Nội dung bài viết với mục tiêu xác định đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị. Nghiên cứu tiến hành từ tháng 1/2013 đến tháng 9/2014 tiến hành thu thập mẫu huyết thanh từ bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị tại một số phòng khám chuyên khoa gan mật, tiêu hóa tại TP. Cần Thơ.
Trang 1Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Nghiên cứu Y học
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA HBV TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM HBV MẠN TÍNH CHƯA ĐIỀU TRỊ BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ
Nguyễn Thị Hải Yến*, Nguyễn Thanh Bảo**, Cao Minh Nga**
TĨM TẮT
Đặt vấn đề: Các thuốc tương tự nucleos(t)ide là một trong 2 nhĩm thuốc được sử dụng điều trị bệnh viêm
gan B mạn tính hiện nay (nhĩm cịn lại là Interferon), cĩ tác dụng ức chế quá trình nhân lên của virus Tuy nhiên, khi sử dụng với thời gian kéo dài, dưới áp lực chọn lọc của thuốc dễ làm phát sinh những đột biến kháng thuốc trên virus Tại Việt Nam chưa cĩ nhiều nghiên cứu về đột biến kháng thuốc trên người nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị
Mục tiêu: Xác định đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị Phương pháp: Tiền cứu, mơ tả cắt ngang Từ tháng 1/2013 đến tháng 9/2014 tiến hành thu thập mẫu
huyết thanh từ bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị tại một số phịng khám chuyên khoa gan mật, tiêu hĩa tại TP Cần Thơ Thực hiện các xét nghiệm HBeAg bằng kỹ thuật ELISA, định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật Realtime PCR Các mẫu huyết thanh cĩ kết quả định định lượng HBV DNA > 10 3 copies/ml được giải trình tự xác định đột biến kháng thuốc
Kết quả: Cĩ 362 mẫu huyết thanh cĩ tải lượng HBV DNA > 10 4 copies/ml được giải trình tự tìm đột biến kháng thuốc Khơng phát hiện được các đột biến cĩ liên quan đến kháng các thuốc tương tự nucleos(t)ide Cĩ 29 mẫu cĩ đột biến V207M ( 8% ) Số mẫu huyết thanh cĩ HBeAg (+) là 196 mẫu (54,1%) Cĩ 238 mẫu huyết thanh (65,7 %) cĩ tải lượng HBV DNA trong huyết thanh ≥ 10 5 copies/ml Tỉ lệ đột biến rtV207M ở nhĩm cĩ tải lượng HBV DNA trong huyết thanh ≥ 10 5 copies/ml cao hơn ở nhĩm cĩ tải lượng HBV DNA trong huyết thanh < 10 5 copies/ml cĩ ý nghĩa thống kê Khơng ghi nhân mối liên quan giữa đột biến rtM207V với các yếu tố tuổi, giới tính và tình trạng HBeAg
Kết luận: Khơng phát hiện được các đột biến cĩ liên quan đến kháng các thuốc tương tự nucleos(t)de Tỉ lệ
đột biến rtV207M là 8% Cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê về sự phân bố của đột biến này ở 2 nhĩm HBV DNA < 10 5 copies/ml và ≥ 10 5 copies/ml
Từ khĩa: viêm gan B, đồng phân nucleos(t)ide, đột biến kháng thuốc, nhiễm HBV mạn tính, bệnh nhân
chưa điều trị.
ABSTRACT
DETECTION OF ANTIVIRAL DRUGS RESISTANTS MUTANTS OF HEPATITIS B VIRUS AMONG TREATMENT NẠVE CHRONIC HEPATIS B VIRUS INFECTED PATIENTS BY SEQUENSING
Nguyen Thi Hai Yen, Nguyen Thanh Bao, Cao Minh Nga
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - Supplement of No 1 - 2015: 365 - 368
Background: Nucleot(s)ide analogs group is one of two kinds of antiviral drug for treating Hepatitis B (the
other one is Interferon), which inhibits effectively the replication of virus However, when long term using, it is easily to emerge drug resistant mutants in virus There have not been many studies in drug resistant mutants of HBV among treatment nạve chronic hepatitis B virus infected patients
Objectives: To determine the rates of drug resistant mutants in treatment nạve chronic hepatitis B virus
* Khoa Y, Đại học Cần Thơ ** Bộ mơn Vi sinh, Khoa Y - Đại học Y Dược TP HCM
Tác giả liên lạc: ThS BS Nguyễn Thị Hải Yến ĐT: 0908600366 Email: haiyenydct@yahoo.com
Trang 2Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015
Chuyên Đề Nội Khoa 366
infected patients
Methods: Retrospective, cross-sectional description method Sera of chronic hepatitis B virus infected
patients were collected at some hepatobiliary and gastrointestinal clinics in CanTho city from January 2013 to December 2014 HBeAg tests were done HBV DNA quantitating were taken by Realtime PCR method Samples with over 10 3 HBV DNA copies/ml sera were detected drug resistant mutants by sequencing
Results: 362 samples with over 10 3 HBV DNA copies/ml sera of treatment nạve chronic hepatitis B virus infected patients were available for resistant mutants detecting No resistant mutant was detected in these samples 29 samples (8%) with rtV207M mutant was detedcted There were 196 samples (54.1%) with HBeAg positive.There were 238 samples (65.7%) with 10 3 HBV DNA copies/ml viral load There was a significant association between the ratio of rtV207M mutant and viral loading No relationship was seen between rtV297M mutant and gender or HBeAg status
Conclusion: No resistant mutant was detected in these samples The mutant of rtV207M was 8% There
was a significant association between the ratio of rtV207M mutant and viral loading
Keywords: Hepatitis B (HBV), nucleos(t)ide analogs, drugs-resistant mutation, chronic HBV infection,
treatment nạve patient
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm gan B (HBV) đang là một vấn đề sức
khỏe được quan tâm trên tồn thế giới khơng
những vì tỉ lệ người nhiễm bệnh cao mà cịn do
những biến chứng nguy hiểm của bệnh như xơ
gan và ung thư tế bào gan Hiện nay cĩ 2 nhĩm
thuốc được sử dụng trong điều trị HBV Đĩ là các
thuốc tương tự nucleos(t)de và các Intreferon
Nhĩm thuốc tương tự nucleos(t)de cĩ tác dụng ức
chế quá trình nhân lên của virus, ít tác dụng phụ
và được sử dụng chủ yếu trong điều trị HBV Tuy
nhiên, khi sử dụng với thời gian kéo dài, dưới áp
lực chọn lọc của thuốc dễ làm phát sinh những đột
biến kháng thuốc trên virus, làm giảm hiệu quả
điều trị Tại Việt Nam, đã cĩ nhiều nghiên cứu về
điều trị(1,6,7,8) Riêng đối với người nhiễm HBV mạn
tính chưa điều trị, tại Việt Nam chưa cĩ nhiều
nghiên cứu về đột biến kháng thuốc
ĐỐ I TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Tiền cứu, mơ tả cắt ngang
Đối tượng nghiên cứu
Người nhiễm HBV cĩ HBsAg(+) trên 6 tháng
đến khám tại một số phịng khám chuyên khoa
gan mật, tiêu hĩa tại TP Cần Thơ từ tháng 1/2013 đến tháng 9/2014
Phương pháp nghiên cứu
Bệnh nhân được chọn vào mẫu nghiên cứu được lấy huyết thanh làm xét nghiệm HBeAg bằng kỹ thuật ELISA tại bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Sau đĩ, các mẫu này được tiến hành định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật Realtime PCR phịng xét nghiệm Vi sinh Trường
tải lượng virus > 103 copies/ml được tiến hành giải trình tự trên đoạn gen P của HBV để phát hiện đột biến kháng thuốc(9) Kỹ thuật giải trình tự được thực hiện tại viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Biến số nghiên cứu: giới, tuổi, tải lượng DNA HBV trong huyết thanh
Nhập và phân tích số liệu bằng phần mền SPSS 18.0, dùng phép kiểm χ2 để so sánh các tỉ lệ với mức cĩ ý nghĩa thống kê p<0,05
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trong thời gian từ tháng 1/2013 đến tháng 9/2014, chúng tơi thu thập được 362 mẫu huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa
điều trị, cĩ tải lượng HBV DNA > 103 copies/ml để thực hiện kỹ thuật giải trình tự phát hiện đột biến kháng thuốc
Trang 3Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015 Nghiên cứu Y học
Đặc điểm mẫu nghiên cứu
Trong số 362 bệnh nhân được lấy huyết thanh
được tiến hành giải trình tự, có211 bệnh nhân
nam (58,3%) và 151 bệnh nhân nữ (41,7%) 196
mẫu huyết thanh có HBeAg (+) (54,1%)
Đột biến phát hiện được
Chúng tôi không phát hiện được những đột
biến của HBV trên đoạn gen được giải trình tự đã
được biết có liên quan đến sự đề kháng với các
thuốc tương tự nucleos(t)de Tuy nhiên có 29 mẫu
(8%) xuất hiện đột biến rtV207M Đây là đột biến
cho đến nay được cho là không liên quan đến
kháng thuốc Trong nghiên cứu của tác giả M.H
Nguyen và cs trên đối tượng viêm gan B mạn
tính chưa điều trị cũng ghi nhận sự hiễn điện của
đột biến này với tỉ lệ 16,7%(5) Tác giả R Salpini và
cs cũng tìm thấy đột biến rtV207L/ M với tỉ lệ
0,7% trên bệnh nhân chưa điều trị Đây là một
trong những đột biến đang được xem xét liệu có
giữ vai trò đối với kháng thuốc của HBV(10)
trị có tỉ lệ thấp, ngay cả đối với những thuốc đã
được sử dụng rộng rãi trong thời gian qua như
Lamivudin(2,3,4)
Tác giả Nguyễn Hùng Cường nghiên cứu trên
đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại
Hải Phòng ghi nhận có 3,84% đột biến kháng
Lamivudine, không thấy đột biến kháng Tenofovir
và Entercavir(2) Đặng Mai anh Tuấn nghiên cứu
trên những bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại
bệnh viện Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh ghi nhận tỉ lệ
đột biến kháng thuốc là 9,28%(1) Tuy nhiên trong
nghiên cứu này không phân biệt bệnh nhân đã
điều trị và chưa điều trị Các nghiên cứ trên đối
tượng bệnh nhân viêm gan B đã điều trị cao hơn
nhiều so với bệnh nhân chưa điều trị(7,8)
Sự phân bố đột biến rtV207M theo giới tính
Bảng 1: Sự phân bố đột biến theo giới tính
Giới tính Có đột biến Không đột biến
Có 21 bệnh nhân nam và 8 bệnh nhân nữ có
đột biến rtV207M Sự phân bố đột biến rtV207M
trên 2 nhóm nam và nữ không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p=0,108)
Sự phân bố đột biến rtV207M theo tải lượng HBV DNA trong huyết thanh
Bảng 2: Sự phân bố đột biến rtV207M theo tải lượng
HBV DNA trong huyết thanh (n=362)
HBV DNA (copies/ml) Có đột biến Không đột biến
< 10 5 (n=124) 5 119
≥ 10 5 (n=238) 24 214 Trong 124 mẫu huyết thanh có tải lượng virus
< 105 copies/ml có 5 mẫu mang đột biến rtV207M Trong 238 mẫu huyết thanh có tải lượng virus ≥
105 có 5 mẫu mang đột biến rtV207M Có mối liên quan giữa đột biến rtV207M và tải lượng virus trong máu (p=0,044)
Sự phân bố đột biến rtV207M theo kháng nguyên HBeAg
Bảng 3: Sự phân bố đột biến rtV207M theo kháng
nguyên HBeAg (n=362)
HBeAg Có đột biến Không đột biến
Dương tính (n=196) 20 176
Âm tính (n=166) 9 157 Trong 176 mẫu huyết thanh có HBeAg (+), có
20 mẫu có đột biến rtV207M và trong 157 mẫu huyết thanh có HBeAg (-) có 9 mẫu có đột biến rtV207M Sự phân bố đột biến này trên 2 nhóm HBeAg(+) và HBeAg (-) không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p=0,095)
KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi không phát hiện được các đột biến liên quan đến kháng thuốc
Đột biến rtV207M xuất hiện ở 29 mẫu chiếm tỉ lệ 8% Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố của đột biến này ở 2 nhóm HBV DNA <
105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đặng Mai Anh Tuấn, Võ Đức Xuyên An, Phạm Hùng Vân (2010) Tìm hiểu đột biến kháng Adefovir và lamivudine trên HBV tách chiết từ huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn tính Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 14 Phụ bản số 2 Tr.: 287-293
2 Ma J, Zhang Y, Chen X, Jin Y, Chen D, Wu Y, Cui J, Wang H,
L Jiu, Li N, Gao F (2013) “Association of Preexisting Drug-Resistance Mutationsand Treatment Failure in Hepatitis B
Patients” PLoS ONE.8(7): e67606
Trang 4Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015
Chuyên Đề Nội Khoa 368
3 Margeridon-Thermet S, Shulman NS, Ahmed A, Shahriar R,
Liu T, Wang C, Holmes SP, Babrzadeh F, Gharizadeh B,
Hanczaruk B, Simen BB, Egholm M, Shafer RW (2009)
“Ultra-Deep Pyrosequencing of Hepatitis B Virus Quasispeciesfrom
Nucleoside and Nucleotide Reverse-Transcriptase Inhibitor
(NRTI) – Treated Patients and NRTI - Nạve Patients J Infect
Dis May 1; 199(9): 1275–85
4 Mirandola S, Campagnolo D, Bortoletto G, et al (2011)
“Large-scale survey of naturally occurring HBV
polymerasemutations associated with anti-HBV drug
resistancein untreated patients with chronic hepatitis B”
Journal of Viral Hepatitis 18:e212–e216
5 Nguyen MH, Garcia RT, Trinh HN, Nguyen HA, Nguyen
KK, Nguyen LH & Levitt B (2009) Prevalence of hepatitis B
virus DNA polymerase mutations intreatment-nạve patients
with chronic hepatitis Aliment Pharmacol Ther; 30: pp 1150–8
6 Nguyễn Hùng Cường, Nguyễn Bảo Trân, Hồng Thị
Thanh Huyền, Azumi Ishizaki, Hiroshi Ichimura, Phạm
Văn thức (2013) “Nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen kháng
thuốc của HBV ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại
dâm ở Hải Phịng” Tạp chí Y-Dược học quân sự số 6:57-63
7 Nguyễn Thị Nhã Đoan, Bùi Hữu Hồng, Phạm Hùng Vân
(2011) “Đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan virus B
mạn đang điều trị bằng các thuốc tương tự nucleos(t)ide” Tạp
chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 15 Phụ bản số 2 Tr.110-116
8 Nguyễn Sử Minh Tuyết, Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thanh
Bảo, Cao Minh Nga (2010) “Phát hiện đột biến rtL180M và
rtM204V/I kháng Lamivudine ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn
tính bằng kỹ thuật Real-time PCR” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 14 Phụ bản số 1 Tr.509-512
9 Rybicka M, Stalke P, Dreczewski M, Smiatacz T, Bielawski
KP (2014) “High-Through put Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Timeof Flight Mass Spectrometry as an Alternative Approach to Monitoring Drug Resistance of
Hepatitis B Virus.” Journal of Clinical Microbiology January ;
52(1): pp 9 –14
10 Salpini R, Svicher V, Cento V, Gori C, Bertoli A, Scopelliti F, Micheli V, Cappiello T, Spanị A, Rizzardini G, De Sanctis
GM, Sarrecchia C, Angelico M, Perno CF (2011)
“Characterization of drug-resistance mutations in HBV D-genotype chronically infected patients, nạve to antiviral
drugs” Antiviral Research 92:382–5
Ngày nhận bài báo: 27/10/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/10/2014 Ngày bài báo được đăng: 10/01/2015