệm Bảng 3.2 Các phản ứng PCR thực khuếch đại đoạn ngắn gen FGFR2 FGFR3 Cặp mồi FGFR2-2F/FGFR2-2R FGFR2-3F/FGFR2-4R FGFR2-5F/FGFR2-5R2 FGFR2-6F/FGFR2-6R FGFR2-14F/FGFR2-15R FGFR2-16F/FGFR2-16R FGFR3-2F/FGFR3-2R2 FGFR3-3F/FGFR3-4R FGFR3-5F/FGFR3-7R Genomic DNA từ máu Chứng âm Kích thƣớc vùng bệnh nhân (nƣớc) khuếch đại (bp) 11 13 15 17 10 12 14 16 18 455 1382 472 285 908 284 436 805 874 FGFR3-8F1/FGFR3-10R FGFR3-11F/FGFR3-15R FGFR3-16F/FGFR3-18R 19 21 23 20 22 24 1546 1245 1037 Hình 3.1 Kết phản ứng PCR khuếch đại đoạn ngắn gen FGFR2 FGFR3 Bảng 3.3 Các phản ứng PCR thực khuếch đại đoạn dài gen FGFR2 Cặp mồi Genomic DNA từ Chứng âm Kích thƣớc vùng máu bệnh nhân (nƣớc) khuếch đại (bp) FGFR2-7F/FGFR2-9R FGFR2-10F/FGFR2-13R FGFR2-17F/FGFR2-18R2 5225 7604 4349 Hình 3.2 Kết phản ứng PCR khuếch đại đoạn dài gen FGFR2 cặp mồi khuếch đại thành cơng với sản phẩm có kích thƣớc mong muốn phản ứng kèm với chứng âm âm tính (các giếng số chẵn) Các sản phẩm PCR sau đƣợc tiến hành tinh giải trình tự cho kết trùng khớp với trình tự gen tham khảo FGFR2 (NG_012449.2) FGFR3 (NG_012632.1 ) 3.3 Kết giải trình tự gen FGFR2 FGFR3 Phát đƣợc điểm đột biến gen FGFR3 bệnh nhân CRSY-4:  c.882T>C (p.N294N) Phát đƣợc điểm đột biến gen FGFR2 bệnh nhân CRSY-4:  IVS3-371C>T  c.696A>G (p.V232V)  IVS7+314G>A  c.1988G>A (p.G663Q) Hình 3.3 Đột biến c.1988G>A (p.G663Q) gen FGFR2 mẫu CRSY-4 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN Dị tật dính liền sớm khớp sọ trẻ em dị tật bẩm sinh xảy khớp sợ dính vào giai đoạn phát triển sớm trẻ (4) Điều khiến hộp sọ có hình dạng bất thƣờng, phát triển hộp sọ bị hạn chế dẫn đến vấn đề thị giác, thần kinh chậm phát triển tâm thần(5) Nguyên nhân thƣờng gặp dị tật dính liền sớm khớp sọ đột biến gen FGFR2 FGFR3 FGFR2 FGFR3 mã hóa cho protein thuộc họ thụ thể yếu tố tăng trƣởng ngun bào sợi(3) FGFR2 đóng vai trị quan trọng phát triển phôi sửa chữa mô, đặc biệt mơ xƣờng mạch máu FGFR3 có vai trò liên kết với yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi acid base, ảnh hƣởng đến phát triển trì cấu trúc xƣơng(2) Việc điều trị dị tật dính liền sớm khớp sọ chủ yếu dựa vào việc giải phẫu hộp sọ Quá trình điều trị đòi hỏi nhiều khâu phẫu thuật phù hợp với bệnh nhân Một số bệnh nhân cần phẫu thuật sớm giai đoạn tháng tuổi, số giai đoạn muộn khoảng tháng tuổi đến năm tuổi Việc điều trị sớm hạn chế đƣợc nhiều biến chứng cho bệnh nhân nhƣ tràn dịch não, thiểu trí tuệ, vấn đề vệ thị giác Dị tật dính liền sớm khớp sọ liên quan đến gen FGFR thuộc nhóm di truyền trội nhiễm sắc thể thƣờng Ngoài việc đánh giá lâm sàng, đánh giá mặt di truyền phân tử quan trọng thân nhân ngƣời mang gen bệnh, can thiệp sớm giảm nhẹ đƣợc hậu dị tật này(1) Xét nghiệm tiền sinh cần thiết cho bà mẹ mang thai có nguy cao mang đột biến gây gen FGFR có tiền sử gia đình có ngƣời mắc bệnh Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật y sinh học phân tử (PCR, giải trình tự Sanger) để tìm kiếm đột biến gen FGFR2 FGFR3, đƣa thêm phƣơng pháp chẩn đoán phƣơng diện di truyền cho bệnh dị tật dính liền sớm khớp sọ Kết thí nghiệm cho thấy phản ứng PCR xảy đặc hiệu, không tạo band phụ primer dimer, sản phẩm khuếch đại rõ ràng, nồng độ cao Các phản ứng Long range PCR cho gen FGFR2 nhằm mục đích khuếch đại đoạn lớn gen để giảm thiểu số lƣợng phản ứng PCR phải thực hiện, ví dụ nhƣ cặp mồi FGFR2-10F/FGFR2-13R khuếch đại đƣợc vùng gen gồm exon 10, 11, 12, 13 thay hai exon nhƣ phản ứng PCR bình thƣờng Điều giúp tiết kiệm thời gian, tiền bạc công sức thực giải trình tự gen FGFR2 Trên vùng gen FGFR2 tìm thấy điểm đột biến, đột biến exon (c.696A>G) không gây thay đổi axit amin, đột biến intron (IVS3371C>T IVS7+314G>A) không nằm vùng bảo tồn cắt nối đột biến sai nghĩa exon 15 (c.1988G>A) làm thay đổi glycine thành glytamine, có khả cao đột biến gây bệnh Trên vùng gen FGFR3 tìm thấy đột biến vị trí c.882T>C exon 7, đột biến đồng nghĩa không gây thay đổi axit amin CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết thí nghiệm cho thấy chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình giải trình gen FGFR2 FGFR3 cho mục đích nghiên cứu đột biến gen bệnh nhân có dị tật dính liền khớp sọ sớm Từ vấn đề thấy cần thực thí nghiệm thí nghiệm với số lƣợng mẫu lớn để cung cấp thêm thông tin gen di truyền cho nghiên cứu dị tất dính liền khớp sọ sớm sau TÀI LIỆU THAM KHẢO Barik M, Bajpai M, Malhotra A, Samantaray J, Dwivedi S(Craniosynostosis and Genetic Engineering Lenton KA, Nacamuli RP, Wan DC, Helms JA, Longaker MT(2005) Cranial suture biology Current topics in developmental biology, 66:287-328 Passos-Bueno MR, Sertié AL, Jehee FS, Fanganiello R, Yeh E: Genetics of craniosynostosis: genes, syndromes, mutations and genotype-phenotype correlations In: Craniofacial Sutures vol 12: Karger Publishers; 2008: 107-143 Silva S, Jeanty P(1999) Cloverleaf skull or kleeblattschadel The Fetus net Slater BJ, Lenton KA, Kwan MD, Gupta DM, Wan DC, Longaker MT(2008) Cranial sutures: a brief review Plastic and reconstructive surgery, 121(4):170e178e ... (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 TRONG DỊ TẬT DÍNH LIỀN SỚM KHỚP SỌ (CRANIOSYNOSTOSIS) Ở TRẺ EM Mã số: Chủ nhiệm đề tài... TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thơng tin chung: - Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FGFR2 VÀ FGFR3 TRONG DỊ TẬT DÍNH LIỀN SỚM KHỚP SỌ (CRANIOSYNOSTOSIS) Ở TRẺ EM - Mã số:... ngắn gen FGFR2 FGFR3 Cặp mồi FGFR2- 2F /FGFR2- 2R FGFR2- 3F /FGFR2- 4R FGFR2- 5F /FGFR2- 5R2 FGFR2- 6F /FGFR2- 6R FGFR2- 14F /FGFR2- 15R FGFR2- 16F /FGFR2- 16R FGFR3- 2F /FGFR3- 2R2 FGFR3- 3F /FGFR3- 4R FGFR3- 5F /FGFR3- 7R