ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2.Tách chiết DNA từ máu ngoại
Quy trình:
- Bước 1 : Phá vỡ hồng cầu
+ Cho vào ống eppendorf 1.5 ml: 0.5ml máu toàn phần chống đông EDTA +1ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer RBC) .
+ Lắc nhẹ. Vontex, để 5’ cho phản ứng xảy ra + Ly tâm 4000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi, thu cặn
Lặp lại quy trình này 2 lần cho tới khi thấy tủa trắng (nhân và xác tế bào) - Bước 2: Phá vỡ bạch cầu
+ Thêm 1ml dd BPS, vontex nhẹ + Ly tâm 4000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi, thu cặn
Chú ý: Lặp lại bước trên khi quan sát thấy tủa còn màu nâu để thu được tủa trắng ở đáy ống
+ Thêm 650µl dung dịch Lysis buffer HD + 5µl proteinase K.
+ Sau đó đem ủ ở 56ºC/qua đêm hoặc khi quan sát thấy tủa tan hết thành dung dịch đồng nhất.
- Bước 3: Tách, tủa DNA
o Thêm 500 µl dung dịch PCI ( Phenol: Chloroform: Isoamyl) tỷ lệ 25:24:1 để tủa protein
o Trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
Hỗn hợp phân thành 3 lớp: lớp trên cùng có chứa DNA, lớp giữa là cặn tế bào, lớp dưới cùng là dịch chiết.
Thu lớp dịch trên cùng
o Thêm 500 µl dung dịch CI 24:1 ( Chloroform: Isoamyl)
o Lắc trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
o Hỗn hợp phân thành 2 lớp: thu lớp dịch trên cùng + Tủa DNA:
o Trộn 1V dịch vừa thu được + 2.5V Ethanol 100% + 0.1V Sodium Acetate 3M.
o Lắc đều, để -20°C/2h để kết tủa DNA
o Ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu tủa
o Thêm 1ml Ethanol 70% , trộn đều
o Ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu được tủa DNA
o Tủa DNA để khô tự nhiên (56 ºC), sau đó hòa tan bằng đệm TE