nghiên cứu phát hiện đột biến gen atp7b gây bệnh wilson

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khóa 2008 - 2012 Người hướng dẫn: TS. TRẦN VÂN KHÁNH Hà Nội - 2012 1 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng tận tình của các thầy, các cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Vân Khánh – Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa Kỹ thuật Y học – Trường Đại học Y Hà Nội, người cô đã hết lòng dạy bảo, tận tình hướng dẫn em những bước đầu tiên trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Tạ Thành Văn, PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, những người thầy người cô đã giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại Học Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện khóa luận này. Em xin cảm ơn Ths. Hồ Cẩm Tú cùng các anh chị cán bộ, anh chị Nghiên cứu sinh tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em khi thực hiện và hoàn thành khóa luận. Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, con thực sự biết ơn bố mẹ, mọi người thân yêu trong gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để con vượt qua khó khăn trong học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đại học Y Hà Nội. Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2012 Vũ Văn Thành 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A: Adenine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine NCBI: National Center for Biotechnology Information Ala: alanine (A) Gly: glycine (G) Pro: proline (P) Arg: arginine (R ) His: Histidine (H) Ser: serine (S) Asn: asparagine (N) Ile: isoleucine (I) Stop: mã kết thúc Asp:acid aspartic (D) Leu: leucine (L) Thr: threonine (T) Cys: cysteine (C) Lys: lysine (K) Trp: tryptophan (W) Gln: glutamine (Q) Met: methionine (M) Tyr: tyrorine (Y) Glu: acid glutamic (E) Phe: phenylalanine (F) Val: valine (V) Bn : Bệnh nhân Bp : Basepair Kb: Kilobase ATP7B : ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Wilson hay bệnh rối loạn chuyển hóa đồng (Cu), bệnh được mô tả đầu tiên bởi Kinnier Wilson vào năm 1912, là một bệnh lý liên quan đến tổn thương gen. Wilson là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể ( NST) thường, trong đó, đồng tích tụ ở một số cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan và não gây nhiều biến chứng phức tạp. Ước tính trên thế giới, tần suất mắc bệnh là 1/30.000 và 1/100.000 người [9]. Bệnh Wilson do thiếu hụt enzyme typ P- ATPase được mã hóa bởi gen ATP7B. Gen ATP7B nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể 13 (13q14.3) gồm 21 exon, với chiều dài khoảng 80 kb và mã hóa cho chuỗi protein gồm 1465 axit amin. Enzym P-type ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế bào. Sự thiếu hụt hoặc giảm chức năng protein của ATP7B dẫn đến giảm sự bài tiết Cu từ gan vào mật, khiến cho Cu tích lũy trong gan và tạo thành chất độc cho gan. Khi lượng đồng trong gan tăng quá mức, đồng sẽ theo hệ thống tuần hoàn tới các cơ quan đích như : não, mắt, thận gây ra các tổn thương cho cơ quan đích. Chẩn đoán bệnh có thể dựa trên các triệu chứng lâm sàng như dấu hiệu về gan, não và vòng Kayser-Fleischer. Ngoài ra, có thể sử dụng các xét nghiệm như đo nồng độ đồng trong nước tiểu 24h, hàm lượng ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ Cu trong gan tăng) [35, 12]. Tuy vậy, nếu chỉ dựa các xét nghiệm hóa sinh thì rất khó để chẩn đoán chính xác cũng như khó có thể phân biệt giữa người bình thường và người mang gen. Vì vậy, phân tích DNA là một bước cần thiết để xác định người mắc bệnh [35]. Cho đến nay, khoảng hơn 500 đột biến đã được tìm thấy trên bệnh nhân mắc bệnh Wilson [44]. Tuy nhiên, mỗi quốc gia cũng như mỗi chủng tộc người khác nhau có các loại đột biến khác nhau . Đột biến p.His1069Glu là đột biến thường gặp nhất trong quần thể nguời da trắng chiếm khoảng 37% 4 đến 63% tổng số đột biến. Trong khi đó, ở các bệnh nhân người Trung Quốc đột biến p.Arg778Leu lại chiếm tới 34-38% tống số đột biến [9] Từ những ý nghĩa trên đề tài : “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson” được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson. 5 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON 1.1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh Wilson trên thế giới Vào năm 1883, một nhà thần kinh học người Đức Dr. Carl Westphal có một báo cáo và đặt tên bệnh này là "pseudosclerosis".Nhà thần kinh học người Anh tên là William Gowers(1888) và bác sĩ Adolph Strumpell mô tả bệnh "pseudosclerosis" là bệnh xơ gan[26]. Bệnh mang tên của bác sĩ người Anh Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937) một nhà thần kinh học , ông đã lần đầu tiên mô tả những thay đổi bệnh lý trong gan và não vào năm 1912, sau đó Strpell nhận thấy sự tích lũy sớm của đồng trong não và gan của các bệnh nhân này[36]. Năm 1948, Martins tìm thấy lượng đồng trong nước tiểu của bệnh nhân Wilson tăng rất cao so với người bình thường [30]. Cùng năm đó, Cumings cùng nhóm nghiên cứu đã điều trị hiệu quả bệnh Wilson lần đầu tiên với việc tiêm British anti- Lewisite ( BAL) vào năm 1951[14]. Năm 1952, Scheinberg và Gitlin phát hiện được enzym ferroxidase trong huyết thanh gắn với đồng, được gọi là ceruloplasmin. Hoạt tính của enzym này giảm trong huyết tương ở các bệnh nhân Wilson [25]. Bắt đầu năm 1956, một số thuốc được đưa vào điều trị. Nhà thần kinh học người Anh John Walshe đã phát hiện ra penicillamine [41]. Vào năm 1982, Walshe cũng giới thiệu trentine và người đầu tiên phát hiện tetrathiomolybdate sử dụng cho lâm sàng [42]. Bác sĩ Schouwin và Hoogemraad sử dụng kẽm acetate trong điều trị lần đầu tiên vào năm 1961,sau đó kẽm acetate được Brewer và các đồng nghiệp tại đại học Michigan dùng để điều trị cho bệnh nhân Wilson một cách phổ biến[10]. Cơ sở di truyền của bệnh Wilson và liên kết ATP7B đột biến đã được làm sáng tỏ trong những năm 1980 và 1990 bởi một số nhóm nghiên cứu[38]. 6 Tới năm 1994, Konstaintin petrukhin cùng nhóm nghiên cứu tại đại học Columbia đã đưa ra bản đồ gen, cấu trúc và chức năng của gen ATP7B[34]. Danadevi Kuppala cùng các đồng nghiệp đã phát hiện năm đột biến trên gen ATP7B của các bệnh nhân Mỹ năm 2009, báo cáo cho thấy đột biến trên exon 14 và exon 18 chiếm tới 84% tổng số đột biến và họ cũng chỉ ra rằng đột biến H1069Q là đột biến phổ biến nhất được tìm thấy[16] Các nhà nghiên cứu Thái Lan cũng đưa ra một báo cáo về việc phát hiện đột biến trên gen ATP7B một năm sau đó[37]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Xin- Hua Li, Yui Lu, Qing- Chun Fu đã phát hiện thêm 14 đột biến mới trong các bệnh nhân người Trung Quốc[44]. 1.1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở Việt Nam Lần đầu tiên vào năm 1969, Bùi Quốc Hương và cộng sự đã báo cáo 8 trường hợp bệnh Wilson tại hội nghị Thần kinh học quốc tế lần thứ IX tại Mỹ [1]. Sau đó vào những năm 2002-2005, Thái Duy Thành và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 29 trường hợp bệnh nhân Wilson ở khoa Thần kinh - bệnh viện Bạch Mai [8]. Tiếp theo Quách Nguyễn Thu Thủy và cộng sự công bố nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn 2001 - 2006 [5] Vào năm 2010, Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Phương Mai, W. Yoo cùng nhóm nghiên cứu đã phát hiện 4 loại đột biến điểm trên gen ATP7B bằng phương pháp phân tích đột biến tại bệnh viện nhi trung ương[6]. Năm 2011, Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein trường ĐH Y Hà Nội tiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson[7]. Nhìn chung tình hình nghiên cứu bệnh Wilson ở nước ta còn chưa nhiều. Mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng[2,3,4]. 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH WILON 2.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson 7 Bệnh Wilson có nhiều biểu hiện lâm sàng phức tạp, theo nghĩa rộng, bệnh nhân Wilson có thể mắc các vấn đề liên quan tới thần kinh, gan, hoặc cả hai. Trong những năm qua những tiến bộ trong việc chẩn đoán đã cho phép đánh giá hệ thống của các cá nhân bị nghi ngờ mắc bệnh Wilson trước khi phát triển các triệu chứng thần kinh. Bệnh nhân bị xơ gan, biểu hiện thần kinh, và vòng Kayser-Fleischer( K-F) được dễ dàng chẩn đoán là mắc bệnh Wilson bởi vì các bệnh nhân này có biểu hiện lâm sàng giống mô tả[30, 35]. Các bệnh nhân bị suy gan, người từ 5-40 tuổi có nồng độ ceruloplasmin trong huyết thanh giảm, xuất hiện vòng Kayser-Fleischer được coi là bệnh Wilson cổ điển[35]. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson được tổng hợp trong bảng sau: Bảng 1.1. Các đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson[35] Đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson Gan • không có triệu chứng gan to • Lách to • Nồng độ AST, ALT trong huyết thanh tăng cao liên tục • Gan nhiễm mỡ • Viêm gan cấp tính • Viêm gan tự miễn • Xơ gan: có bù hoặc mất bù • Suy gan cấp tính Thần kinh • Chảy nước dãi • Đau nửa đầu đau đầu • Mất ngủ • Động kinh Tâm thần • Trầm cảm • Rối loạn hành vi • Tính cách thay đổi • Rối loạn tâm thần 8 Các hệ thống khác • Mắt: vòng Kayser-Fleischer, đục thủy tinh thể hướng dương • Thận bất thường: sỏi thận • Xương bất thường: loãng xương sớm,viêm khớp • Viêm tụy • Kinh nguyệt bất thường, vô sinh, sẩy thai lặp đi lặp lại 1.1.1.1. Bệnh về gan Các loại bệnh về gan có thể là rất khác nhau, từ không có triệu chứng tới bất thường chỉ số hóa sinh trong suy gan cấp[27]. Trẻ em có thể hoàn toàn không có triệu chứng về bệnh gan hoặc một số bệnh nhân lại có triệu chứng lâm sàng giống viêm gan virus. Bệnh Wilson có thể được mô tả như bệnh suy gan kịch phát, rối loạn hệ thống đông máu và tan huyết cùng với xét nghiệm Coomb âm tính, suy thận, và tăng đáng kể nồng độ đồng trong huyết thanh và nước tiểu. Những hình ảnh lâm sàng của bệnh Wilson có thể tương tự như bệnh viêm gan mãn tính, trong đó nhấn mạnh sự cần thiết cần phải sàng lọc bệnh nhân cho bệnh Wilson. Ở những bệnh nhân mắc bệnh gan, các vấn đề về thần kinh( nếu xảy ra) thường xảy ra sau 2-5 năm [9, 25]. Bệnh nhân có biểu hiện xơ gan đặc hiệu như lách to, huyết áp cao và cổ chướng. Tất cả bệnh nhân trẻ bị viêm gan mạn tính không rõ nguyên nhân , có hoặc không có xơ gan, cần được sàng lọc cho bệnh Wilson[28,35]. 1.1.1.2. Những thay đổi về mắt Vòng KF rõ ràng nhất tại vùng ngoại biên của giác mạc, vòng KF xuất hiện do sự lắng đọng đồng bên trong giác mạc trong màng Descemet. Kiểm tra bằng đèn khe dùng để xác định có hay không vòng KF. Vòng KF xuất hiện ở hầu hết bệnh nhân mắc bệnh Wilson, tuy nhiên nó không hoàn toàn là đặc hiệu, bởi vì vòng KF xuất hiện trong một số trường hợp bệnh lý khác như gan mãn tính, ứ mật, xơ gan[9] 9 Hình 1.1. Vòng KF ở vùng ngoại biên giác mạc[24] 1.1.1.3. Triệu chứng về thần kinh Những triệu chứng về thần kinh thường xuất hiện sau dấu hiệu về bệnh gan. Một số dấu hiệu nhỏ có thể xuất hiện ở những bệnh nhân nhỏ tuổi bao gồm các thay đổi trong hành vi, sự suy giảm về việc học hoặc không có khả năng hoạt động cho mỗi hình thức đòi hỏi phối hợp tốt cả tay và mắt, trước khi có các triệu về thần kinh điển hình như run, rối loạn nhận thức, chảy nước dãi[16, 27]. 1.1.1.4. Các dấu hiệu lâm sàng khác Ngoài những bệnh lý về gan, thần kinh, mắt thì những bệnh nhân Wilson còn có thể có những thay đổi bệnh lý về xương : nhuyễn xương, loãng xương, gãy xương tự phát, bệnh còi xương ở người lớn [9,12]. 10 [...]... (p.Thr456Iso) Đột biến dị hợp tử thứ hai cũng được công bố gây bệnh (disease variant, DV) là c.4276T>C làm thay thế Leucine vị trí 1371 thành Proline 3.2.3 Kết quả tỷ lệ đột biến và các dạng đột biến tìm thấy trên gen ATP7B Bảng 3.1 Số lượng các đột biến tìm thấy trên gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson Kết quả n Có đột biến 5 Không có đột biến 0 Tổng số 5 Bảng 3.2 Các dạng đột biến tìm thấy trên gen ATP7B ở bệnh. .. tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thên nucleotid trên gen Do phần lớn các đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson là đột biến điểm như trên đã trình bày nên cho đến nay phương pháp giải trình tự gen ATP7B vẫn được coi là một tiêu chuẩn vàng để phát hiện các đột biến của gen gây bệnh 23 Hình 1.7 Quy trình giải trình tự theo... 1.5 Cấu trúc của gen ATP7B[ 15] 1.3.2 Liên hệ giữa đột biến gen ATP7B và chức năng của protein Theo các báo cáo nghiên cứu thì hiện nay có khoảng hơn 500 đột biến được tìm trên bệnh nhân mắc bệnh Wilson, bao gồm các đột biến thay thế, mất đoạn, thêm hoặc bớt nucleotid gây lệch khung dịch mã protein [44] Trong đó, đột biến dạng thay thế nucleotit chiếm khoảng 79.5% các dạng đột biến gây bệnh( Hình 1.6)... dạng đột biến gen ATP7B của các bệnh nhân nghiên cứu 31 3.2.1.1 Đột biến ở bệnh nhân mã số 01, 02, 03 Đột biến c.40_41insCGCCG (đột biến mới) c.40_41insCGC CG Bệnh nhân mã số 01 c.40G Người bình thường Đột biến missense: p.Val456Leu (NDV : non disease variant) c 1523G >C c.1523G p.Val456Leu p.Val456 Bệnh nhân mã số 01 Người bình thường Hình 3.2 Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh. .. trong các bệnh nhân Wilson người Mỹ( chiếm tới 40.3 % tổng số đột biến) [16], theo một báo các khác, đột biến này chiếm tới 37-63% tổng số đột biến ở người da trắng[9] Đây là đột biến dạng thay thế Histidin bằng Glutamin Bằng việc sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen ATP7B, các nhóm nghiên cứu của Tanzi, Caca, Ferenci đã phát hiện ra dạng đột biến H1069Q (exon 14) phổ biến nhất trên bệnh nhân Wilson ở... lành mang gen, aa – đồng hợp tử bệnh) Bệnh nhân Wilson có thể mang một gen bệnh của người bố hoặc một gen bệnh của người mẹ hoặc cả hai gen bệnh của người bố và người mẹ Bố, mẹ của bệnh nhân có thể mang gen đồng hợp lặn hoặc gen dị hợp Các anh chị em của bệnh nhân có thể mang gen bệnh hoặc không Những người mang gen bệnh đều có khả năng di truyền cho con cháu Có một điểm khác biệt so với nhiều bệnh di... trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi Nhận xét: Giải trình tự gen ATP7B phát hiện cùng dạng đột biến trên 3 bệnh nhân (mã số 01, 02, 03): Đột biến dị hợp tử thêm 5 nucleotide CGCCG sau vị trí 41 (NM_000053, GeneBank) làm thay đổi khung dịch mã Đây là đột biến mới chưa được công bố tại ngân hàng dữ liệu về bệnh Wilson (www.wilsondiseas.med.ualberta.ca) Đột biến. .. giải trình tự gen ATP7B của bệnh nhân mã số 04 Chú thích: Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi Nhận xét: Giải trình tự gen ATP7B phát hiện 2 dạng đột biến trên bệnh nhân mã số 04: Đột biến dị hợp tử thêm 5 nucleotide CGCCG sau vị trí 41 33 (NM_000053, GeneBank) làm thay đổi khung dịch mã cũng xuất hiện ở bệnh nhân này Đột biến dị hợp... bảo cho phản ứng sequencing tiếp theo để phát hiện đột biến điểm Sản phẩm PCR tiếp tục được giải trình tự gen để phát hiện đột biến Kết quả có 4 đột biến điểm dị hợp tử, trong đó 3 dạng đột biến sai nghĩa (missense) và 1 dạng đột biến nằm ở mất nucleotide (deletion) Các dạng đột biến sai nghĩa missense bao gồm: p.Thr850Iso, p.Leu1371Pro, p.Val456Leu Một đột biến thêm nucleotide c.41_40insCGCCG ở exon... 16 Nhận xét: 5 bệnh nhân Wilson được phân tích gen đều được phát hiện có hai đột biến dị hợp tử trên gen ATP7B bao gồm 1 đột biến thêm nucleotide và 3 đột biến ở thay thế axit amin Các bệnh nhân trên đều có lượng Ceruloplasmin đo được rất thấp CHƯƠNG 4 36 BÀN LUẬN 4.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA Với những bệnh lý di truyền có biểu hiện lâm sàng phức tạp dễ nhầm lẫn như bệnh Wilson, chẩn đoán bệnh ở mức độ . Quốc đột biến p.Arg778Leu lại chiếm tới 34-38% tống số đột biến [9] Từ những ý nghĩa trên đề tài : Nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện. tiêu: Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson. 5 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH WILSON 1.1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh Wilson trên. trên gen ATP7B bằng phương pháp phân tích đột biến tại bệnh viện nhi trung ương[6]. Năm 2011, Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein trường ĐH Y Hà Nội tiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B