ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.6.Thực hiện kỹ thuật MLPA.
Trước tiên cần đo lại nồng độ DNA và kiểm tra độ tinh sạch của mẫu. Qui trình kỹ thuật
o Bước 1: Biến tính DNA( ngày 1)
1. Chuẩn bị ống effendof loại 0,2 ml chạy PCR
2. Cho 5 µl dung dịch DNA chứa 60ngDNA ( sử dụng nồng độ đo được bằng máy NanoDrop1000 để tính toán pha bằng nước cất cho vừa đủ)
3. Bắt đầu chu trình nhiệt đã được cài sẵn: biến tính ở 98ْ C trong 5’, rồi giữ ở 25 ْ C
o Bước 2 : Lai hóa( ngày 2)
1. Chuẩn bị master mix: Mỗi phản ứng
MLPA buffer 1,5 µl
Probe mix 1,5 µl
Tổng 3,0 µl
2. Khi nhiệt độ về 25 ْ C, mở nắp máy PCR, cho vào mỗi mẫu 3 µl master mix, trộn đều
3. Tiếp tục chu trình nhiệt: ủ 95 ْ C trong 1 phút, rồi 60ْ C trong 16-20 giờ
o Bước 3: Nối sau lai
Chuẩn bị Ligase master mix
Ligase 65 buffer A 3 µl
Ligase 65 buffer B 3 µl
Nước 25 µl
Trộn đều
1. Thêm 1 µl Ligase 65 cho mỗi phản ứng vào hỗn hợp Ligase Master Mix. Trộn nhẹ nhàng
2. Tiếp tục chu trình nhiệt, giữ ở 54 ْ C
3. Mở nắp máy PCR, thêm 32 µl Ligase Master Mix cho mỗi phản ứng. Trộn đều
4. Tiếp tục chu trình nhiệt: 15 phút ở 54 ْ C ( cho lai hóa), 5 phút ở 98ْ C ( bất hoạt ligase 65, rồi dừng ở 15ْ C
o Bước 4: Chạy PCR( khuếch đại, nhân bản probe)
1. Chuẩn bị các tube effendof mới loại 0,2ml chạy PCR
SALSA PCR buffer 4 µl Nước cất 2 lần 26 µl Trộn nhanh
3. Thêm 30 µl PCR buffer mix vào mỗi tube
4. Ở nhiệt độ phòng, lấy các tube trong máy PCR ra chuyển 10 µl sản phẩm nối trong máy PCR vào các tube tương ứng.
5. Chuẩn bị Polymerase master mix
SALSA PCR-primers 2 µl
SALSA enzyme dilution buffer 2 µl
Nước cất 2 lần 5,5 µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SALSA Polymerase 0,5 µl
Trộn đều, giữ trong đá cho tới khi dùng
5. Tiếp tục chu trình nhiệt, dừng ở 60ْ C và đặt tube PCR vào máy
6. Thêm 10 µl polymerase mix vào mỗi tube. Trộn đều và tiếp tục chu trình nhiệt:
95°C trong 30 giây
60°C trong 30 giây 35 chu kỳ 72°C trong 1 phút
Tiếp tục 72°C trong 20 phút, giữ ở 15°C
Sản phẩm được phân tích trên máy ABI 3100 ( Applied Biosystem) với phần mềm genscan. Mỗi đỉnh tương ứng với 1 exon. Độ cao thấp của các đỉnh song ( còn gọi là peak) sẽ được so sánh với mẫu chứng để phát hiện đột biến. Các vị trí exon không xuất hiện đỉnh tương ứng được coi là đột biến xóa đoạn, có thể dùng thêm các kỹ thuật sinh học phân tử khác để kiểm chứng.
Như vậy chu trình nhiệt chạy máy PCR dành cho kỹ thuật MLPA được cài đặt như sau:
1) Biến tính
1. 98°C 5 phút
2. 25°C dừng
2) Lai hóa
4. 60°C dừng
3) Nối ghép sau lai
5. 54°C dừng 6. 54°C 15 phút 7. 98°C 5 phút 8. 15°C dừng 4) Chạy PCR 9. 60°C dừng
35 chu kì: 95°C trong 30 giây 60°C trong 30 giây
72°C trong 1 phút
10. 72°C 20 phút
11. 15°C dừng
CHƯƠNG 3