Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR. Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học HỒN THIỆN QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN JAK2 & CALR TRONG BỆNH TĂNG SINH TỦY MẠN TÍNH Trần Tuấn Anh*, Trần Mai Hồng*, Nguyễn Lê Anh*, Nguyễn Thùy Trang*, Nguyễn Vũ Bảo Anh*, Nguyễn Hà Thanh*, Bạch Quốc Khánh*, Dương Quốc Chính* TĨM TẮT Mục tiêu: Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 CALR Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính Đối tượng: Tổng số 51 mẫu bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính, âm tính với nhiễm sắc thể Ph 1, chẩn đoán theo dõi điều trị Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Phương pháp: Nghiên cứu tiến cứu kết hợp hồi cứu, mơ tả cắt ngang Kết quả: Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 CALR gồm: giải trình tự gen JAK2, CALR phương pháp NGS; xác định đột biến JAK2V617F phương pháp mồi suy biến; đơn giản hóa quy trình xét nghiệm đột biến CALR type type phương pháp PCR mồi đặc hiệu Ứng dụng quy trình hồn thiện 51 bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính với kết phân tích đột biến: JAK2V617F chiếm 83,3% bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát 66,7% bệnh nhân xơ tủy nguyên phát Với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, đột biến CALR type chiếm 11,4% CALR type chiếm 5,7% JAK2V617F chiếm 71,4% Kết luận: Nghiên cứu hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2V617F phương pháp mồi suy biến; xây dựng quy trình PCR để phát đột biến CALR type 1, type 2; quy trình NGS phát đột biến gặp Bộ quy trình hồn thiện ứng dụng phân tích đột biến cho 51 bệnh nhân MPNs Từ khóa: MPNs, CALR, JAK2 ABSTRACT OPTIMIZATION OF DETECTION PROTOCOLS FOR JAK2 AND CALR MUTATION IN MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASM Tran Tuan Anh, Tran Mai Hong, Nguyen Le Anh, Nguyen Thuy Trang, Nguyen Vu Bao Anh, Nguyen Ha Thanh, Bach Quoc Khanh, Duong Quoc Chinh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 409 - 415 Objectives: Optimizaion of detection protocols for JAK2 and CALR mutation Then applying these protocols for Myeloproliferative neoplasm patients Subjects: 51 Ph negative MPNs patients have been diagnosed and treated in National Institute of Hematology and Blood Transfusion Methods: Prospective, retrospective, and cross-sectional study Results: The protocols for detecting JAK2 and CALR mutation included: JAK2 and CALR gene sequencing by NGS; detect JAK2V617F by degraded primer PCR; simplify protocol for detecting CALR type and type by specific primer PCR When these protocols were applied for 51 MPNs patients, the results obtained: JAK2V617F 83.3% and 66.7% in polycythaemia vera and primary myelofibrosis respectively; CALR type 11.4%, CALR type 5.7% and JAK2V617F 71.4% in essential thrombocythemia Conclusion: The optimizesd detection protocols for JAK2 and CALR mutation are effective and easy to *Bệnh viện Nhi Đồng **Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh* Viện Huyết học -Truyền máu TW Tác giả liên lạc: TS Dương Quốc Chính ĐT: 0962168505 Email: chinh.duong@nihbt.org.vn Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học 409 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 apply in any molecular diagnostic laboratory and the analysis results of 51 MPNs patients confirmed the effectiveness of the methods Key words: MPNs, CALR, JAK2 ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Tăng sinh tủy mạn tính (Myeloproliferative neoplasm – MPNs) nhóm bệnh lý đơn dòng tế bào gốc tạo máu Bệnh gây nên tăng sinh khơng kiểm sốt tế bào gốc sinh máu tủy xương, tiến triển mạn tính liên quan đến khả biệt hóa đến giai đoạn trưởng thành tế bào dẫn tới tăng sinh tế bào trưởng thành máu ngoại vi(5) Đối tượng Bệnh đặc trưng xuất đột biến gen JAK2, CALR MPL Đột biến gen đặc trưng quan trọng sử dụng cho chẩn đoán, tiên lượng lựa chọn phương thức điều trị bệnh Kể từ công bố đột biến gen JAK2 (2005)(2) đột biến gen CALR (2013)(9), phòng nghiên cứu xét nghiệm sinh học phân tử xây dựng nhiều phương pháp khác để phát đột biến gồm: PCR đặc hiệu alen, PCR phân tích đoạn, giải trình tự Sanger, giải trình tự NGS (Next-Generation Sequencing)(2,9,10,14) Khi vận dụng phương pháp xét nghiệm thường quy ngồi tính xác, độ nhạy độ đặc hiệu; yếu tố quan trọng mức độ ổn định quy trình xét nghiệm Bên cạnh đó, cần hiểu rõ mặt hạn chế vận dụng điểm mạnh phương pháp xét nghiệm trường hợp cụ thể; đồng thời việc đơn giản hóa quy trình kỹ thuật cần cân nhắc xây dựng quy trình xét nghiệm thường quy Do đó, chúng tơi thực đề tài “Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 CALR bệnh tăng sinh tủy mạn tính” Mục tiêu Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 CALR Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính 410 Tổng số 51 mẫu bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính, âm tính với nhiễm sắc thể Ph 1, chẩn đốn theo dõi điều trị Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Phương pháp Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang, tiến cứu kết hợp hồi cứu Kỹ thuật PCR phát đột biến JAK2V617F, CALR type 1, type Kỹ thuật PCR mồi đặc hiệu sử dụng mồi bổ sung hoàn toàn với alen mang đột biến sai khác với alen bình thường vị trí đột biến Với sai khác mồi bắt cặp vào sợi alen bình thường để tạo nên đoạn sản phẩm khơng đặc hiệu Kỹ thuật PCR mồi suy biến sử dụng mồi suy biến có sửa đổi nucleotide phạm vi nucleotide đầu 3’ mồi Như mồi suy biến khác alen bình thường vị trí: (1) vị trí đột biến (2) vị trí suy biến có chủ ý nằm phạm vi nu đầu 3’ mồi Thiết kế nhằm giảm khả bắt cặp mồi với alen bình thường khuếch đại thành cơng alen đột biến; giải tình trạng hình thành băng sản phẩm khơng đặc hiệu KẾT QUẢ Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 Kết hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến JAK2V617F Kết điện di Hình cho thấy tượng xuất băng sản phẩm không đặc hiệu trùng với kích thước băng đột biến JAK2V617F tất mẫu Kết điện di Hình không xuất băng sản phẩm không đặc hiệu tất mẫu mà xuất băng đột biến Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 đặc hiệu mẫu dương tính với đột Nghiên cứu Y học biến JAK2V617F (Hình 1, 2) Hình Kết ứng dụng quy trình phát đột biến JAK2V617F theo phương pháp PCR mồi đặc hiệu Hình Kết hồn thiện quy trình phát đột biến JAK2V617F phương pháp PCR mồi suy biến Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen CALR Kết giải trình tự gen CALR phương pháp NGS Hình kết phân tích liệu NGS phần mềm IGV: với mẫu 30205 mang đoạn chèn nucleotide “TTGTC” hay CALR type (Hình 4a) mẫu 30124 khơng phát bất thường (Hình 4b) Hình Kết phân lập gen CALR exon đến exon 9, có chiều dài ~6 kb Hình Kết phân tích liệu NGS gen CALR phần mềm IGV nucleotide xuất băng nội kiểm 192 bp Kết hồn thiện quy trình xét nghiệm đột băng đặc hiệu đột biến 161 bp (Hình 5b) biến CALR type 1, type Kết xét nghiệm đột biến CALR type 1, type phương pháp PCR mồi đặc hiệu Hình biểu kết xác định đoạn gen CALR phương pháp PCR mồi đặc hiệu: mẫu dương tính đột biến đoạn 52 nucleotide hay CALR type xuất băng nội kiểm 141 bp băng đặc hiệu đột biến 89 bp (Hình 5a); mẫu dương tính đột biến đoạn 31 Hình thể kết xác định đột biến chèn nucleotide “TTGTC” hay CALR type phương pháp PCR mồi đặc hiệu, mẫu dương tính xuất băng nội kiểm 265 bp băng đặc hiệu đột biến 156 bp Kết xác định đoạn gen CALR phương pháp giải trình tự Sanger Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Kết xác nhận giá trị hay tính xác 411 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 quy trình xét nghiệm đoạn CALR type thể Hình đoạn 31 nucleotide thể Hình Kết ứng dụng phân tích đột biến gen cho nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính với 83,3% bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát 66,7% bệnh nhân xơ tủy nguyên phát Với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, đột biến CALR type chiếm 11,4% CALR type chiếm 5,7% JAK2V617F chiếm 71,4% (Bảng 1) Bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát xơ tủy nguyên phát mang đột biến JAK2V617F Hình Kết xác định (a) đột biến CALR type (b) đoạn 31 nucleotide Hình Kết xác định đột biến CALR type chèn nucleotide “TTGTC” Hình Kết phân tích vùng đứt gãy đột biến CALR type Hình Kết phân tích vùng đứt gãy đoạn 31 nucleotide gen CALR 412 Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng Kết thống kê đột biến gen JAK2, CALR 51 bệnh nhân MPNs TTCTP ĐHCNP XTNP Tổng Số trường hợp (n) Tỷ lệ với chẩn đoán (%) Số trường hợp (n) Tỷ lệ với chẩn đoán (%) Số trường hợp (n) Tỷ lệ với chẩn đoán (%) Số trường hợp (n) Tỷ lệ với chẩn đốn (%) Âm tính 11,4% 16,7% 33,3% 13,7% Đột biến gen JAK2 V617F CALR type 1(*) CALR type 25 71,4% 11,4% 5,7% 10 0 83,3% 0% 0% 0 66,7% 0% 0% 37 72,5% 9,8% 4% Tổng 36 100% 12 100% 100% 51 100% (*) mẫu đột biến đoạn gồm mẫu đột biến CALR type 52 nucleotide mẫu đột biến gặp đoạn 31 nucleotide BÀN LUẬN Tăng sinh tủy mạn tính nhóm bệnh lý đặc trưng xuất đột biến gen JAK2, CALR MPL Năm 2005, bốn nhóm nghiên cứu độc lập hội chứng tăng sinh tủy công bố đột biến gen JAK2 làm biến đổi acid amin valine codon 617 thành phenylalanine – ký hiệu JAK2V617F(2,6,11,12) Đây đột biến điểm xuất 95% trường hợp đa hồng cầu 60% trường tăng tiểu cầu tiên phát xơ tủy nguyên phát Phương pháp sử dụng rộng rãi để phát đột biến JAK2V617F PCR đặc hiệu alen Trên sở đó, chúng tơi xây dựng quy trình xét nghiệm đột biến JAK2V617F phương pháp PCR mồi đặc hiệu Sau năm áp dụng (2012 - 2017), quy trình tồn vấn đề nhiều mẻ xét nghiệm băng sản phẩm đột biến xuất khơng đặc hiệu mẫu âm tính, gây khó khăn phân tích kết (Hình 1) Qua tham khảo tài liệu, nhận thấy tượng xuất sản phẩm không đặc hiệu thường gặp phải xác định đột biến điểm PCR mồi đặc hiệu Nguyên nhân tượng mồi đặc hiệu cho alen đột biến sai khác với alen bình thường nucleotide, mồi đặc hiệu bắt cặp alen bình thường với hiệu suất thấp Nhằm ổn định quy trình xét nghiệm giải triệt để tượng sản phẩm không đặc hiệu, thay đổi thiết kế mồi đặc hiệu sang mồi suy biến Đối với mồi suy biến ngồi nucleotide sai khác vị trí đột biến chủ ý tạo thêm sai khác so với alen bình thường vị trí thứ từ đầu 3’ mồi Như vậy, với sai khác mồi suy biến khả bắt cặp alen bình thường Kết áp dụng quy trình hồn thiện từ năm 2018 đến cho thấy tượng sản phẩm không đặc hiệu giải triệt để giúp ổn định xét nghiệm thường quy đột biến JAK2V617F (Hình 2) Trong tăng sinh tủy mạn tính đột biến gen CALR phát gần (2013) cho thấy vai trò quan trọng sinh bệnh học bệnh, với tần suất từ 17% đến 27% bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát xơ tủy nguyên phát(9) Cho đến nay, 50 đột biến công bố gen CALR exon thể phổ biến CALR type 52 nucleotide (chiếm 50%) CALR type chèn nucleotide “TTGTC” (chiếm 30%)(4) Nhờ vào ưu điểm vượt trội cỡ mẫu lớn mẻ chạy, đòi hỏi lượng ADN/ARN đầu vào độ xác cao mà cơng nghệ giải trình tự NGS ứng dụng rộng rãi nhiều bệnh lý huyết học Hơn nữa, NGS mạnh phát nhiều dạng đột biến như: biến đổi đơn nucleotide (SNV), chèn đoạn nhỏ (ins/dels), biến đổi số lượng (CNV)(10,14,15) Trên sở đó, chúng tơi ứng dụng thành cơng giải trình tự NGS để phân tích đột biến Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học 413 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 toàn gen CALR (exon đến exon 9) Khi phân tích liệu NGS xác định trường hợp mang đột biến CALR type biến thể chèn nucleotide tương tự (Hình 4a) Tuy nhiên khơng xác định đột biến CALR type mà thay vào mẫu gọi hàng loạt biến thể vùng ~50 bp phân tích CLC khơng phát thấy đột biến phân tích IGV (Hình 4b) Như kết CLC cho thấy bất thường liệu sau phân tích Qua tìm hiểu nghiên cứu Kluk (2016), chúng tơi biết hạn chế phân tích đột biến công nghệ NGS Illumina xác định đoạn lớn 25 bp(10) Đây lý mà xác định đột biến CALR type đoạn 52 bp phân tích kết NGS Như quy trình xét nghiệm NGS giúp phân tích hiệu đột biến gen CALR ngoại trừ đoạn >25 bp Một số giải pháp bổ sung để phát đoạn gồm: phân tích đường cong biến tính (HRM), PCR phân tích đoạn máy điện di mao quản, giải trình tự trực phương pháp Sanger(3,5) Cả giải pháp cho phép phát đột biến CALR type đoạn khác, nhiên phương pháp phức tạp yêu cầu thiết bị đặc thù Với HRM thực máy realtime PCR nhạy cảm; PCR phân tích đoạn đòi hỏi máy điện di mao quản Đối với giải trình tự theo phương pháp Sanger, việc phân tích kết đột biến đoạn tương đối khó khăn tượng chồng đỉnh tín hiệu giải trực tiếp từ sản phẩm PCR Phương pháp đòi hỏi phải tinh đoạn sản phẩm chứa vùng đoạn gel Trong nghiên cứu chúng tơi đơn giản hóa quy trình xét nghiệm đột biến CALR type phương pháp PCR mồi đặc hiệu Kết Hình 5a cho thấy mẫu dương tính đột biến CALR type ngồi băng nội kiểm xuất thêm băng sản phẩm kích thước 89 bp Tính xác quy trình xét nghiệm kiểm 414 chứng xác nhận giá trị thơng qua việc giải trình tự đoạn sản phẩm đặc hiệu (89 bp) hệ thống AB3500, kết phân tích Hình Trong nghiên cứu này, xác định trường hợp mang đoạn 31 nucleotide gặp (Hình 5b) Mất đoạn chúng tơi xây dựng quy trình xét nghiệm PCR mồi đặc hiệu xác nhận giá trị phương pháp giải trình tự theo nguyên lý Sanger (Hình 8) Nhằm đơn giản hóa quy trình xét nghiệm đột biến gen CALR chúng tơi tiếp tục xây dựng quy trình PCR xác định đặc hiệu đột biến CALR type 2, kết thể Hình Sau hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 gen CALR, chúng tơi áp dụng quy trình hồn thiện cho 51 mẫu bệnh nhân MPNs Kết tỷ lệ đột biến gen tương đồng với nghiên cứu tác giả Kim, Seon Young Lin, Yani(8,13) Với đột biến gen CALR, phát bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát (11,4% type 5,7% type 2) mà chưa có trường hợp với bệnh lý xơ tủy nguyên phát Điều số lượng bệnh nhân xơ tủy nguyên phát chưa đủ lớn KẾT LUẬN Nghiên cứu hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2V617F phương pháp mồi suy biến; xây dựng quy trình PCR để phát đột biến CALR type 1, type 2; quy trình NGS phát đột biến gặp Bộ quy trình hồn thiện ứng dụng phân tích đột biến cho 51 bệnh nhân MPNs TÀI LIỆU THAM KHẢO Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al (2016) The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia Blood, 127(20):2391–2405 Baxter EJ, et al (2005) Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders The Lancet, 365(9464):1054–1061 Chi J, Manoloukos M, Pierides C, et al (2015) CALReticulin mutations in myeloproliferative neoplasms and new methodology for their detection and monitoring Annals of Hematology, 94(3):399–408 Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Chi J, Nicolaou KA, et al (2014) CALReticulin gene exon frameshift mutations in patients with thrombocytosis Leukemia, 28(5):1152–1154 Doyle LJ, Betz BL, Weigelin HC, et al (2019) Comparison of real‐time PCR vs PCR with fragment length analysis for the detection of CALR mutations in suspected myeloproliferative neoplasms International Journal of Laboratory Hematology, 25(7):1429-1431 James C, et al (2005) A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera Nature, 434(7037):1144–1148 Jones AV, et al (2015) Evaluation of methods to detect CALR mutations in myeloproliferative neoplasms Leukemia Research, 39(1):82–87 Kim SY, Im K, Park SN, Kwon J, Kim JA (2015) CALR, JAK2, and MPL Mutation Profiles in Patients with Four Different Subtypes of Myeloproliferative Neoplasms American Journal of Clinical Pathology, 143(5):635–644 Klampfl T., et al (2013) Somatic Mutations of CALReticulin in Myeloproliferative Neoplasms New England Journal of Medicine, 369(25):2379–2390 10 Kluk MJ, Lindsley RC, Aster JC, et al (2016) Validation and Implementation of a Custom Next-Generation Sequencing Clinical Assay for Hematologic Malignancies Journal of Molecular Diagnostics, 18(4):507–515 11 Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al (2005) A Gain-ofFunction Mutation of JAK2 in Myeloproliferative Disorders New England Journal of Medicine, 352(17): 1779–1790 Nghiên cứu Y học 12 Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al (2005) Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis Cancer Cell, 7(4):387–397 13 Lin Y, et al (2015) The Prevalence of JAK2, MPL and CALR Mutations in Chinese Patients with BCR-ABL1 –Negative Myeloproliferative Neoplasms American Journal of Clinical Pathology, 144(1):165–171 14 Murugesan G, Guenther-Johnson J, et al (2016) Validation of a molecular diagnostic assay for CALR exon indels in myeloproliferative neoplasms: identification of coexisting JAK2 and CALR mutations and a novel bp deletion in CALR International Journal of Laboratory Hematology, 38(3):284–297 15 Palumbo GA, Stella S, Pennisi MS, et al (2019) The Role of New Technologies in Myeloproliferative Neoplasms, Frontiers in Oncology, 9: 321 16 Pavlov I, Hadjiev E, Alaikov T, et al (2018) CALReticulin Mutations in Bulgarian MPN Patients Pathology & Oncology Research, 24(1):171–174 Ngày nhận báo: 22/07/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/08/2019 Ngày báo đăng: 15/10/2019 Hội Nghị Khoa Học BV Truyền máu Huyết học 415 ... thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 CALR Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính 410 Tổng số 51 mẫu bệnh nhân thuộc nhóm tăng. .. giản hóa quy trình kỹ thuật cần cân nhắc xây dựng quy trình xét nghiệm thường quy Do đó, chúng tơi thực đề tài “Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 CALR bệnh tăng sinh tủy mạn tính ... trình PCR xác định đặc hiệu đột biến CALR type 2, kết thể Hình Sau hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 gen CALR, áp dụng quy trình hồn thiện cho 51 mẫu bệnh nhân MPNs Kết tỷ lệ đột