Quy trình:
- Bước 1 : Phá vỡ hồng cầu
+ Cho vào ống eppendorf loại 1.5 ml: 0.5ml máu toàn phần chống đông EDTA +1ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer RBC) .
+ Lắc nhẹ, vontex, để 5’ cho phản ứng xảy ra
+ Ly tâm 4000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi, thu cặn
Lặp lại quy trình này 2 lần cho tới khi thấy tủa trắng (nhân và xác tế bào)
- Bước 2: Phá vỡ bạch cầu
+ Thêm 1ml dd BPS, vontex nhẹ
+ Ly tâm 4000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi, thu cặn
Chú ý: Lặp lại bước trên khi quan sát thấy tủa còn màu nâu để thu được tủa trắng ở đáy ống
+ Sau đó đem ủ ở 56ºC/qua đêm hoặc khi quan sát thấy tủa tan hết thành dung dịch đồng nhất.
- Bước 3:
+ Tách DNA
o Thêm 500 µl dung dịch PCI ( Phenol: Chloroform: Isoamyl) tỷ lệ 25:24:1 để tủa protein
o Trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
Hỗn hợp phân thành hai lớp. quan sát thấy một lớp màng trắng, nhầy phân tách giữa hai lớp. Đó là protein, xác tế bào
Thu lớp dịch trên cùng
o Thêm 500 µl dung dịch CI 24:1 ( Chloroform: Isoamyl)
o Lắc trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
o Hỗn hợp phân thành 2 lớp: thu lớp dịch trên cùng
+ Tủa DNA:
o Trộn 1V dịch vừa thu được + 2.5V Ethanol 100% + 0.1V Sodium Acetate 3M.
o Lắc đều, để -20°C/2h để kết tủa DNA
o Ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu tủa
o Thêm 1ml Ethanol 70% , trộn đều
o Ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu được tủa DNA
o Tủa DNA để khô tự nhiên (56 ºC), sau đó hòa tan bằng đệm TE