khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ duchenen bằng kỹ thuật mlpa

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** ĐỖ THỊ MAI NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khãa 2009-2013 Hà Nội – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 1 1 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** ĐỖ THỊ MAI NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KhÓa 2009-2013 Giáo viên hướng dẫn:TS. Trần Vân Khánh Hà Nội – 2013 2 2 3 LỜI CẢM ƠN Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi học hỏi được rất nhiều, đó không chỉ là kiến thức mà còn là tác phong và kinh nghiệm làm việc. Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Trần Vân Khánh, trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, phó giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đã giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa luận cho tôi. GS.TS. Tạ Thành Văn, PGS.TS. Nguyễn Thị Hà, những người thầy tuy không trực tiếp hướng dẫn tôi làm khóa luân nhưng đã nhắc nhở, động viên không chỉ tôi mà tất cả các sinh viên, học viên đang tiến hành khóa luận tại trung tâm, tạo mọi thuận lợi cho chúng tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. ThS. Đỗ Ngọc Hải, khoa Hóa Sinh, bệnh viện Việt-Tiệp Hải Phòng, cùng tập thể labo nghiên cứu gen-protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài Ban giám hiệu, phòng quản lí và đào tạo đại học, bộ môn bệnh học phân tử và các phòng ban trong trường Đại học y Hà Nội Những người thân trong gia đình, bạn bè, các anh chị đã động viên, chia sẻ khó khăn với tôi trong quá trình làm khóa luận. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013. Đỗ Thị Mai 3 3 4 Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc *** LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ của thầy cô và các anh chị tại trung tâm nghiên cứu, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013 Người viết khóa luận Đỗ Thị Mai DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMD BMD DNA Duchene muscular dystrophy Becker muscular dystrophy Deoxyribonucleic Acid 4 4 5 cDNA Complimentary Deoxyribonucleic Acid CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử CK Creatin kinase bp PCR Basepair Polymerase chain reaction MLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification NST Nhiễm sắc thể RNA dNTP ddNTP BN Ribo Nucleic Acid Deoxyribonucleoside triphosphate Dideoxyribonucleoside triphosphate Bệnh nhân ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại, được phát hiện trên nhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới, là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai (7) 5 5 6 DMD là một trong các bệnh di truyền có tiên lượng xấu vì chưa có phương pháp điều trị hiệu quả. Bệnh nhân dần dần bị tàn phế và thường chết do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20 tuổi. Bệnh nhân có các biểu hiện suy yếu cơ: khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày càng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại (7) Nguyên nhân gây bệnh DMD là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X, có chiều dài 2500 Kb, bao gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau. Gen dystropin sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổng hợp protein dystrophin. Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Gen dystropin bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD. Một thể nhẹ hơn của DMD là Becker Muscular Dystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuất hiện muộn hơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn.(7) Các đột biến có thể xảy ra trên gendystropin là đột biến mất đoạn, đột biến điểm, và lặp đoạn. Mất đoạn là loại đột biến hay gặp nhất, chiếm khoảng 65% trong số các đột biến. Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra trong vùng “hotspots”là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’của gen dystropin(7) 6 6 7 DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi vậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ làm chậm lại các biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài ra,việc phát hiện đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh. Phương pháp MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) hiện đang là phương pháp tối ưu trong xác định đột biến xoá đoạn, được ứng dụng rộng rãi. Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne” được thực hiệnnhằm mục tiêu: Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 7 7 8 1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD. 1.1.1. Trên thế giới. - Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh mô tả chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (29) - Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt các bệnh cơ khác nhau và sau đó bệnh đã được mang tên ông (29) - Năm 1879, Gowers thu thập 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ càng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết (29) - Bệnh DMD đã được biết hơn 100 năm, trong suốt một thời gian dài bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợ trong quá trình của bệnh đối với bệnh nhân. - Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK), phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền(27) - Cho đến năm 1981, Zatz và cộng sựphát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21 (28) - Từ năm 1984 – 1987, Hoffman và các cộng sự của ông phát hiện gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen (23) - Sau những năm 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di truyền phân tử phát triển mạnh nhằm phát hiện đột biến gen dystrophin, tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn 8 8 9 di truyền nhằm hạn chế tới mức thấp nhất sự sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD (23) - Năm 1987 - 1988, các nhà nghiên cứu chỉ biết gen dystrophin gồm 60 exon. - Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb - Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh gây ra. 1.1.2. Ở Việt Nam. DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gía trị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này. Cụ thể: - Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS nghiên cứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại Viện BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107 gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh (1) - Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ gen cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh. - Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biến xoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR(2) - Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng công bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc tế lần thứ 23 (1). 9 9 10 - Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 nghiên cứu đột biến gen gây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6 trường hợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu. - Năm 2004, Trần Vân Khánh và cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38% có đột biến xóa đoạn gen dystrophin. - Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện 13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD. - Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58 bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ xóa đoạn exon 46, 51 và cả hai exon là 23/58, chiếm tỷ lệ 39,7%. 1.2. Đặc điểm bệnh DMD 1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh DMD Hình 1.1 Người bình thường và bệnh nhân DMD Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn sau: Giai đoạn 1 (khi trẻ được 3-5 tuổi) Trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp ngã, trẻ chưa có biểu hiện 10 10 [...]... bào cơ với vùng ngoại bào(7) Hình 1.6: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin tại màng tế bào cơ (actionduchene.org.com) 1.6 Các dạng đột biến cấu trúc của gen Dystrophin 1.6.1 Đột biến mất đoạn gen Dystrophin Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD Đột biến này chiếm khoảng 60÷65% trong tổng số các dạng đột biến Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspots region) đó là... chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen, cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh chóng Kỹ thuật sử dụng bộ kit Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất Các qui trình kỹ thuật đều thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất • Nguyên lý: Đột biến được phát hiện bằng các đoạn dò (probe) Mỗi probe gồm hai chuỗi oligonucleotid, các probe này lai đặc hiệu với 79 exon của đoạn gen đích... tích đột biến gen Dystrophin, người ta thường hay tập trung phân tích hai vùng này trước để phát hiện đột biến mất đoạn [29] 1.6.2 Đột biến điểm Đột biến điểm đứng thứ 2 về mức độ thường gặp, chiếm 25 ÷ 30%, hầu hết đột biến điểm là dạng tạo ra mã kết thúc sớm (nonsense mutation) và gây 18 19 19 nên thể bệnh nặng, đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen đã gây nên một trở ngại lớn khi xác định đột. .. trở ngại lớn khi xác định đột biến [29] 1.6.3 Đột biến lặp đoạn trong gen Dystrophin Đột biến lặp đoạn chiếm tỉ lệ thấp hơn, khoảng 10 ÷ 15%, tập trung chủ yếu ở đầu 5’ tận của gen Dystrophin 1.7 Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong chẩn đoán mất đoạn gen dystropin 1.7.1 Phương pháp khuếch đại DNA dò – MLPA (Multiplex LigationDependent Probe Amplification) Kỹ thuật MLPA là một phương pháp được... DMD 14 15 15 Hình 1.2 Cơ chế di truyền bệnh DMD (http://di truyền.com) Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ biểu hiện bệnh Francke (1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt Có khoảng 30% bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền... quá trình đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ 1.4 Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin 1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X Hình 1.3: Vị trí của gen Dystrophin (ghr.nlm.nih.gov) 15 16 16 1.4.2 Cấu trúc gen Dystrophin Hình 1.4: Cấu trúc gen Dystrophin (actionduchene.com) Gen Dystrophin là một trong những gen lớn nhất... kết và những tế bào đơn nhân Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker (BMD) Bệnh nhân BMD xuất hiện triệu chứng lâm sàng muộn hơn DMD, biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein Dystrophin giảm đáng kể trên màng tế bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD (20) 1.2.3 Điều trị bệnh DMD Hiện nay phối hợp điều... bình thường, tiền sử gia đình không có ai mắc bệnh di truyền Nhóm chứng được dùng như chứng bình thường - Nhóm nghiên cứu: gồm 6 bệnh nhân được chẩn đoán bị mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne dựa vào một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng điển hình Bệnh nhân có tiền sử gia đình rõ ràng 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân tích bệnh chứng Thiết kế nghiên cứu Bước 1: Lấy mẫu máu Bước 2: Tách chiết... PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm .Kỹ thuật này dựa trên những nguyên tắc cơ bản của quá trình sao chép DNA trong cơ thể sống Từ một khuôn ban đầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đích cần nghiên cứu Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ - Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Phân tử DNA được biến tính... điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định rằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh DMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó là việc phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái trong gia đình bệnh nhân) và chẩn đoán trước sinh cho những những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ và đang mang thai có nguy cơ cao Phương . tiêu: Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 7 7 8 1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh. định đột biến xoá đoạn, được ứng dụng rộng rãi. Với những ý nghĩa trên đề tài: Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne” được thực hiệnnhằm. cơ (actionduchene.org.com) 1.6. Các dạng đột biến cấu trúc của gen Dystrophin 1.6.1. Đột biến mất đoạn gen Dystrophin Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD. Đột biến này chiếm khoảng 60÷65%