nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ duchenne

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne MuscularDystrophy DMD hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại được phát hiện trênnhiều chủng tộc khác nhau trên thế gi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠNViệc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi họchỏi được rất nhiều, đó không chỉ là những kiến thức mà còn là tác phong vàkinh nghiệm làm việc.

Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Trần Vân Khánh, trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, phó giám đốc

trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đãgiúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóaluận cho tôi

PGS TS Tạ Thành Văn, PGS TS Nguyễn Thị Hà, những người

thầy tuy không trực tiếp hướng dẫn tôi làm khóa luân nhưng đã nhắc nhở,động viên không chỉ tôi mà tất cả các sinh viên, học viên đang tiến hành khóaluận tại trung tâm, tạo mọi thuận lợi cho chúng tôi thực hiện và hoàn thànhkhóa luận một cách tốt nhất

ThS Đỗ Ngọc Hải, khoa Hóa Sinh, bệnh viện Việt-Tiệp Hải Phòng, cùng tập thể labo nghiên cứu gen-protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã

dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013

Đỗ Thị Mai

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -*** -

LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội

Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

cứ công trình nghiên cứu nào khác

Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013

Người viết khóa luận

Đỗ Thị Mai

CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử

Kb

PCR

Kilo basePolymerase chain reactionMLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne MuscularDystrophy ( DMD) hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại được phát hiện trênnhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới là một bệnh di truyền lặn liên kết vớigiới tính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai

Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, tiến triển mang tính chất tuần tiến, hầuhết những trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếucơ: biểu hiện là khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khileo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày càng nặng, cuối cùng dẫn tớitàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và chết ở lứa tuổi 20 – 25 do tổnthương cơ tim và rối loạn hô hấp

Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vịtrí Xp21 trên NST X, có chiều dài hơn 3000 Kb, bao gồm 79 exon với 7promoter khác nhau Gen sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổng hợp proteindystrophin Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và đượccho là có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơkhỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ Gen dystropin bị đột biến, quá trìnhtổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoáihóa dần và gây nên bệnh DMD Một thể nhẹ hơn của DMD là BeckerMuscular Dystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuấthiện muộn hơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn.Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn (khoảng 60%),đột biến điểm ( 25-30%), đột biến lặp ( 10-15%)

Như có thể thấy dạng đột biến xóa đoạn là phổ biến nhất, thường gặp nhấtchiếm tỉ lệ trên một nửa số ca bệnh Đột biến này thường xảy ra ở hai vùngtrọng điểm (gọi là vùng hotspot) là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’.

Cho đến nay DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bởivậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnhnhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợlàm chậm lại các biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộcsống cho người bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị Ngoàira,việc phát hiện đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ýnghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy

cơ cao sinh con bị bệnh Có nhiều phương pháp xác định đột biến xóa đoạngen này nhưng do gen dystropin quá lớn với 79 exon, nên nhiều phương phápgặp phải trở ngại về mặt thời gian MLPA (Multiplex Ligation-dependentProbe Amplification) là phương pháp xác định đột biến xóa đoạn và lặp đoạnnhanh chóng, chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi

Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất

đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”

được thực hiệnnhằm mục tiêu:

Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.

1.1.1 Trên thế giới.

- Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tảchi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi

là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

- Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp

đã có công mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻtrai, phân biệt các bệnh cơ khác nhau và sau đó bệnh đã được mang tên ông

- Năm 1879, Gowers đã thu thập 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹcàng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết

- Bệnh DMD đã được biết hơn 100 năm, trong suốt một thời gian dàibệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợtrong quá trình của bệnh đối với bệnh nhân

- Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặcbiệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện

dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK), phục vụcho điều trị và tư vấn di truyền

- Cho đến năm 1981, Zatz và cộng sự đã phát hiện ra gen dystrophin nằm

ở vị trí Xp21

- Từ năm 1984 – 1987, Hoffman và các cộng sự của ông đã phát hiện ragen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen

- Sau những năm 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp ditruyền phân tử đã phát triển mạnh nhằm phát hiện đột biến gen dystrophin,tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tưvấn di truyền nhằm hạn chế tới mức thấp nhất sự sinh ra những đứa trẻ bịbệnh DMD

- Năm 1987 - 1988, các nhà nghiên cứu mới chỉ biết gen dystrophin gồm

60 exon

- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb

- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiệnđầy đủ gồm 79 exon với kích thước 3200 kb

Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càngđược làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗlực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng

nề của bệnh gây ra Một hướng mà hiện nay được nhiều nhà khoa học trên thếgiới tập trung nghiên cứu là chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹBMD bằng cách dùng một đoạn trình tự oligonucleotid đặc hiệu bám vào vịtrí tăng cường quá trình ghép nối của exon, một vị trí quan trọng cho quá trìnhhoàn thiện mRNA để ngăn cản quá trình này, gây mất đoạn trực tiếp exon cóchứa điểm đột biến, hoặc gây mất đoạn thêm một hoặc hai exon kề với vùngđột biến nhằm khôi phục lại khung dịch mã Hướng nghiên cứu này trên tếbào đã đem lại nhiều kết quả rất đáng khích lệ, hiện nay đang được thửnghiệm trên động vật và bước đầu đã được ứng dụng trên người Ngày nay,liệu pháp gen được coi là một trong các hướng nghiên cứu ưu tiên nhất đốivới DMD

1.1.2 Ở Việt Nam.

DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam

do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gíatrị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này Cụ thể:

- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã nghiêncứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tạiViện BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh

- Năm 1996, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Phượng và CS đã nghiêncứu giá trị của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen gây bệnh và

đã nhận thấy khả năng phát hiện dị hợp tử của CK là 54%

- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang đã sử dụng mộtcặp mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độgen cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh

- Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biếnxoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR Tuy nhiên tácgiả mới chỉ phân tích được một vài exon điển hình

- Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng đãcông bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc

tế lần thứ 23

- Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 đã nghiên cứu đột biếngen gây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6trường hợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu

- Năm 2004, Trần Vân Khánh và cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhânViệt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38%

có đột biến xóa đoạn gen dystrophin

- Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện

13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán

là DMD

- Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ xóa đoạn exon 46, 51 và cả hai exon là23/58, chiếm tỷ lệ 39,7%

1.2 Đặc điểm bệnh DMD

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh DMD

Hình 1.1 Người bình thường và bệnh nhân DMD

Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn sau:

Giai đoạn 1 (khi trẻ được 3-5 tuổi) Trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi

lại hay vấp ngã, trẻ chưa có biểu hiệnteo cơ

Giai đoạn 2 (khi trẻ được 6-7 tuổi) Trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện

dấu hiệu Gowers rõ, trẻ đang ngồixổm phải đứng thẳng lên hoặc đangnằm phải ngồi dậy, trẻ phải quayngười sang một bên, gấp đầu gối vàomông, hai tay chống nạng đỡ lấy thân

để giữ một tư thế như quỳ bắn, sau

đó, bằng cách tỳ hai tay lần lượt lêncẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy chothân thẳng dậy Sự tiếp nối các độngtác như vậy được xem là đặc hiệu chobệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến

Giai đoạn 3 (khi trẻ được12-15 tuổi) Trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12

tuổi, sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện

do trẻ không đi lại được, cuối cùng trẻ

bị tử vong ở lứa tuổi 20-25 do tổnthương cơ tim và rối loạn hô hấp

1.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng

1.2.2.1 Định lượng hoạt độ enzym Creatine Kinase (CK) trong huyết thanh

Creatine Kinase (CK) là enzym xúc tác phản ứng tạo hợp chất giàunăng lượng giúp quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tếbào cơ

Creatine + ATP ⃗CK phosphocreatine + ADPPhosphocreatine là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ vàvận chuyển chất trong tế bào cơ

Có ba dạng isoenzym của CK, đó là CK-MM; CK-MB và CK-BB.Dạng đồng phân CK-MM chiếm 95% của CK toàn phần và tập trung chủ yếu

ở tổ chức cơ vân Dạng CK-MB chiếm khoảng 5% và tập trung chủ yếu ở mô

cơ tim Dạng CK-BB chiếm tỷ lệ không đáng kể và khu trú chủ yếu ở tổ chứcnão, nó không qua được hàng rào mạch máu não, do đó CK-BB không xuấthiện trong huyết thanh

Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào nồng độ enzym CK trong máu

Ở bệnh nhân DMD, gen dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc poteindystrophin trên màng tế bào, dẫn đến tổn thương màng tế bào cơ và giảiphóng một lượng lớn enzym CK vào máu Trong DMD, enzym CK tăng cao

ít nhất 40 lần so với bình thường (bình thường <200 UI/l); tuy nhiên, ở giaiđoạn muộn của quá trình bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp, lý do của hiệntượng trên là vào giai đoạn cuối, khối cơ còn lại quá ít và lượng cơ thoái hóacũng ít

1.2.2.3 Sinh thiết cơ

Sinh thiết cơ là một tiêu chuẩn để chẩn đoán chính xác nhất Bằng phảnứng miễn dịch huỳnh quang khi nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ cho thấy sựvắng mặt hoàn toàn của protein Dystrophin trên bề mặt tế bào cơ Các sợi cơvới đường kính không đều và có dấu hiệu của sự thoái hóa hoại tử, thâmnhiễm mô mỡ, mô liên kết và những tế bào đơn nhân

Người bình thường Bệnh nhân DMD

Hình 1.2 Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein Dystrophin khi

nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ.

1.2.3 Điều trị bệnh DMD

DMD là một trong các bệnh di truyền có tiên lượng xấu vì chưa cóphương pháp điều trị hiệu quả Bệnh nhân dần dần bị tàn phế và thường chết

do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20 tuổi

Hiện nay phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trìhoãn sự tiến triển của bệnh Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMDnhư: prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặcaminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy tế bào cơ.Vật lý trị liệu có tác dụng giúp cho trẻ hạn chế bớt mức độ co kéo cơ

Hiện nay, liệu pháp gen trong điều trị căn bệnh này đang được thựchiện với mục đích đưa vào trong tế bào một hoặc nhiều gen có khả năng tổng

hợp ra protein dytrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ.Hai phương pháp đã được thử nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ nhữngplasmid và sử dụng vật truyền trung gian virut Nhưng phương pháp này cònnhiều hạn chế do gặp phải trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớn vào vậttruyền trung gian, đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơ sau phânbào, sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của hệ thống miễn dịchnên chưa được áp dụng để điều trị bệnh trên người Trong vài năm trở lại đây,một hướng điều trị gen mới, sau khi xác định được dạng đột biến của bệnhnhân, các nhà khoa học đã chọn lọc, xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon củađoạn gen bị đột biến tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen mà vẫn duy trìđược khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần giúp cho ngườibệnh chuyển từ thể bệnh nặng (DMD) sang thể bệnh nhẹ (BMD) và giúp kéodài thời gian sống.

1.2.4 Phòng bệnh DMD

DMD là bệnh di truyền tiên lượng nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khảnăng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay, chưa có phương phápđiều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận địnhrằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnhDMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó làviệc phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái trong gia đình bệnhnhân) và chẩn đoán trước sinh cho những những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ

và đang mang thai có nguy cơ cao Phương pháp để phát hiện bệnh được đánhgiá có độ chính xác cao đang được sử dụng là kỹ thuật MLPA (Multiplexligation dependent probe amplification) và cách sàng lọc trước sinh cho phụ

nữ mang thai là chọc hút dịch ối, tách DNA của thai nhi và phân tích gendytrophin đột biến (trước khi phân tích DNA của thai nhi phải loại trừ khảnăng nhiễm DNA của người mẹ trong quá trình chọc hút dịch

1.3 Cơ chế di truyền của bệnh

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính không có alen tươngứng trên NST Y Do đặc điểm di truyền nên bệnh chỉ gặp ở trẻ trai mà rấthiếm gặp ở trẻ gái Ở trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X củangười mẹ mang gen ( XdX - carrier) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ cầnphải nhận 2 gen X mang bệnh, một từ mẹ một từ bố thì mới có khả năng biểuhiện bệnh Trẻ trai bị DMD thường chết sớm ở lứa tuổi 20 đến 25 nên không

có khả năng kết hôn và sinh con

Bảng 1.1 Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con

Genotyp và phenotyp của

XDXD

lành

XDXd

lành manggen bệnh

biểu hiện bệnh Francke 1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen

có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt Có khoảng 30%bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trìnhđột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ

1.4 Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin

1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin

Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X

Hình 1.3: Vị trí của gen Dystrophin.

1.4.2 Cấu trúc gen Dystrophin

Hình 1.4: Cấu trúc gen Dystrophin.

Gen Dystrophin là một trong những gen lớn nhất của người đã đượcbiết tới, gen có kích thước khoảng gần 3000kb, trong đó hơn 99% chiều dàigen là intron

Cấu trúc gen như sau:

1 Bộ phận khởi động (Promoter): Điều khiển hoạt động của gen để sảnxuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu Gen Dystrophin gồm 7 promoter:Promoter não, promotor cơ, promotor tiểu não, promoter Dp 260, Dp 140, Dp

116, Dp 71

2 Exon: Gen Dystrophin gồm 79 exon, là vùng gen mã hoá để phiên mãthành mRNA, chứa đựng thông tin di truyền cho sự tổng hợp proteinDystrophin

3 Intron: Là vùng không mã hoá của gen nằm xen kẽ giữa những exon,vùng intron đóng vai trò quan trọng cho quá trình hoàn thiện mRNA và nóđược loại bỏ khi quá trình hoàn thiện mRNA kết thúc [20]

1.5 Cấu trúc và chức năng của protein Dystrophin

Protein Dystrophin gồm 3685 acid amin, dài 427 kD, nằm ở màng bàotương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng,bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ

Dystrophin được phân chia làm 4 vùng khác nhau bao gồm: Vùng gắnvới actin, vùng cấu trúc xoắn bậc 3, vùng giàu cystein và vùng C-tận Bốnvùng này có chức năng rất khác nhau, một số tác giả đã chứng minh rằngvùng N-tận, vùng giàu cystein và vùng C-tận có vai trò rất quan trọng vớichức năng của dystrophin, bệnh nhân có đột biến vùng này biểu hiện triệuchứng lâm sàng rất nặng nề

Dystrophin liên kết với phức hợp Dystrophin- glycoprotein-complex(DGC) thông qua sự sự tương tác của vùng C-tận với phức hợp Dystroglycan vàSyntrophin DGC có vai trò quan trọng đối với chức năng của Dystrophin trong

sự ổn định màng bào tương và là cầu nối tế bào cơ với vùng ngoại bào [8, 36]

Hình 1.5: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin và một số protein tương tác

với nó 1.6.Đột biến xóa đoạn gen Dystrophin

Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn, lặp đoạn vàđột biến điểm Trong đó tỉ lệ các dạng đột biến:

Đột biến xóa đoạn chiếm khoảng 60%

Đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 10-15%

Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhânDMD/BMD Đột biến này chiếm khoảng 6065% tổng số các dạng đột biến.Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspot regions): vùng tận cùng 5’(exon 119) và vùng trung tâm (exon 4360) Hai phương pháp đang được

dùng phổ biến trong chẩn đoán mất đoạn gen là PCR và MLPA Trong đóMLPA là phương án tối ưu hơn do chính xác và nhanh chóng.

Hình 1.6 Vị trí đột biến mất đoạn thường gặp trên gen Dystrophin(theo

Thomas Prior, 2005).

Foster (2006) đã xác định đột biến mất đoạn gen ở mức độ mRNA của

80 bệnh nhân DMD và ông đã xác định được tỷ lệ mất đoạn gen Dystrophinchiếm 63% bệnh nhân được chẩn đoán DMD Kết quả này phù hợp vớinghiên cứu của Prior (2005) đã phát hiện tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen

Dystrophin là 60  65% ở các bệnh nhân DMD Năm 2004, TS.BSTrần Vân Khánh đưa ra bảng tổng kết so sánh tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen trênbệnh nhân DMD giữa các dân tộc khác nhau ở châu Mỹ, châu Âu và châu Á;

tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen Dystrophin dao động trong khoảng 33  65%; tạichâu Mỹ và châu Âu bệnh nhân DMD của Hoa Kỳ và Hy Lạp có tỉ lệ đột biếnxóa đoạn gen khá cao 60  65%, tiếp sau là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhânDMD của Anh, thấp hơn là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhân DMD tại Đức,Argentina và Venezuela dao động từ 30% đến 40%; tại châu Á, bệnh nhân

DMD ở Thái Lan, Ấn Độ, Singapore và Nhật Bản có tỉ lệ đột biến xóađoạn gen cũng khá cao tương tự như một số nước ở châu Mỹ và châu Âu,khoảng 60  65%, bệnh nhân DMD ở các nước châu Á còn lại có tỉ lệ độtbiến xóa đoạn gen thấp hơn, dao động trong khoảng 33  46%, Việt Namvới tỉ lệ 40% và Philippin có tỉ lệ thấp nhất với 33% Như vậy, sự khácbiệt về yếu tố chủng tộc cũng ảnh hưởng đến quá trình đột biến và loại độtbiến gen Dystrophin.

TS.BS Trần Vân Khánh (2004) đã chẩn đoán 85 bệnh nhân Việt Nammắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR ở mức độ DNA, với 19 cặpmồi đặc hiệu khuyếch đại 19 exon thuộc hai vùng hotspot đã phát hiện được

32 trường hợp (chiếm tỉ lệ 38%) có đột biến mất đoạn gen; hầu hết các độtbiến này đều tập trung ở vùng trung tâm của gen, chiếm tỉ lệ 66%; 22%trường hợp xuất hiện đột biến xóa đoạn ở vùng đầu tận 5’ và 4 bệnh nhân(chiếm tỉ lệ 12%) có đột biến xóa đoạn kéo dài từ vùng tận 5’ đến vùng trungtâm của gen Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàn (2005) cho thấy62,5% các đột biến mất đoạn của bệnh nhân DMD nằm ở vùng trung tâm (từexon 42 đến exon 60) của gen Dystrophin và 21,9% đột biến gen xảy ra ởvùng tận 5’ (từ exon 1 đến exon 19) Năm 2002, Poh-San Lai đã tiến hànhnghiên cứu, so sánh đột biến mất đoạn gen Dystrophin của các bệnh nhânDMD thuộc 3 dân tộc ở Sigapore, Nhật Bản, Việt Nam và kết luận rằngkhông có sự khác biệt về phân bố vùng exon đột biến của 3 dân tộc này, cácđột biến mất đoạn gen chủ yếu tập trung ở vùng trung tâm (chiếm tỉ lệ 62 –70%), và 25 – 33% đột biến xảy ra ở vùng đầu tận 5’

1.7 Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong chẩn đoán mất đoạn gen dystropin.

DMD, như đã biết, có ba dạng đột biến Có nhiều các phương pháp khácnhau để xác định những đột biến này như PCR, RT- PCR, Multiplex PCR,MLPA…Hai kỹ thuật chính đang được sử dụng phổ biến hiện nay là PCR vàMLPA.

1.7.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):

PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm Từ một khuôn banđầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đích cần nghiên cứu

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Phân tử DNA được biến

tính ở nhiệt độ cao, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 – 60 giây Bước nàyDNA sợi kép tách ra thành hai mạch đơn

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phép

các mồi cặp với khuôn là các DNA mạch đơn, dao động trong khoảng 40oC –

70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 – 60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extennsion) Nhiệt độ tăng lên

720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động tổnghợp sợi DNA mới bằng cách kéo dài sợi mồi sử dụng 4 loại nucleotid (dATP,dCTP, dGTP, dCTP) Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cầnkhuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Hình 1.7 Các giai đoạn trong phản ứng PCR

Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ được dùng làmkhuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Như vậy sảnphẩm của phản ứng sẽ tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ Vậy sau n chu

kỳ số lượng DNA thu được là 2n bản copy Tuy nhiên, thông thường hiệu suấtcủa phản ứng sẽ không đạt 100% và chúng ta tiến hành 25-40 chu kỳ tùy theonồng độ sản phẩm của DNA

Kết quả là từ một lượng nhỏ chất khuôn ban đầu, chúng ta có thể thuđược một lượng lớn DNA Song điều đó cũng có nghĩa là, trong quá trình tiếnhành PCR việc nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng có thể đưa tới sựthất bại của phản ứng, khiến chúng ta không thu được hoặc chỉ thu được mộtlượng nhỏ sản phẩm DNA mong muốn

1.7.2 Phương pháp khuếch đại DNA dò – MLPA (Multiplex Dependent Probe Amplification)

Ligation-Kỹ thuật MLPA là một phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoánđột biến mất đoạn, lặp đoạn gen, cho phép phát hiện các tổn thương gen mộtcách nhanh chóng

 Nguyên lý: Đột biến được phát hiện bằng các đoạn dò ( probe) Mỗi probe gồm hai chuỗi oligonucleotid, các probe này lai đặc hiệu với

79 exon của đoạn gen đích Mỗi chuỗi đều có vị trí gắn đặc hiệu với exonđích và có gắn sẵn mồi, khi hai chuỗi này đã gắn được vào vị trí exonđích, enzym ligase sẽ gắn 2 chuỗi thành probe hoàn chỉnh Nếu gen bịđột biến, probe tương ứng với exon bị xóa không được hình thành do 2chuỗi không gắn được vào exon này Mồi gắn sẵn trên probe ( tác dụngkhuếch đại probe)có trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp mồiduy nhất để khuếch đại tất cả probe Riêng ở chuỗi dài có thêm mộtđoạn đệm gồm số nucleotid khác nhau, nhờ đó các probe có sự khácbiệt về kích thước, giúp phân tách khi điện di mao quản sau khuếch đạiprobe Kết quả phân tích sẽ cho 79 đỉnh có kích thước tương ứng với

79 probe đặc hiệu với 79 exon, khi không thấy xuất hiện đỉnh có nghĩa

đã xảy ra đột biến mất đoạn trên exon

Vị trí gắn đặc hiệu trên gen đích

Đoạn đệm

Mồi ngược Y

Mỗi probe này gồm nhánh

 Nhánh X : Là chuỗi oligonucleotid dài chứa mồi X

 Nhánh Y: là chuỗi oligonucleotid ngắn chứa mồi Y

Hai nhánh này đều có vị trí gắn đặc hiệu trên vị trí gen đích

- Phân tử oligonucleotid ngắn( chuỗi ngắn ) gồm 2 đoạn:

+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ laivới DNA đích khi tiến hành phản ứng lai Đoạn này có khoảng 21-30nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe

+ Đoạn 2 chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid của đoạn nàygiống nhau cho tất cả các probe Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đạiprobe khi tiến hành phản ứng PCR

- Phân tử oligonucleotid dài ( chuỗi dài) gồm 3 đoạn:

+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau chotất cả các probe Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe,

+ Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’

và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid không đặc hiệuvới DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khácnhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau Do

đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di

Các bước của kỹ thuật MLPA

Hình 1.9 Sơ đồ quy trình kỹ thuật MLPA

MLPA cũng có thể coi là một loại phản ứng PCR, tuân theo một quy trình nhiệt gồm nhiều bước.

 Bước 1: Biến tính ( ngày 1): Biến tính DNA trong môi trường nhiệt độ cao( khoảng 98 oC trong 5’) DNA mạch đôi tách ra thành 2 mạch đơn.Dừng lại ở nhiệt độ phòng

Biến tính và lai hóa

probeGen đích

Nối ghép sau lai

Khuếch đại

 Bước 2: Lai hóa ( ngày 1): Cho thêm probe, tạo điều kiện cho các probegắn vào các vị trí đích trên mạch DNA sợi đơn Tiếp tục chu trìnhnhiệt: 95 oC trong 1’ rồi ủ qua đêm từ 16-24h (60 oC)

 Bước 3: Nối ghép sau lai(ngày 2): Probe đã gắn vào đọan DNA đích.Giai đoạn này hai mồi X, Y đặc hiệu trên 2 chuỗi ngắn và dài kích hoạtkéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích và nối liềnlại với nhau Như vậy sản phẩm thu được là các probe khác nhau vớihai chuỗi oligonucleotid ngắn và dài đã được nối liền

 Bước 4: Phản ứng PCR(ngày 2) sản phẩm được trộn với PCR buffer vàmaster mix, rồi cho chạy phản ứng PCR để khuyếch đại các probe

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm chứng (n=5): Gồm 2 người nam bình thường, tiền sử gia đìnhkhông có ai mắc bệnh di truyền Nhóm chứng được dùng như chứng dươngbình thường để chạy MLPA cùng với mẫu bệnh nhân

- Nhóm nghiên cứu: gồm 6 bệnh nhân được chẩn đoán bị mắc bệnh loạndưỡng cơ Duchenne dựa vào một số triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàngđiển hình Bệnh nhân có tiền sử gia đình rõ ràng

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp phân tích bệnh chứng

Thiết kế nghiên cứu

Bước 1: Lấy mẫu máu

Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi theo phương pháp

- Chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt

Bước 5: Chạy điện di kiểm tra sản phẩm

Bước 6: Thực hiện kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: EC3 Imaging system

- Máy đọc huỳnh quang

- Máy đo OD: Nanodrop 1000

- Máy PCR: Eppendorf

- Máy chạy MLPA

2.3.2 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết DNA:

+ Dung dịch Lysis buffer RBC gồm: 4,3g NH4 Cl + 0,5g KHCO3 + 0,03gEDTA + 500ml H2 0, pH 7,1-7,4

+ Dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 :1)

+ Dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1)

+ Ethanol 100%, ethanol 70% bảo quản lạnh

+ Sodium acetate CH3COONa 3M (pH=5.2)

+ Dung dịch hòa tan DNA: đệm TE (Tris - EDTA)

- Hóa chất cho PCR:

+ Thành phần của PCR Master Mix gồm:

+ 10 X Buffer

+ GoTag chứa: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2

+ Primers: mồi xuôi, mồi ngược

+ Nước cất 2 lần dH2O

- Hóa chất chạy điện di:

+ Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 1X gồm: Tris base, boricacid và EDTA (pH 8.0) Khi sử dụng pha thành 10X

 Ligase-65 ( ống nắp xanh lá cây)

 SALSA PCR buffer

 SALSA PCR- primers( ống nắp nâu)

 SALSA Enzym Dilution Buffer( ống nắp xanh da trời)

 SALSA Polimerase ( Ống nắp da cam)

 Taq polymerase

 dH20

2.4 Quy trình kỹ thuật:

2.4.1 Lấy mẫu máu

Bệnh nhân được tiến hành lấy 10ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA(1mg EDTA/1ml máu toàn phần) Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng

Mẫu máu nên được dùng để tách DNA càng sớm càng tốt Khi chưadùng ngay cần bảo quản ở 4 ºC-8 ºC trong tối đa 4h(nếu lâu hơn phải táchhuyết thanh Huyết thanh giữ ở -20 ºC

2.4.2 Tách chiết DNA từ máu ngoại vi

+ Loại dịch nổi, thu cặn

Lặp lại quy trình này 2 lần cho tới khi thấy tủa trắng (nhân và xác tế bào)

- Bước 2: Phá vỡ bạch cầu