- Acid nucleic có phổ hấp phụ cực đại ở bước sóng 260nm là do sự có mặt của base purin và base pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA
3.2.1. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B
21 cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuyếch đại gen ATP7B. Kích thước của các sản phẩm PCR trong khoảng 100÷200 bp. Hình 3.1 minh họa sản phẩm PCR của gen ATP7B sử dụng cặp mồi ATP7B Exon 3.
Hình 3.1. Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen từ exon 3 của gen ATP7B.
C: mẫu đối chứng, 1-5: mẫu bệnh nhân. MarkerФ174 Nhận xét:
Sản phẩm PCR thu được là đặc hiệu, rõ nét và đảm bảo cho phản ứng sequencing tiếp theo để phát hiện đột biến điểm.
Sản phẩm PCR tiếp tục được giải trình tự gen để phát hiện đột biến. Kết quả có 4 đột biến điểm dị hợp tử, trong đó 3 dạng đột biến sai nghĩa (missense) và 1 dạng đột biến nằm ở mất nucleotide (deletion). Các dạng đột biến sai nghĩa missense bao gồm: p.Thr850Iso, p.Leu1371Pro, p.Val456Leu. Một đột biến thêm nucleotide c.41_40insCGCCG ở exon 1. Dưới đây là một số minh họa các dạng đột biến gen ATP7B của các bệnh nhân nghiên cứu.
3.2.1.1. Đột biến ở bệnh nhân mã số 01, 02, 03 Đột biến c.40_41insCGCCG (đột biến mới)
Bệnh nhân mã số 01 Người bình thường
Đột biến missense: p.Val456Leu (NDV : non disease variant)
Bệnh nhân mã số 01 Người bình thường Hình 3.2. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh
nhân mã số 01
Chú thích: Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi
Nhận xét:
Giải trình tự gen ATP7B phát hiện cùng dạng đột biến trên 3 bệnh nhân (mã số 01, 02, 03): Đột biến dị hợp tử thêm 5 nucleotide CGCCG sau vị trí 41 (NM_000053, GeneBank) làm thay đổi khung dịch mã. Đây là đột biến mới chưa được công bố tại ngân hàng dữ liệu về bệnh Wilson
(www.wilsondiseas.med.ualberta.ca). Đột biến dị hợp tử thứ hai là thay thế G
c. 1523G >C p.Val456Leu c.1523G p.Val456 c.40_41insCGC CG c.40G
thành C ở vị trí 1523 (c.1523G>C, NM_000053, GeneBank) làm cho bộ ba tại vị trí 456 mã hóa Valine chuyển thành Leucin (p.Val456Leu). Đột biến này được công bố là biến không gây bệnh (non disease variant, NDV).
3.2.1.2. Đột biến ở bệnh nhân mã số 04
Đột biến c.40_41insCGCCG (đột biến mới)
Bệnh nhân mã số 04 Người bình thường Đột biến c.2627 C>T - p.Thr850Iso
Bệnh nhân mã số 04 Người bình thường Hình 3.3. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B của bệnh nhân mã số 04
Chú thích: Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi
Nhận xét:
Giải trình tự gen ATP7B phát hiện 2 dạng đột biến trên bệnh nhân mã số 04: Đột biến dị hợp tử thêm 5 nucleotide CGCCG sau vị trí 41
c.40_41insCGCCG c.40G
c. 2627C >T p.Thr850Iso
c. 2627C p.Thr850
(NM_000053, GeneBank) làm thay đổi khung dịch mã cũng xuất hiện ở bệnh nhân này. Đột biến dị hợp tử thứ hai là thay thế C thành T ở vị trí 2627 (c.2627C>T, NM_000053, GeneBank) làm cho bộ ba tại vị trí 850 mã hóa Threonin chuyển thành Isoleucin (p.Thr850Iso). Đột biến này đã được công bố là biến gây bệnh (disease variant, DV).
3.2.1.3. Đột biến ở bệnh nhân mã số 05
Đột biến c.2627 C>T - p.Thr850Iso
Bệnh nhân mã số 05 Người bình thường Đột biến c.4267 T>C - p.Leu1371Pro
Bệnh nhân mã số 05 Người bình thường Hình 3.4. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B của bệnh nhân mã số 05
Chú thích: Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi
c. 2627C >T p.Thr850Iso c. 2627C p.Thr850 c. 4267C >T p.Leu1371Pro c. 4267C p.Leu1371
Nhận xét: