Nghiên cứu xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú ở phụ nữ việt nam

ĐẶT VẤN ĐỀUng thư vú (UTV) không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiềunước. Tỷ lệ UTV ngày càng tăng ở các nước đang phát triển (khoảng 5%năm) đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á. Theo thống kê của Hội Ung thưHoa Kỳ (American Cancer Society) năm 2007 có khoảng 240510 phụ nữ mới được chẩn đoán ung thư vú, ước đoán khoảng 42460 ca tử vong. Tại Việt Nam, theo Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia, mỗi năm có thêm khoảng 14000 phụ nữ bị mắc mới 3.Căn nguyên bệnh sinh ung thư vú rất phức tạp, vì vậy việc phòng ngừa, phát hiện sớm và điều trị còn gặp nhiều khó khăn. Ngày nay các nhà nghiên cứu đang tập trung nghiên cứu các yếu tố nguy cơ ung thư vú để tìm ra những yếu tố chính với mục đích giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ung thư vú. Nhiều nghiên cứu ở Mỹ và châu Âu cho rằng khoảng 1015% ung thư vú có yếu tố gia đình, nghĩa là người bệnh mang gen đột biến từ gen di truyền của mẹ. Những ung thư này là kết quả của sự đột biến một số gen trong đó có 2 gen quan trọng được nghiên cứu nhiều nhất đó là gen BRCA1 và BRCA2 21. Những phụ nữ có đột biến gen BRCA1 và BRCA2 sẽ có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn so với những người không mang gen đột biến này. Ở Mỹ tính trung bình 1 phụ nữ có khả năng mắc ung thư vú là 12% nếu họ sống đến tuổi 90 và ung thư buồng trứng là 1,8%. Nhưng nếu một phụ nữ có đột biến gen BRCA có thể tăng khả năng mắc ung thư vú lên đến 85% 21.Tại châu Á, từ năm 1995 các nghiên cứu về đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú và ung thư buồng trứng đã được tiến hành tạiPhilipine 10, Mông Cổ 15, Thái Lan 38, và Singapor 26. Những năm gần đây, nhờ có sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được nhiều đột biến điểm trên gen BRCA1 và BRCA2. Những đột biến nguyên khởi liên quan đến ung thư vú được nghiên cứu ở nhiều tộc người khác nhau và có liên quan mật thiết với căn bệnh ung thư vú là đột biến 185delAG, 5382insC trên gen BRCA1 và 6174delT trên gen BRCA2. Các đột biến này đã được thống kê là xuất hiện với tần suất giao động giữa các quốc gia. Việc phát hiện người bệnh mang đột biến nguyên thủy trong các gia đình bệnh nhân ung thư vú sẽ rất có ý nghĩa trong việc phòng bệnh, tiên lượng và điều trị dự phòng. Mặt khác việc phát hiện người lành mang gen đột biến cũng giúp các nhà tư vấn di truyền đưa ra lời khuyên hoặc lời cảnh báo về một nguy cơ ung thư vú cho những thành viên trong gia đình họ.Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay nước ta mới chỉ có nhóm tác giả Lê Thị Minh Chính nghiên cứu đột biến gen này trên bệnh nhân ung thư vúvới số mẫu 24 bệnh nhân tại bệnh viện K. Kết quả không phát hiện thấy đột biến 185delAG ở gen BRCA1 và 6174delT ở gen BRCA2 2. Một câu hỏi đặt ra liệu tần suất đột biến 2 gen này ở phụ nữ Việt Nam có thực sự thấp không. Với 24 bệnh nhân được nhóm tác giả nghiên cứu thì kết quả này mới chỉ mang tính chất thử nghiệm, thăm dò và gợi ý mà chưa đủ sức thuyết phục để khẳng định chắc chắn về tần suất đột biến 2 gen nói trên.Để tiếp tục công trình nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú cũng như những phân tích di truyền ở mức độ phân tử của phụ nữ Việt Nam, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam” với mục tiêu: Xác định tần suất đột biến gen BRCA1 và BRCA2 ở bệnh nhân nữ ung thư

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Phạm Duy Hiển

Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS Tạ Văn Tờ

TS Nguyễn Văn Định

Cơ quan chủ quản : Bệnh viện K

Hà Nội, 2010

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiều nước Tỷ lệ UTV ngày càng tăng ở các nước đang phát triển (khoảng 5%/năm) đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á Theo thống kê của Hội Ung thư Hoa Kỳ (American Cancer Society) năm 2007 có khoảng 240510 phụ nữ mới được chẩn đoán ung thư vú, ước đoán khoảng 42460 ca tử vong Tại Việt Nam, theo Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia, mỗi năm có thêm khoảng

14000 phụ nữ bị mắc mới [3]

Căn nguyên bệnh sinh ung thư vú rất phức tạp, vì vậy việc phòng ngừa, phát hiện sớm và điều trị còn gặp nhiều khó khăn Ngày nay các nhà nghiên cứu đang tập trung nghiên cứu các yếu tố nguy cơ ung thư vú để tìm ra những yếu tố chính với mục đích giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ung thư vú Nhiều nghiên cứu ở Mỹ và châu Âu cho rằng khoảng 10-15% ung thư vú có yếu tố gia đình, nghĩa là người bệnh mang gen đột biến từ gen di truyền của mẹ Những ung thư này là kết quả của sự đột biến một số gen trong đó có 2 gen quan trọng được nghiên cứu nhiều nhất đó là gen BRCA1 và BRCA2 [21]

Những phụ nữ có đột biến gen BRCA1 và BRCA2 sẽ có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn so với những người không mang gen đột biến này Ở Mỹ tính trung bình 1 phụ nữ có khả năng mắc ung thư vú là 12% nếu họ sống đến tuổi 90 và ung thư buồng trứng là 1,8% Nhưng nếu một phụ nữ có đột biến gen BRCA có thể tăng khả năng mắc ung thư vú lên đến 85% [21]

Tại châu Á, từ năm 1995 các nghiên cứu về đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú và ung thư buồng trứng đã được tiến hành tại Philipine [10], Mông Cổ [15], Thái Lan [38], và Singapor [26] Những năm gần đây, nhờ có sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học

đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được nhiều đột biến điểm trên gen

BRCA1 và BRCA2 Những đột biến nguyên khởi liên quan đến ung thư vú

được nghiên cứu ở nhiều tộc người khác nhau và có liên quan mật thiết với

căn bệnh ung thư vú là đột biến 185delAG, 5382insC trên gen BRCA1 và

6174delT trên gen BRCA2 Các đột biến này đã được thống kê là xuất hiện

với tần suất giao động giữa các quốc gia Việc phát hiện người bệnh mang đột biến nguyên thủy trong các gia đình bệnh nhân ung thư vú sẽ rất có ý nghĩa trong việc phòng bệnh, tiên lượng và điều trị dự phòng Mặt khác việc phát hiện người lành mang gen đột biến cũng giúp các nhà tư vấn di truyền đưa ra lời khuyên hoặc lời cảnh báo về một nguy cơ ung thư vú cho những thành viên trong gia đình họ

Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay nước ta mới chỉ có nhóm tác giả

Lê Thị Minh Chính nghiên cứu đột biến gen này trên bệnh nhân ung thư vú với số mẫu 24 bệnh nhân tại bệnh viện K Kết quả không phát hiện thấy đột biến 185delAG ở gen BRCA1 và 6174delT ở gen BRCA2 [2] Một câu hỏi đặt ra liệu tần suất đột biến 2 gen này ở phụ nữ Việt Nam có thực sự thấp không Với 24 bệnh nhân được nhóm tác giả nghiên cứu thì kết quả này mới chỉ mang tính chất thử nghiệm, thăm dò và gợi ý mà chưa đủ sức thuyết phục

để khẳng định chắc chắn về tần suất đột biến 2 gen nói trên

Để tiếp tục công trình nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ gây ung thư vú cũng như những phân tích di truyền ở mức độ phân tử của phụ nữ Việt Nam,

chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trong ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam” với mục tiêu:

Xác định tần suất đột biến gen BRCA1 và BRCA2 ở bệnh nhân nữ ung thư

vú tại Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng gen BRCA1

Gen BRCA1 được phát hiện vào năm 1994 do các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu Sức khoẻ Quốc gia (NIH) Hoa Kỳ (www.nih.gov)

- Vị trí gen BRCA1: Gen BRCA1 nằm trên vai dài của NST 17, vùng 2, băng

1, băng phụ 2

Hình 1.1 Sơ đồ nhiễm sắc thể 17 và vị trí của gen BRCA1

(Nguồn:www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps)

- Cấu trúc gen BRCA1: Gen BRCA1 gồm 24 exon và 2 intron, có kích thước

khoảng 80 kb, từ cặp nucleotide 92500 - 173688, tương đương 81188 bp Trong đó, exon 11 lớn nhất, chiếm 55% chiều dài gen BRCA1 Kích thước

phiên mã của mARN là 7,8 kb, mã hoá cho phân tử protein gồm 1863 aa [8]

Hình 1.2 Cấu trúc gen BRCA1 [41]

- Chức năng gen BRCA1: Gen BRCA1là một loại gen được biết đến như là gen ức chế tạo u, nó có chức năng ngăn ngừa sự phát triển và phân chia nhanh chóng hoặc không kiểm soát được của các tế bào Mặt khác gen BRCA1 còn sản sinh ra 1 loại protein tham gia trực tiếp vào việc sửa chữa trong quá trình tái bản DNA, duy trì sự ổn định thông tin di truyền của tế bào Ngoài ra BRCA1 còn có chức năng điều hòa sự phát triển của biểu mô tuyến vú Các nghiên cứu đã phát hiện hơn 1000 đột biến ở gen BRCA1, trong số đó nhiều đột biến làm tăng nguy cơ ung thư vú [37]

1.2 Vị trí, cấu trúc và chức năng gen BRCA2

Gen BRCA2 do GS Michael Stratton và TS Richard Wooster (Viện nghiên cứu ung thư Anh) phát hiện năm 1995 [51]

- Vị trí gen BRCA2: Gen BRCA2 nằm trên vai dài của NST 13, vùng

1, băng 3, băng phụ 1

BRCA2 - Chromosome 13

Hình 1.3 Sơ đồ nhiễm sắc thể 13 và vị trí của gen BRCA2

(Nguồn:http://ghr.nlm.nih.gov/chromosome)

- Cấu trúc gen BRCA2: BRCA2 bao gồm 27 exon và 31 intron [34], với độ

lớn khoảng 80kb, từ cặp nucleotide 5000 đến cặp nucleotide 89192, tương đương 84192 bp Kích thước phiên mã của mRNA khoảng 10,4 kb, mã hoá cho phân tử protein gồm 3418 axit amin [49]

Hình 1.4 Cấu trúc gen BRCA2 [41]

- Chức năng gen BRCA2: Cũng như gen BRCA1, gen BRCA2 có chức năng

kìm hãm sự phát triển của khối u, sửa chữa trong quá trình tái bản DNA, điều hòa sự phát triển của biểu mô tuyến vú Nhưng khác với gen BRCA1 là gen BRCA2 không có liên quan đến ung thư buồng trứng Các nghiên cứu đã phát hiện hơn 800 đột biến ở gen BRCA2, trong số đó nhiều đột biến làm tăng nguy cơ ung thư vú Các đột biến gen BRCA2 thường là đột biến chèn hoặc

xóa một số lượng nhỏ các base, chủ yếu là đột biến xoá [12]

1.3 Tình hình nghiên cứu gen BRCA1 trên thế giới

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Viện Walter & Eliza, thành phố Melbourne - Australia: loại gen có tên gọi là BRCA1 bị biến đổi,

nó sẽ chiếm tới 65% nguyên nhân gây ung thư vú ở phụ nữ Phát hiện này được đánh giá là bước đột phá, đặt nền móng quan trọng trong quá trình điều trị hiệu quả căn bệnh nguy hiểm này [24]

Năm 1993 Easton và cs cho rằng gen BRCA1 rất dễ bị tổn thương, ước tính tỷ lệ đột biến gen BRCA1 là 1/700 phụ nữ, chiếm khoảng 71% trong số các đột biến gen và nguy cơ ung thư vú trong số này là 62%, ung thư buồng trứng là 11% ở tuổi 60 [14]

Năm 1996 Marcus và cs cho thấy ung thư vú do đột biến gen BRCA1 thường biểu hiện ở tuổi trẻ hơn và giai đoạn sớm hơn so với ung thư vú nói chung (tuổi trung bình là 42,8 so với ung thư vú chung là 62,9) Những u này thường biểu hiện tỷ lệ tăng sinh cao, độ mô học cao và thường ở dạng dị hợp

tử [30] Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Tavani và cs (1999), phụ nữ có đột biến gen BRCA1 thì nguy cơ phát triển ung thư vú đối bên là 64% và nguy cơ ung thư buồng trứng là 44 - 63% [48] Roa và cs (1996) lại cho rằng đột biến gen BRCA1 chiếm 8% ung thư vú trước tuổi phu; 5% sau tuổi 30 và 41% sau tuổi 50 [44]

Năm 2000 Foulkes và cs cho thấy có 13,6% bệnh nhân ung thư vú mang đột biến trong gen BRCA1 Nhưng một điều đáng quan tâm hơn là những bệnh nhân mang đột biến BRCA1 có tỷ lệ tử vong cao hơn rất nhiều so với những bệnh nhân không mang đột biến này (50% / 89,6%) [22]

Năm 2002 Maria và cs ước tính sự phổ biến của các đột biến trong gen BRCA1 ở những trường hợp mắc ung thư vú được chọn lựa ngẫu nhiên tại Philippin là 5,1% [31]

1.3.1 Tần suất các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA1

Khi giải trình tự các đột biến trong gen BRCA1 thấy có những thay đổi rất lớn ở những gia đình có quan hệ huyết thống tại nhiều nước và các miền dân số khác nhau, trong đó ở Anh là 21%; Pháp là 24%; Canada là 40%; Mỹ

là 39%; Những gia đình ở Thụy Điển và Hunggary thì tỷ lệ đó là 35% [13]

David và cs (1996) đã phát hiện 5 đột biến dòng mầm (germ-line mutation) trên gen BRCA1 ở 163 bệnh nhân Ashkenazi bị ung thư vú và ung

thư buồng trứng được lựa chọn ngẫu nhiên trong đó có 3 đột biến xảy ra trên exon 11 và 2 đột biến xảy ra trên exon 2 [9]

Bảng 1.1 Các đột biến được phát hiện ở gen BRCA1 [9]

Ung thư vú Ung thư buồng trứng Các đột

biến Exon Tần suất Tuổi Tần suất Tuổi

UTV

≤50 tuổi

UTBT tuổi bất kỳ

Đột biến

UTV

≤50 tuổi

UTBT tuổi bất

kỳ 185delAG 15/103 3/103 3884insA 1/103 1/103

E143X 7/103 3 E908X 4/103 0 816delGT 6/103 1/103 E1060X 1/103 0

2329delCA 1/103 2/103 5296del4 4/103 1/103 2576delC 3/103 2/103 5382insCT 0/103 1/103

3600del11 1/103 1/103 5382insC 11/103 6/103

3604delA 1/103 4/103 W1837X 5/103 1/103

3875del4 3/103 1/103

Ewa và cs (2002) phát hiện 4 đột biến dòng mầm trên BRCA1 ở người

Ba Lan - Upper Silesia các đột biến đó là 185delAG, 5382insC, C61G, và

4153delA Trong số này đột biến 185delAG và 5382insC là những đột biến

xuất hiện với tần số cao trong gen BRCA [18]

Helen và cs (2002) phát hiện 18 đột biến trên gen BRCA1 ở người da trắng, người Mỹ-Phi và người gốc Mỹ La Tinh - Hispan [25]

Bảng 1.3 Các đột biến tìm thấy ở gen BRCA1 [25]

Các đột biến Tần suất Các đột biến Tần suất

Chú thích: IVS: Intron Variant Sequence: Trình tự biến đổi đoạn intron

Lilian và cs (2004) phát hiện 18 đột biến thường xảy ra trên gen BRCA1 ở 63 gia đình người Chi Lê [28]

Bảng 1.4 Các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA1 [28]

Các đột biến Exon Codon Các đột biến Exon Codon

1.3.2 Tần suất đột biến 185delAG và 5382insC trên gen BRCA1

Tuy có rất nhiều đột biến xảy ra trên gen BRCA1, nhưng những đột biến xuất hiện với tần số cao hơn các đột biến khác và có liên quan mật thiết đến ung thư vú là đột biến 185delAG và 5382insC

David B Berman (1996), nghiên cứu 163 cá thể bị ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng (ung thư buồng trứng ở các lứa tuổi, ung thư vú dưới tuổi 50) người Ashkenazi Kết quả cho thấy đột biến 185delAG chiếm tỷ lệ khá cao 13/163 (7,9%) [9]

Roa và cs (1996), nghiên cứu 3000 bệnh nhân bị ung thư vú người Do Thái, các mẫu này được chọn lựa một cách ngẫu nhiên Kết quả cho thấy đột biến 185delAG và 5382insC là những đột biến thường xuyên xảy ra trên gen BRCA1 lần lượt chiếm tỷ lệ 1,09% và 0,13% [103]

Ellen và cs (1999), nghiên cứu 412 bệnh nhân người Do Thái bị ung thư vú Kết quả cho thấy chỉ phát hiện 48 bệnh nhân mang các đột biến gen BRCA Trong đó 26/412 (6,3%) bệnh nhân mang đột biến 185delAG, 8/412 (1,9%) bệnh nhân mang đột biến 5382insC Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân này là 46,4 [16]

Pak và cs (1999), thử nghiệm ở 66 phụ nữ Do Thái bị ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng Kết quả cho thấy xác định được 7 cá thể mang đột biến 185delAG (10,6%), 4 cá thể mang đột biến 5382insC (6,0%) trên gen BRCA1 [36]

Backe J và cs (1999), nghiên cứu 248 bệnh nhân mắc ung thư vú và

800 trường hợp được lựa chọn ngẫu nhiên người Đức Kết quả cho thấy trong

số 248 bệnh nhân mắc ung thư vú phát hiện 10 bệnh nhân mang đột biến 5382insC trên gen BRCA1 chiếm (4%) và trong số 800 trường hợp lựa chọn ngẫu nhiên phát hiện 8 (1%) trường hợp mang đột biến 5382insC trên gen BRCA1 [7]

Foulkes và cs (2000), nghiên cứu 118 phụ nữ người Do Thái bị ung thư

vú di truyền tuổi dưới 65 Kết quả cho thấy 11/118 bệnh nhân mang đột biến 185delAG chiếm tỷ lệ 9,3%; 5/118 bệnh nhân mang đột biến 5382insC chiếm 4,2% Nhưng một điều đáng quan tâm hơn là những người mang đột biến BRCA1 có tỷ lệ tử vong cao hơn rất nhiều so với những bệnh nhân không mang đột biến này (50% / 89,6%) [22] Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phương L Mai, 2009: 27% / 25% những người có quan hệ họ hàng mang đột biến so với những người không mang đột biến; 10% / 16% những người mang đột biến so với những người không mang đột biến có quan hệ huyết thống [39] Điều này nói lên mối liên quan của gen BRCA1 với bệnh nhân ung thư vú nói chung và những gia đình có tiền sử ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng nói riêng

Ewa và cs (2000), phân tích một số đột biến dòng mầm: 5382insC, 185delAG, C61G và 4153delA trong gen BRCA1 ở 148 gia đình bị ung thư

vú người Ashkenazi Kết quả cho thấy đã phát hiện 15 gia đình mang đột biến dòng mầm trong gen BRCA1, trong đó có các đột biến là: 5382insC, 185delAG và C61G Đột biến 185delAG có 2/15 (13,3%) trong tổng số các

gia đình có đột biến, đột biến 5382insC là đột biến dòng mầm hay xảy ra nhất 11/15 (73%) trên gen BRCA1 [17]

Ewa và cs (2002), nghiên cứu 47 gia đình bị ung thư vú /ung thư buồng trứng người Ba Lan - Upper Silesia Kết quả phát hiện thấy 11 (23,4%) gia đình mang đột biến 5382insC Tần suất của các đột biến thông thường này có thể so sánh với những kết quả nghiên cứu trước ở người Do Thái Ashkenazi, người Aixơlen và người Nga là tương đối cao Tuy vậy tần suất này cũng không thể đại diện cho toàn dân số Ba Lan [18]

Lilian và cs (2004), nghiên cứu 18 đột biến thường xảy ra trong gen BRCA1 ở 5 Exon (2,5,11,13 và 20) và 2 Intron (5 và 12) trong 63 gia đình bị ung thư vú và/hoặc ung thư buồng trứng người Chi lê (bảng 5) Trong 18 đột biến này, nhóm tác giả đi sâu nghiên cứu 5 đột biến gen BRCA1 đó là 185delAG (Exon 2), 1675delA (Exon 11b), E1250X (Exon 11d), R1443X (Exon 13) và 5382insC (Exon 20) Qua 98 người có quan hệ họ hàng trong 63 gia đình bị ung thư vú và / hoặc ung thư buồng trứng Kết quả cho thấy 5 gia đình có đột biến ở gen BRCA1 (chiếm 7.93%), nhưng chỉ có 3 gia đình (chiếm 4.76%) mang hai đột biến 185delAG ở Exon 2 và 5382insC ở Exon

20 Đột biến 185delAG là loại đột biến xảy ra với tần số cao nhất trong gen BRCA1 [28]

Antoniou và cs (2003), nghiên cứu 498 bệnh nhân ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng người Ashkenazi và người Đông Âu Kết quả cho thấy 75/498 (15%) trường hợp mang đột biến 185delAG; 69/498 (13,8%) ở trường hợp mang đột biến 5382insC và nguy cơ cao mắc ung thư vú 64% ở tuổi 70 với đột biến 185delAG, 67% ở tuổi 70 với đột biến 5382insC ở người Do Thái [6]

Parvin và cs (2006), nghiên cứu trên 400 bệnh nhân ung thư vú người Iran thời kỳ đầu và quan tâm đến các quan hệ huyết thống Kết quả cho thấy đột biến 185delAG được tìm thấy ở 2/400 (0,5%) đối với những trường hợp

có quan hệ huyết thống, cả hai đột biến này đều rơi vào 2 chị em gái của cùng một gia đình (chị gái 45 tuổi, em gái 30 tuổi) [37] Điều đó nói lên rằng trong quan hệ huyết thống đột biến 185delAG chiếm tỷ lệ rất thấp ở người Iran

Muhammad và cs (2006), nghiên cứu 176 gia đình ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng người Pakistan Kết quả cho thấy phát hiện 23 (13,07%)

đột biến dòng mầm gen BRCA1, trong đó 4 đột biến 185delAG, 185insA, S1503X và R1835X xuất hiện thường xuyên, chiếm 52% trong tất cả đột biến

được phát hiện ở gen BRCA1[33]

Mitrofannov và cs (2009), phân tích 564 mẫu DNA của nhóm phụ nữ người Đông Âu mắc ung thư vú Kết quả cho thấy có 11 bệnh nhân (1,95%) được phát hiện mang đột biến 5382insC ở dạng dị hợp tử [32]

Almulla và cs (2009), nghiên cứu 241 bệnh nhân bị ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng để phát hiện đột biến dòng mầm ở người Yorkshire (Anh) trên gen BRCA1 Kết quả cho thấy có 136 (56%) cá thể mang đột biến gen BRCA1, trong số đó có 28 (20,5%) cá thể mang đột biến 185delAG xảy

ra ở Exon 2 [4]

1.4 Tình hình nghiên cứu gen BRCA2 trên thế giới

Các đột biến trong gen BRCA2 chiếm một lượng đáng kể trong các trường hợp bị ung thư vú di truyền [25] Một nghiên cứu mới đây về ung thư

vú gia đình cho thấy nguy cơ gây ung thư vú của gen BRCA2 chiếm khoảng 60-65% ở tuổi 70, 83-87% ở tuổi 80 người Ashkenazi [34] Sự biến đổi ở gen BRCA2 không phải chỉ có một mà có thể tới hàng chục thậm chí hàng vài trăm đột biến và những đột biến trên gen BRCA2 không chỉ liên quan đến ung thư vú mà còn liên quan đến ung thư buồng trứng [33]

1.4.1 Tần suất các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA2

Trên thế giới, các đột biến được tìm thấy trên gen BRCA2 xuất hiện với tần suất rất khác nhau Khi giải trình tự gen BRCA2 thấy có những thay đổi rất lớn ở những gia đình có quan hệ huyết thống tại nhiều nước và các

miền dân số khác nhau, trong đó ở Anh là 9%; Pháp là 18%; Canada là 16%;

Mỹ là 25%; Ở Thụy Điển và Hunggary thì tỷ lệ đó là 35% [13]

Thomas và cs (1998) phát hiện 31 đột biến gen BRCA2 của bệnh nhân

UTV và hoặc UTBT tại các phòng khám của Mỹ [50]

Bảng 1.5 Các đột biến được phát hiện ở gen BRCA2 [50]

Đột biến Tần suất Đột biến Tần suất Đột biến Tần suất

1982delA 2/53 5950delCT 3/53 7990delA 2/53

2041insA 2/53 6174delT 4/53 8141del5 1/53

2041insA 3/53 6426delTT 4/53 9132delC 2/53

Ewa và cs (2002) phát hiện 2 đột biến 6174delT và 9631delC trên gen

BRCA2 người BaLan Đột biến 6174delT chiếm 1,13%, đột biến 9631delC chiếm 1,04% trong tổng 148 bệnh nhân ung thư vú [18]

Almulla và cs (2009) phát hiện 10 đột biến trên gen BRCA2 ở người Yorkshire (Anh) [4]

Bảng 1.6 Các đột biến được tìm thấy ở gen BRCA2 [4]

1.4.2 Tần suất đột biến 6174delT trên gen BRCA2

Neuhausen và cs (1996), nghiên cứu 200 phụ nữ ung thư vú thời kỳ đầu gồm 107 người Ashkenazi và 93 người không phải Ashkenazi Kết quả cho thấy 6/80 (8%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT ở tuổi trước 42 và 2/27 (7%) bệnh nhân mang đột biến trên ở tuổi 42-50 có tiền sử gia đình bị ung thư vú hoặc ung thư buồng trứng Không phát hiện thấy đột biến 6174delT ở 93 người không có nguồn gốc Do Thái [34]

Roa và cs (1996), nghiên cứu 107 phụ nữ Do Thái ung thư vú Kết quả cho thấy 8/107 (7,4%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT ở độ tuổi 50 Nhưng khi nghiên cứu 3085 trường hợp được lựa chọn một cách ngẫu nhiên

trong dân số người Ashkenazi Kết quả cho thấy đột biến 6174delT chiếm 1,52% [44]

Dvora và cs (1997), nghiên cứu 243 bệnh nhân bị ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng, trong đó 199 bệnh nhân là người gốc Ashkenazi và 44 bệnh nhân không phải người Ashkenazi bệnh nhân được chia thành 2 nhóm: Nhóm ung thư buồng trứng và nhóm ung thư vú Kết quả cho thấy trong tổng

số 199 người Ashkenazi có 14 bệnh nhân mang 6174delT (7%) Nhưng nếu tính rêng nhóm ung thư buồng trứng thì những bệnh nhân mang đột biến 6174delT chiếm tỷ lệ 28,6% (6/21) Ở nhóm ung thư vú tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến 6174delT chiếm 4,5% (8/178) Nhóm bệnh nhân ung thư cả 2 vú thì

tỷ lệ bệnh nhân mang đột biến này lại là rất cao 7,1% độ tuổi dưới 40; 3,3% ở tuổi 40-50; 4,5% ở tuổi trên 50 [12] Trong khi đó nghiên cứu của Antoniou (2003) thì tỷ lệ bệnh nhân người Do Thái mang đột biến 6174delT là 9.4% ở tuổi 40; 10.8% ở tuổi 50; 21.6% ở tuổi 60 và 58.1% ở tuổi 70 [6]

Flora và cs (1998), nghiên cứu 268 phụ nữ Do Thái ung thư vú không liên quan đến tiền sử gia đình Kết quả cho thấy 8/268 (3%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT trên gen BRCA2 [20]

Theo Pak Cheung và cs (1999), nghiên cứu 66 phụ nữ người Do Thái bị ung thư vú và hoặc ung thư buồng trứng Kết quả phát hiện ra 3/66 (4,5%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT trên gen BRCA2 [36]

Ellen và cs (1999), nghiên cứu 412 bệnh nhân người Do Thái bị ung thư vú Kết quả đã phát hiện 15/412 (3,6%) bệnh nhân mang đột biến 6174delT gen BRCA2 Độ tuổi TB của những bệnh nhân này là 46,4 [16]

Foukes và cs ( 2000), bằng việc giải trình tự gen BRCA2 của 118 bệnh nhân ung thư vú người Do Thái Ashkenazi có độ tuổi dưới 65 Kết quả cho thấy có 3/118 (2,5%) cá thể mang đột biến 6174delT trong gen BRCA2 [22]

1.5 Tình hình nghiên cứu gen BRCA1 và BRCA2 ở Việt Nam

Lê Thị Minh Chính và cs (2004), đã tiến hành nghiên cứu đột biến gen BRCA1 và BRCA2 ở 24 bệnh nhân ung thư vú được thu thập ngẫu nhiên tại bệnh viện K Hà Nội Kết quả cho thấy không phát hiện thấy đột biến 185delAG và 6174delT (những đột biến khá phổ biến ở các bệnh nhân ung thư vú trên thế giới) Điều này cho thấy tần suất đột biến 185delAG và 6174delT có thể là rất thấp với dân số Việt Nam bị ung thư vú [2]

1.6 Một số phương pháp xác định đột biên gen BRCA1 và BRCA2

Các phương pháp di truyền phân tử đã được ứng dụng, phát hiện bất

thường gen BRCA1 và BRCA2 như: giải trình tự gen, PCR và RT-PCR

1.6.1 Kỹ thuật giải trình tự gen

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh như phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert) và phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger 1977)

Nguyên lý chung của hai phương pháp là đều tạo ra các đoạn oligonucleotid có chiều dài khác nhau và có xác suất xuất hiện như nhau trong phản ứng Các trình tự này được phân tích bằng điện di trên gel polyacrilamid, kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ máy dò tự động

Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng

dideoxynucleotid (dNTP) Với các máy thế hệ sau này người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên 1 hàng chứ không phải trên 4 hàng như trước đây Đối với phương pháp này, mỗi khi

có một vạch điện di đi qua, phân tử dNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA

sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc và chuyển về máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện

được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích Phương pháp này giúp phát hiện chính xác các đột biến xuất hiện ở gen BRCA1 và BRCA2

Hình 1.5 Hình ảnh minh họa giải trình tự một đoạn DNA

(Nguồn: Sanger cequencing read display.gif)

1.6.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985 Từ

đó đến nay kỹ thuật này được sử dụng rất phổ biến và ứng dụng rất nhiều trong các thí nghiệm về sinh học phân tử

a, Nguyên tắc của phản ứng PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA

polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) với nguyên liệu là 4 loại

deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) Enzym DNA - polymerase xúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn Phản ứng đòi hỏi

sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn

Taq-polymerase là một loại DNA - polymerase (tách chiết từ vi khuẩn

chịu nhiệt Thermus aquaticus), còn mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có

khả năng bắt cặp với một đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành đoạn mới Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng

để làm khuôn cho các phản ứng tiếp theo Sau mỗi chu kỳ, số lượng phân tử DNA tăng gấp đôi, vậy sau n chu kỳ số lượng sản phẩm PCR là 2n, đủ số

lượng để tách ra, giải mã hoặc tách dòng

b, Phương pháp tiến hành:

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mối chu kỳ

gồm 3 bước:

- Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation) Thành phần phản ứng PCR

nói chung gồm những thành phần cơ bản sau: Dung dịch đệm PCR, dNTP,

mồi xuôi và ngược, Taq-polymerase và DNA khuôn Trong giai đoạn này

DNA được biến

tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 940

C-950C với thời gian 30-60 giây

- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ lúc này phải hạ thấp để các

mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này trong khoảng 40-700C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và được kéo dài 30-60 giây

- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng lên

720C để các enzym polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian tuỳ thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 phút đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối của sản phẩm PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận 5' của 2 đoạn gen mồi

Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5-3%, chạy cùng với marker để so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm

Hình 1.6 Các bước cơ bản của phản ứng PCR

(Nguồn: Vierrstraete, 1999)

c, Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng để phát hiện đột biến gen BRCA

* PCR đơn mồi (monoplex PCR): Đây là kỹ thuật PCR kinh điển nhất Mỗi

phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào Sau khi khuếch đại đoạn DNA cần quan tâm, sử dụng enzyme cắt để xác định đột biến điểm xảy ra trên gen BRCA1 hoặc BRCA2 Nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR đơn mồi này

để phát hiện 3 đột biến thông thường 185delAG, 5382insC trên gen BRCA1

và 6174delT trên gen BRCA2 ở bệnh nhân ung thư vú

Năm 1997 Dvora và cs đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR đơn mồi

để phát hiện đột biến 185delAG gen BRCA1 và 6174delT gen BRCA2 Sản

phẩm PCR được cắt lần lượt bởi enzym HinfI, BbrPI tương ứng với 2 gen

trên Nếu là alen bình thường sẽ có một vị trí đặc hiệu cho enzyme cắt, còn

30 - 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3

alen đột biến không có vị trí đặc hiệu cho enzyme cắt, nghĩa là độ lớn của alen bình thường và alen đột biến chênh nhau khoảng 20 bp sau khi sử dụng enzyme cắt Qua điện di gel agarose 3% ta có thể dễ dàng phát hiện các alen đột biến [12]

a b

Hình 1.7 Điện di đồ phát hiện ĐB 6174delT và 185delAG (Dvora 1997)

a, Phân tích giới hạn (BbrPI) của đột biến 6174delT; b, Phân tích giới hạn (HinfI) của đột biến 185delAG; H: Dị hợp tử; N: bình thường; u: Không cắt Năm 2004 Lilian Jara và cs cũng sử dụng enzyme cắt HinfI và DdeI để

phát hiện đột biến 185delAG gen BRCA1 và 5382insC gen BRCA2 của 63 gia đình người Chi Lê Sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose 3%, so sánh với chỉ thị DNA để phát hiện alen đột biến [28]

*PCR đa mồi (multiplex PCR): PCR đa mồi là phương pháp PCR sử dụng

đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA hoặc trên các phân tử DNA khác nhau [36,37]

Bằng phương pháp PCR đa mồi được mô tả trên, Pavin và cs (2006) đã

sử dụng phương pháp này để phát hiện đồng thời 3 đột biến thông thường

185delAG, 5382insC và 6174delT ở 400 bệnh nhân ung thư vú thời kỳ đầu

người Iran Kết quả thể hiện trên hình 1.10

Hình 1.8 Phản ứng PCR đa mồi phát hiện các đột biến 185delAG,

5382insC và 6174delT [37]

1 Marker 6 Đột biến 6174delT

2 Dạng hoang dại 7 Đột biến 185delAG và 5382insC

3 Dạng hoang dại 8 Đột biến 185delAG và 6174delT

4 Đột biến 185delAG 9 Đột biến 5382insC và 6174delT

CÁC BƯỚC TRONG QUY TRÌNH CHUẨN CỦA KÝ THUẬT PCR ĐA THÀNH PHẦN

Bước 1: Chọn chuỗi mồi

- GC = 30%

- Kích thước 20 bp hoặc dài hơn

- Sản phẩm khuếch đại được điện di riêng rẽ

trên gel

Bước 2: Thử nghiệm/ghép đôi

các cặp mồi

- mồi xuôi với mồi ngược

- Chạy chương trình Blast để kiểm tra lại

- Chỉ điều chỉnh điều kiện của chu kỳ

Bước 4: PCR đa thành phần:

Trộn các mồi với tỷ lệ tương đương

- 0,1-0,4 µM với mỗi mồi

- Sử dụng chương trình PCR từ bước 3

- Chỉ điều chỉnh điều kiện của chu kỳ

Bước 5 A Nếu các băng xuất hiện mờ thì:

a, Tăng thời gian bắt cặp

b, Giảm nhiệt độ xuống còn 62-68oC

c, Giảm nhiệt độ thực hiện phản ứng thành từng

bước nhỏ (2oC)

d, Điều chỉnh nồng độ Taq-polymerase

e, Kết hợp Aa, Ab, Ac và Ad

Bước 5 B Nếu các băng ngắn mờ

a, Tăng nồng độ Buffer từ 1x lên1,4 hoặc

2x

b, Giảm nhiệt độ thực hiện quy trình

và/hoặc nhiệt độ kéo dài

c, Tăng nồng độ mồi đối với các vị trí

mờ

d, Kết hợp Ba, Bb, Bc

Bước 5 C Nếu các băng dài mờ thì:

a, Tăng thời gian kéo dài

b, Tăng nhiệt độ thực hiện quy trình và/hoặc nhiệt độ kéo dài

c, Tăng nồng độ mồi đối với các vị trí mờ

d, Giảm nồng độ Buffer xuống còn 0,7-0,8x, nhưng giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5- 2mM

e, Kết hợp Ca, Cb, Cc, Cd

Bước 5 D Nếu xuất hiện băng không đặc hiệu

a, Với băng dài: tăng nồng độ Buffer lên 1,4-2x

b, Với băng ngắn: Giảm nồng độ Buffer xuống còn 0,9x

0,7-c, Tăng dần nhiệt độ thực hiện quy trình

d, Giảm nồng độ DNA và enzyme

e, Tăng nồng độ MgCl2 lên 3, 6, 9 và 12 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP ở mức 200 µM đối với mỗi băng

f, Kết hợp Da, Db, Dc, Dd, De

Bước 5 E Không có các trường hợp trên thì:

a, Sử dụng các thành phần khác: BSA 0,1-0,8 µg/µl

b, Sử dụng các thành phần khác 5% (v/v) DMSO hoặc glycerol

c, Kiểm tra lại mối tương quan giữa các mồi

d, Thay đổi tất cả các phương pháp và sử dụng nồng độ dNTP mới

5 Đột biến 5382insC 10 Đột biến 185delAG, 5382insC và 6174delT Theo tác giả, nếu mỗi bệnh nhân có 1 alen đột biến sẽ xuất hiện 2 băng trên bản gel điện di Như vậy tối đa một người có thể nhận được 6 băng trên bản gel điện di nếu mỗi đột biến chỉ xuất hiện ở 1 alen và người đó mang đồng thời 3 đột biến 185delAG, 5382insC và 6174delT [37]

1.6.3 Phương pháp Real-Time PCR

Ngoài 2 phương pháp như giải trình tự gen và PCR, hiện nay nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp Real-Time PCR để phát hiện các đột biến gen BRCA1 và BRCA2 Trong kỹ thuật PCR sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn DNA đích, phải điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để kiểm tra xem có vạch sản phẩm khuếch đại đúng kích thước hay không? Còn Real-time PCR

là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi

chu kỳ nhiệt của phản ứng Do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm

không cần phải làm tiếp các bước thí nghiệm khác để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không Như vậy có thể nói Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được [45] Tuy vậy, kỹ thuật này đòi hỏi phải có một hệ thống thiết bị máy móc hiện đại,

độ tin cậy cao thì kết quả mới chính xác

Scort và cs (2006), Mitrofanov và cs (2008), sử dụng phương pháp Time PCR để phát hiện các đột biến 185delAG; 5382insC trên gen BRCA1 và 6174delT gen BRCA2 ở người Ashkenazi [45,32]

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu gồm 150 bệnh nhân nữ ung thư vú được chẩn

đoán và điều trị tại Bệnh viện K Các trường hợp này được lựa chọn một cách ngẫu nhiên từ tháng 3/2007 - 3/2009 Bệnh nhân được lấy mẫu DNA để xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2

2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT NGHIÊN CỨU 2.2.1 Dụng cụ

Các dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (hấp ướt ở 120oC trong 20 -

30 phút, sau đó sấy khô ở 36oC) Như eppendorf 1,5ml; ống Falcol 1,0 ml,

đầu côn 2.2.2 Trang thiết bị

Đề tài đã sử dụng các trang thiết bị tại Trung tâm nghiên cứu Protein, Trường Đại học Y Hà Nội và các trang thiết bị của phòng Công Nghệ Gen Động Vật, Viện Công Nghệ Sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công

Gen-nghệ Việt Nam

Bảng 2.1 Các thiết bị phân tích và thí nghiệm đã sử dụng

10 Máy PCR Mastecycler Personal Eppendorf Đức

11 Máy soi DNA Mini-Trasnilluminator UVP Mỹ

12 Hệ thống điện di ngang Apolo

13 Máy đọc trình tự DNA 3100-Avant

Mỹ

2.2.3 Hoá chất

Tất cả các hoá chất được dùng trong thí nghiệm của luận án đều là sản

phẩm của các công ty sản xuất hoá chất nổi tiếng trên thế giới, có độ tin cậy

cao Bảng 2.2 Danh mục các hoá chất và dung dịch đã sử dụng

1 Lysis buffer (10 mM Tris/HCl pH 8.0;

10 mM EDTA pH8.0; 0.1M NaCl; 2.1% SDS) Tự pha

3 Phenol Chlorofom Isoamyl (tỷ lệ 25:24:1) Pharmacia

5 Ethanol 100% và ethanol 70%;

6 dNTP, , chỉ thị DNA 100 bp, ethydiumbromide Fermentas

8 TBE 10x (1M Tris/HCl pH 8.0; 830 mM acid boric;

9 Đệm TE(10 mM Tris/HCl pH8.0; 1mM EDTA pH 8.0) Tự pha

10 Dung dịch đệm tra mẫu 6x (Brommophenol blue 0.09%;

xylene xyanol (FF) 0.09%; glycerol 60%) Fermentas

11 Môi trường LB lỏng (1% Triptone; 0,5% Yeast Extract;

12 Môi trường LB đặc (1% Triptone; 0,5% Yeast Extract; Merk

15 Dung dịch II (0,2 mM NaOH; 1% SDS Fluka

16 Dung dịch III (3 mM CH3COOK;

20 Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn DNA-185delAG Bio Neer

21 Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn DNA-5382insC Bio Neer

22 Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn DNA-6174delT Invitrogen

*Trình tự mồi 185delAG và 5382insC được công bố bởi Parvin và cs năm 2006 [92]

*Trình tự mồi 6174delT được công bố bởi Dvora và cs 1997 [ 37]

Trình tự và kích thước đoạn DNA - 185delAG

335 bp cho alen bình thường và 354 bp cho alen đột biến

GGTTGGCAGCAATATGTGAA AAAATTCAGAATTTATGTTGTCTAATTACAAAAAGCAA CTTCTAGAATCTTTAAAAATAAAGGACGTTGTCATTAGTTCTTTGGTTTGTATTATTCTA AAACCTTCCAAATCTTAAATTTACTTTATTTTAAAATGATAAAATGAAGTTGTCATTTT ATAAACCTTTTAAAAAGATATATATATATGTTTTTCTAATGTGTTAAAGTTCATTGGAA CAGAAAGAAATGGATTTATCTGCTCTTCGCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCATTAATG CTATGCAGAAAATCTTAGAG TGTCCCATCTGGTAAGT CAGCACAAGAGTGTATTAAtttaa

a

Trình tự và kích thước đoạn DNA - 5382insC

271 bp cho alen bình thường và 294 bp cho alen đột biến

AATGGAAGAAACCACCAA GGTCC AAAGCGAGCAAGAGAATC CCAGGACAGAAAGGT AAAGCTCCCTCCCTCAAGTTGACAAAAATCTCACCCCACCACTCTGTATTCCACTCCCC TTTGCAGAGATGGGCCGCTTCATTTTGTAAGACTTATTACATACATACACAGTGCTAGA TACTTTCACACAGGTTCTTTTTTCACTCTTCCATCCCAACCACATAAATAAGTATTGTCT CTACTTTATGAATGATAAAACTAAGAGATTTAGAGAGG CTGTGTAATTTGGATTCCCG

TC

Trình tự và kích thước đoạn DNA - 6174delT

148 bp cho alen bình thường và 147 bp cho alen đột biến

TGGGATTTTTAGCACAGC ACGTGGAAAATCTGTCCAGGTATCAGATGCTTCATTACAA AACGCAAGACAAGTGTTTTCTGAAATAGAAGATAGTACCAAGCAAGTCTTTTCCAAAG TATTGTTTAAAA GTAACGAACATTCAGACCAG

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Các bệnh nhân ung thư vú đều là ung thư biểu mô

- Chưa có can thiệp gì ở tuyến trước

- Không mắc các bệnh ung thư khác trước đây

2.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Các bệnh nhân không đáp ứng đủ các tiêu chuẩn trên

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRCA1 VÀ BRCA2 2.4.1 Quy trình lấy mẫu

Mỗi bệnh nhân được lấy một mẫu mô từ các mô ung thư vú Một phần mẫu được đưa lên Khoa Giải phẫu bệnh-Tế bào để xác định độ mô học và loại

mô học, đánh dấu số hiệu tiêu bản và ghi lại thông tin bệnh nhân, một phần mẫu được ngâm trong cồn 70o, bảo quản ở -70oC để tách DNA

2.4.2 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA của 150 mẫu bệnh phẩm ung thư vú Phương pháp tách chiết DNA hệ gen được tiến hành theo Ausubel và cs (1995) có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi Toàn bộ qui trình tách chiết DNA từ mô ung thư được tiến hành như sau:

- Cắt một mẩu mô khoảng 100 mg, thấm khô cồn, nghiền nhỏ bằng cối chày

sứ Thêm vào 600 µl dung dịch đệm phá tế bào và nghiền tiếp cho đến khi thành dạng bột mịn

- Thêm 4 µl ProteaseK (20 mg/ml), lắc nhẹ cho đều ủ ở 56oC qua đêm (khoảng 16 giờ) để phá màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA

- Thêm 400 µl Phenol Chlorofom Isoamyl (tỷ lệ 25:24:1) đảo nhẹ cho đều Sau đó ly tâm 8000 rpm, ở 4oC, trong 10 phút Mẫu sẽ tách thành 3 pha: Pha trên cùng là DNA, pha giữa là protein không có khả năng hoà tan, pha dưới là Phenol: Chlorofom: Isoamyl Hút lấy dịch trong chuyển sang 1 ống eppendorf mới

- Thêm 400 µl Chlorofom: Isoamyl (tỷ lệ 24:1), đảo nhẹ cho đều Sau đó ly tâm 8000 rpm, ở 4oC, trong 10 phút, thu lấy dịch trong

- Để đảm bảo độ tinh sạch của mẫu DNA, tiếp tục thêm 250 µl Chlorofom Isoamyl (tỷ lệ 24:1) Ly tâm 8000 rpm, ở 4oC, trong 10 phút, thu lấy dịch trong

- Thêm 1000 µl cồn tuyệt đối, để tủ lạnh -30oC trong 3 - 4 giờ, để tủa DNA

Ly tâm 12000 rpm, ở 4oC, trong 20 phút Đổ phần dịch trong đi, thu tủa DNA

- Thêm 1000 µl cồn 70o để rửa sạch DNA Ly tâm 12000 rpm, ở 4oC, trong 20 phút Đổ phần dịch trong đi, thu tủa DNA

- Để khô DNA và bay hết cồn

- Hoà tan DNA trong 50µl TE Bảo quản DNA ở 4 C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.4.3 Xác định nồng độ, độ sạch DNA bằng phương pháp quang phổ kế

Sau khi thu nhận DNA, tiến hành xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp quang phổ kế

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng

tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pirimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD260 nm tương đương với nồng độ 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi; 40 µg/ml cho dung dịch RNA hay DNA sợi đơn

Như vậy giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA trong mẫu và và được tính theo công thức:

C DNA (µl/ml) = OD 260nm x 50 x độ pha loãng

Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, đo thêm giá trị OD

ở 280 nm, đây là bước sóng mà các protein có mức hấp thụ cao nhất Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các DNA và do

đó làm sai lệch giá trị nồng độ thật của nồng độ DNA Một dung dịch DNA được xem là sạch, không tạp nhiễm protein khi tỷ số OD260/OD280 nằm trong

khoảng 1,8-2,0

Cách tiến hành đo mật độ quang DNA: Hút 2 µl nước khử vô trùng

vào một cuvette làm đối chứng Sau đó lấy 2 µl DNA để đo OD ở bước sóng

260 nm và 280 nm Ghi lại các giá trị OD của các mẫu DNA được kiểm tra, từ các giá trị OD thu được ở hai bước sóng, có thể tính được nồng độ và độ tinh sạch của DNA theo công thức trên

2.4.4 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose

Để kiểm tra chất lượng DNA tách chiết được, sản phẩm PCR khi khuếch đại 2 gen BRCA1 và BRCA2 và sản phẩm cắt enzyme giới hạn của sản phẩm PCR, sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc của phương pháp điện di này là dựa vào đặc tính của cấu trúc axit nucleic mang điện tích Đây là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường (DNA

di chuyển từ cực âm sang cực dương) Các phân tử DNA khác nhau về kích thước đồng thời khác nhau về điện tích nên chúng di chuyển cũng với tốc độ khác nhau, do đó có thể phân biệt được trên gel agarose Mặt khác DNA trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của DNA và dưới tác dụng của tia

tử ngoại có bước sóng 300 nm sẽ phát huỳnh quang và hiện hình dưới dạng những vạch đỏ màu cam Việc chọn lựa nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích thước trung bình của DNA cần phân tích Mối tương quan giữa nồng độ agarose cần

sử dụng để phân tích các trình tự có kích thước xác định là khác nhau

Bảng 2.4 Tương quan giữa nồng độ agarose

và kích thước đoạn DNA cần phân tích

Nồng độ gel agarose (%) Kích thước đoạn DNA (bp)

Quy trình điện di:

- Chuẩn bị gel agarose 1% hoặc 1,5 % hoặc 3%:

+ Cân 1,0 gram hoặc 1,5 gram hoặc 3,0 gram agarose cho vào bình chứa 100

ml dung dịch đệm TBE 1x

+ Đưa vào lò vi sóng đun cho tan hoàn toàn (khoảng 1 - 1,5 phút) Hạn chế bay hơi nước bằng cách bịt kín miệng bình bằng giấy bạc để tránh tăng nồng

độ agarose Nếu quá trình đun mất quá nhiều nước thì phải bổ sung cho đủ

100 ml

+ Lấy ra, bổ sung khoảng 10 µl ethydium bromid, lắc đều, để nguội khoảng 50-60oC, đổ dung dịch vào khay điện di đã cài lược sẵn để tạo giếng Độ dày của gel 5 mm, sau 30 phút gel đông cứng hoàn toàn, rút lược ra Đưa bản gel vào bể điện di, sao cho dung dịch đệm TBE ngập các giếng trên gel, tra mẫu DNA vào giếng điện di

- Tra mẫu đã được trộn với dung dịch đệm tỷ lệ v/v là 5/1 vào các giếng của bản gel agarose Cụ thể như sau:

+ 5 µl DNA tổng số trộn đều cùng với 1 µl dung dịch đệm tra mẫu

+ 10 µl sản phẩm PCR trộn đều cùng với 2 µl dung dịch đệm tra mẫu

+ 20 µl sản phẩm cắt enzyme giới hạn của sản phẩm PCR trộn đều cùng với 4

µl dung dịch đệm tra mẫu

- Chạy điện di cùng marker 100 bp để ước lượng kích thước phân tử

- Chế độ chạy điện di:

+ DNA tổng số được kiểm tra trên gel agarose 1%, ở U = 110V, trong thời gian 30 phút

+ Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%, ở U = 110V, trong thời gian 30 phút

+ Sản phẩm cắt enzyme giới hạn của sản phẩm PCR, được kiểm tra trên gel agarose 3%, ở U = 90V trong thời gian 15 phút, sau đó điện di tiếp ở U = 110V, trong thời gian 40 phút

- Lấy bản gel ra, đưa lên máy soi để quan sát và chụp ảnh bản gel

2.4.5 Quy trình xác định đột biến 185delAG

2.4.5.1 Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA-185delAG với mồi P1, P2, P3

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng PCR đa mồi

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân đoạn DNA-185delAG

Giai đoạn Các bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian

Khởi động Biến tính 95 5 phút

95

58 Tổng hợp

Biến tính Bắt cặp Tổng hợp 72

2.4.5.2 Xác định đột biến 185delAG

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, lấy 10 µl sản phẩm ở mỗi mẫu nghiên

cứu, chạy điện di cùng với mẫu chứng dương và marker DNA 100 bp Các

băng DNA sẽ hiện hình dưới dạng những vạch đỏ màu da cam trên bản gel

điện di So sánh kích thước ước đoán của mẫu nghiên cứu với mẫu chứng

dương và marker phân tử để xác định đột biến 185delAG

2.4.6 Quy trình xác định đột biến 5382insC trên gen BRCA1

2.4.6.1 Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA-5382insC với các mồi P4, P5,

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đa mồi

Giai đoạn Các bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian

Khởi động Biến tính 95 5 phút

94

57 Tổng hợp

Biến tính Bắt cặp Tổng hợp 72

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, lấy 10 µl sản phẩm của mỗi mẫu

nghiên cứu, điện di cùng với mẫu chứng dương và marker 100 bp So sánh

đối chiếu mẫu nghiên cứu với mẫu chứng dương và marker phân tử để xác

định đột biến 5382insC qua sự hiện hình của các băng DNA trên bản gel điện

di

2.4.7 Quy trình xác định đột biến 6174delT trên gen BRCA2

2.4.7.1 Kỹ thuật PCR đơn mồi nhân đoạn DNA với cặp mồi 6174

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn DNA-6174delT

Chú ý : Thành phần phản ứng được trộn đều bằng máy votex và được

spindown cho mẫu không bám lên thành ống nghiệm, sau đó đặt ngay vào

máy PCR để tránh sự biến tính của DNA

Bảng 2.10 Chu trình nhiệt của phản ứng nhân đoạn DNA-6174delT

Giai đoạn Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian

Khởi động Biến tính 94 5 phút

94

55 Tổng hợp

Biến tính Bắt cặp Tổng hợp 72

30 giây

30 giây

30 giây Lặp lại 40 chu kỳ Kết thúc Kết thúc 72 10 phút

2.4.7.2 Xác định đột biến 6174delT bằng enzyme cắt BbrPI, Fermentas

Enzyme BbrPI sẽ cắt đoạn DNA - 6174delT tại vị trí 5' CACÈGTG 3'

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng cắt của enzyme BbrPI ở gen BRCA2

Sản phẩm PCR được nhân lên bằng cặp mồi 6174delT sẽ có kích thước

148 bp cho alen bình thường hoặc 147 bp cho alen đột biến

Enzyme BbrPI sẽ cắt đoạn DNA - 6174delT của alen bình thường

thành 2 đoạn 127 bp và 21 bp Còn alen đột biến không có điểm cắt của

Trộn đều các thành phần của phản ứng cắt và để ở 37oC qua đêm Sau

đó kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 3% cùng với sản phẩm PCR không

cắt và marker DNA 100 bp để phát hiện đột biến 6174delT

2.4.8 Kỹ thuật thôi gel (sử dụng kit của hãng Invitrogen, Mỹ)

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, lấy 30 µl sản phẩm PCR tra vào giếng điện di agarose 3%, kích thước ước đoán của băng DNA trên bản gel điện di

đã được xác định

Dùng dao nhỏ cắt băng DNA đó ra khỏi bản gel điện di, đưa vào ống eppendorf 1,5 ml (băng DNA được cắt ra phải gọn, không lẫn các băng DNA khác bên cạnh)

- Với gel >2%: Lấy 400 mg mẫu, cho thêm 5ml dung dịch Buffer Solubilization (dung dịch L3), lắc đều ở nhiệt độ 50oC, thời gian 10 phút Sau

đó để thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng cho mẫu tan hoàn toàn

- Hút hết dịch cho qua cột tinh sạch

- Ly tâm 12000 rpm, ở 4oC, thời gian 1 phút, bỏ phần dịch chảy xuống ống thu nhận

- Thêm 700 µl dung dịch rửa Buffer ethanol (dung dịch W1) vào cột Ly tâm

14000 rpm, ở 4oC, thời gian 3 phút, loại bỏ phần dịch

- Chuyển cột sang ống eppendorf mới

- Thêm 20 µl Elution Buffer - dung dịch E5 (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) Ly tâm lạnh 14000 rpm, ở 4oC, trong 1 phút, để thôi DNA ra khỏi cột Loại bỏ cột và cất giữ mẫu DNA đã được tinh sạch ở -20oC

- Sản phẩm thôi gel sau khi tinh sạch được điện di kiểm tra lại trên gel agarose 0,8% trước khi sử dụng cho phản ứng đọc trình tự gen trực tiếp hoặc

để tách dòng gen

2.4.9 Kỹ thuật nhân dòng gen (cloning)

Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di agarose 3% và xác định

có đột biến 5382insC ở gen BRCA1 hoặc sản phẩm PCR không có đột biến của 2 cặp mồi 185delAG trên gen BRCA1 và 6174delT trên gen BRCA2 được đưa vào vector tách dòng pJET1.2 đầu bằng Sau đó DNA tái tổ hợp

được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli để chọn lọc và tạo dòng

2.4.9.1 Tạo vector tái tổ hợp

Sản phẩm PCR được trộn lẫn với vector pJET1.2, dưới tác dụng của enzyme T4-DNA ligase ở 22oC trong 30 phút để tạo vector tái tổ hợp

Hình 2.2 : Bản đồ vector tách dòng pJET1.2

Hình 2.3: Cấu trúc phân tử của vector tách dòng pJET1.2

Bảng 2.12 Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector pJET1.2

2 Ligation Master Mix 2x 5,0

3 DNA pJET1.2 cloning vector 1,0

Tổng số 10,0

Sản phẩm PCR có đầu 3’-dA được tạo ra do Taq DNA polymerase sẽ

được xử lý với enzyme Thermostable DNA blunting trước khi lai vào vector

tách dòng pJET1.2 Khi vector pJET 1.2 đầu bằng tự đóng vòng, gen lathal

trên vector sẽ được biểu hiện, gây chết tế bào Và khi đoạn gen cần tách dòng

được chèn vào vector sẽ làm bất hoạt gen lethal này Vì vậy, chỉ những khuẩn

lạc mang vector tái tổ hợp mới mọc được trên đĩa thạch

2.4.9.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt

Tế bào khả biến được lấy ra trong tủ -70oC được đặt ngay trên đá lạnh

khoảng 10 phút để làm tan dần Lấy 2µl sản phẩm DNA-tái tổ hợp cho vào 50

µl tế bào khả biến, đảo nhẹ trộn đều Đặt hỗn hợp mẫu trong đá lạnh 10 phút

Để biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào, mẫu được làm nóng ở 42oC

trong 45 giây Mẫu được lấy ra và đặt vào đá lạnh trong 10 phút Bổ sung 200

µl môi trường SOC và lắc mẫu 200 rpm ở 37oC trong 45 - 60 phút

Hút 200 µl mẫu trải lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin

và ủ đĩa ở 37oC qua đêm

2.4.9.3 Kiểm tra hiệu quả nhân dòng bằng PCR

Để kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen cần nhân dòng, tiến hành phản

ứng PCR với các cặp mồi tương ứng: 185delAG, 5382insC, 6174delT

2.4.9.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp

Chọn khuẩn lạc trắng để cấy chuyển sang 3ml môi trường LB lỏng có

bổ sung 100 µl/ml Ampicillin, nuôi qua đêm ở 37oC, lắc 200 rpm

Hút 2 µl dịch nuôi cấy vào ống 2 ml Thu cặn tế bào bằng ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút ở 4oC Hoà tan tế bào bằng 100 ml dung dịch I bằng cách lắc mạnh trên máy vortex Từ bước này mẫu nên được thao tác trong điều kiện lạnh

Bổ sung 200 µl dung dịch II vào mẫu và đảo nhẹ trộn đều mẫu, đặt vào

đá lạnh 10 phút Dung dịch trở nên trong suốt và quánh Tiếp tục thêm 150 µl dung dịch III, đảo nhẹ, ủ trong đá lạnh 15 phút Tủa protein xuất hiện và có màu trắng đục