KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.2. Xác định đột biến mất đoạn gen.
Phân tích kết quả MLPA của bệnh nhân mang mã số 1:
Xác định đột biến gen trên bệnh nhân mã số 1, tiến hành kỹ thuật MLPA với mẫu chứng, 79 đoạn dò được sử dụng lai đặc hiệu với 79 exon của gen dystrophy. Điểm đặc biệt của kỹ thuật MLPA đó là chỉ sử dụng một cặp mồi đã được gắn sẵn trên probe. Và không phải DNA đích được nhân lên trong quá trình PCR mà là các probe đã được lai hóa với DNA đích. Mỗi probe gồm hai chuỗi có vị trí gắn đặc hiệu trên gen đích sau đó hai chuỗi này sẽ được nối lại. Chỉ những probe đã được nối mới có thể được nhân lên trong phản ứng PCR. Trong đột biến mất đoạn, probe sẽ không được gắn lên các exon đã bị mất do đó sẽ không xuất hiện các đỉnh probe tương ứng
So sánh kết quả MLPA của bệnh nhân và kết quả MLPA của mẫu đối chứng nam, kết quả cho thấy không xuất hiện đỉnh của các exon từ 46 đến 50 (Hình 3.1). Theo nghiên cứu của Hsiao-Lin Hwa và cộng sự sử dụng kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn, lặp đoạn trên gen dystrophin, xóa một hoặc nhiều exon là kết quả mất hoàn toàn của một hoặc nhiều đỉnh tương ứng của bệnh nhân nam. Xóa đoạn được tin cậy khi có sự tham gia của hai hoặc nhiều exon liền kề (hoặc là được xác định bởi phân tích PCR). Như vậy, chúng ta có thể khẳng định bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn gen dystrophin gồm 3 exon từ 11 đến 13. Như vậy ở bệnh nhân này, đột biến xóa đoạn xảy ra trong vùng hotspot tại trung tâm gen dystropin
Phân tích kết quả MLPA của bệnh nhân mang mã số 2:
Sau khi so sánh kết quả hình ảnh khuếch đại 79 probe tương ứng 79 exon của gen dystropin của mẫu bệnh nhân và mẫu đối chứng. Kết quả ( hình 3.2) cho thấy không xuất hiện các đỉnh tương ứng của 7exon liền kề tại exon từ 61-67. Như vậy có thể kết luận rằng đã có đột biến mất đoạn xảy ra trên bệnh nhân này. Tuy nhiên có một điểm đặc biệt, đó là đột biến gen xảy ra ngoài vùng hotspot. Trong đột biến gen gây nên bệnh DMD, đột biến xoá đoạn chiếm tỉ lệ cao nhất và thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hot spot): vùng trung tâm (exon 43- 60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19). Trong kỹ thuật PCR, do đoạn gen dystropin quá dài nên không thể khuếch đại hết 79exon, thường chỉ 19-25 cặp mồi được sử dụng để phân tích các exon nằm trong vùng hot spot dể xảy ra đột biến mất đoạn để tiết kiệm thời gian, kinh phí và sức lực. Vì vậy, giả sử ta không sử dụng kỹ thuật MLPA mà sử dụng PCR thường, đột biến mất đoạn này sẽ không được phát hiện, dẫn tới sai lạc trong nhận định kết quả
Phân tích kết quả MLPA của bệnh nhân mang mã số 3:
Ở bệnh nhân này, tiếp tục so sánh, đối chứng hình ảnh thu nhận được từ 79 probe tương ứng với 79 exon của mẫu bệnh nhân và mẫu chứng nam. Kết quả ( hìn 3.3) cho thấy có một vị trí không xuất hiện đỉnh tương ứng, đó là tại exon 18. Một câu hỏi đặt ra ở đây là liệu rằng đây có phải là đột biến xóa đoạn hay không? Xóa đoạn chỉ được tin cậy khi có sự tham gia của hai hoặc nhiều exon liền kề. Mội số trường hợp có thể xảy ra: thực sự mất exon 18, xảy ra đột biến điểm tại vị trí gắn probe, hoặc không có đột biến mà chỉ do một nguyên nhân nào đo khiến probe không gắn được vào exon 18. Trong trường hợp này, cần thực hiện giải trình tự gen để xác định chính xác đột biến.
Kỹ thuật giải trình tự gen đã được tiến hành với bệnh nhân mã số 3. Kết quả ( Hình 3.4) cho thấy bệnh nhân có đột biến thay thế nucleotide (C thành T ) tại vị trí 2227, làm bộ ba tại vị trí 743 ( CAG) chuyển thành bộ ba mã kết thúc TAG ( Stop codon). Đột biến này tạo nên mã kết thúc sớm gây nên thể bệnh nặng DMD trên lâm sàng.
Giả sử với bệnh nhân này ta sử dụng cặp mồi cho exon 18 làm kỹ thuật PCR thường, kết quả đột biến không phát hiện được và ta sẽ vẫn thấy xuất hiện vạch khi kiểm tra bằng điện di. Nguyên nhân là do vị trí đột biến điểm tại exon này không nắm trong vị trí gắn mồi. Do đó mồi vẫn gắn vào exon 18 và nhân bản exon này trong khi chạy PCR.
Phân tích kết quả MLPA của bệnh nhân mang mã số 4:
Ở bệnh nhân này, tiếp tục so sánh, đối chứng hình ảnh thu nhận được từ 79 probe tương ứng với 79 exon của mẫu bệnh nhân và mẫu chứng nam. Kết quả (hình 3.5) cho thấy không xuất hiện đỉnh tương ứng với exon tại vị trí exon 50,51,52. Điều này cho thấy có đột biến xóa doạn gen gồm 3exon 50, 51, 52. Như vậy đột biến này, giống như bệnh nhân số 1 đó là đột biến xóa đoạn ở vùng hot spot trung tâm gen
Phân tích kết quả MLPA của bệnh nhân mang mã số 5:
Ở bệnh nhân này, tương tự như nghiên cứu trên mẫu của bệnh nhân mã số 1 và 2, tiến hành phản ứng MLPA, các probe sau khi được nối ghép và khuếch đại cho vào phân tích, kết quả được thể hiện bằng các đỉnh sau khi điện di trên hệ thống mao quản, so sánh chiều cao đỉnh so với mẫu đối chứng để xác định đột biến xóa đoạn. Kết quả (hình 3.6) cho thấy không xuất hiện các đỉnh tương ứng với 5 exon từ exon 3 tới exon 7. Điều này khẳng định bệnh nhân mã số 5 bị đột biến xóa đoạn gồm 5 exon là 3, 4, 5, 6, 7. Đây là đột biến xóa đoạn trong vùng hotspot ở đầu 5’. Đột biến này làm cho protein
dystrophin bị cắt ngắn và là nguyên nhân của sự biểu hiện bệnh DMD. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với chẩn đoán của lâm sàng.
Phân tích kết quả MLPA của bệnh nhân mang mã số 6:
Ở bệnh nhân mã số 6, tương tự như nghiên cứu trên mẫu của bệnh nhân mã số 1 và 2, tiến hành phản ứng MLPA, các probe sau khi được nối ghép và khuếch đại cho vào phân tích, kết quả được thể hiện bằng các đỉnh sau khi điện di trên hệ thống mao quản, so sánh chiều cao đỉnh so với mẫu đối chứng để xác định đột biến xóa đoạn. Kết quả (hình 3.7) cho thấy không xuất hiện các đỉnh tương ứng với 2 exon là exon 51 và exon 52. Điều này khẳng định bệnh nhân mã số 6 bị đột biến xóa đoạn gồm 2 exon 51 và 52. Đột biến xóa đoạn này xảy ra trong vùng hot spot trung tâm gen
Như vậy trong 6 bệnh nhân trong mẫu nghiên cứu, phát hiện 1 bệnh nhân có đột biến điểm và 5 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn. Trong 5 đột biến xóa đoạn, có 4 đột biến nằm ở vùng hot spot trung tâm gen và 1 đột biến nằm ở vùng hotspot đầu 5’.