2. Đo mật độ quang bằng máy Nanodrop
3.2.3. Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số3.
Hình 3.4: Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân mã số3.
Chú thích: Mỗi đỉnh tương ứng với một tín hiệu của probe tương ứng với các exon, các chữ số và mũi tên chỉ vị trí tín hiệu thay đổi.
Nhận xét:
Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 3 được đối chiếu so sánh với kết quả MLPA của mẫu đối chứng nam. Ở mẫu bệnh nhân mã số 3 không xuất hiện đỉnh tương ứng tại exon 18. Điều này chứng tỏ bệnh nhân bị đột biến xoá đoạn gen tại exon 18.
3.2.4.Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 4
Exon 51 Exon 52
Hình 3.5: Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 4.
Chú thích: Mỗi đỉnh tương ứng với một tín hiệu của probe tương ứng với các exon, các chữ số và mũi tên chỉ vị trí tín hiệu thay đổi.
Nhận xét:
Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 4 được đối chiếu so sánh với kết quả MLPA của mẫu đối chứng nam. Ở mẫu bệnh nhân mã số 4 cho thấy mất đỉnh của các exon 50, 51, 52. Kết quả này khẳng định bệnh nhân bị đột biến xoá đoạn gen gồm 3 exon là 50, 51, 52.
3.2.5.Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số5:
Hình 3.6: Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 5.
Chú thích: Mỗi đỉnh tương ứng với một tín hiệu của probe tương ứng với các exon, các chữ số và mũi tên chỉ vị trí tín hiệu thay đổi.
Nhận xét:
Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 5 được đối chiếu so sánh với kết quả MLPA của mẫu đối chứng nam. Ở mẫu BN mã số 5 cho thấy mất đỉnh của các exon từ 3 tới 7. Kết quả này khẳng định bệnh nhân bị đột biến xoá đoạn gen gồm 5 exon .
Hình 3.7: Kết quả MLPA của bệnh nhân mã số 6.
Chú thích: Mỗi đỉnh tương ứng với một tín hiệu của probe tương ứng với các exon, các chữ số và mũi tên chỉ vị trí tín hiệu thay đổi.
Nhận xét:
Kết quả MLPA của BN mã số 6 được đối chiếu so sánh với kết quả MLPA của mẫu đối chứng nam.Kết quả cho thấy mất đỉnh của các probe tương ứng với exon 51 và 52. Kết quả này khẳng định bệnh nhân bị đột biến xoá đoạn gen dystropin gồm 2 exon là 51 và 52.
3.2.7.Kết quả kiểm chứng mẫu BN số 3 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự.
3.2.7.1.Kết quả PCR thường.
Tiến hành kỹ thuật PCR thường, khuếch đại exon 18 của mẫu BN số 3 để kiểm chứng xem exon này có bị mất hay không. Tiến hành song song mẫu bệnh nhân cùng mẫu chứng âm, chứng dương. Điện di 3 mẫu và marker 100bp.
Hình 3.8:Kết quả điện di mẫu PCR khuếch đại exon 18 của BN mã số 3
Kết quả trên băng điện di cho thấy, mẫu chứng âm (dùng nước cất thay cho DNA) không lên vạch. Mẫu chứng dương (dùng DNA của chứng nam) và mẫu BN mã số 3 lên vạch cùng kích thước. Hai vạch này trùng với kích thước 456bp của exon 18 sau khuếch đại PCR. Kết luận, exon 18 của BN mã số 3 không bị mất.
3.2.7.2.Kết quả giải trình tự gen bệnh nhân mã số 3
Tiếp tục thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen.
Hình 3.9: Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số3.
Chú thích: Vị trí gạch chân màu đỏ cho thấy sự thay đổi của nucleotide giữa bệnh nhân và người lành
456bp
vị trí 2227, làm bộ ba tại vị trí 743 ( CAG) chuyển thành bộ ba mã kết thúc TAG ( Stop codon).
Tra thứ tự đoạn gắn đặc hiệu gen đích của probe exon 18 (cung cấp theo kit của nhà sản xuất):
AGAAGCTGGTT-GCAGAGTCCTGA
Quan sát phần được gạch chân màu đen trên hình 3.9, nhận thấy vị trí gắn probe trên gen đích có đột biến điểm. Đây chính là nguyên nhân gây tín hiệu xóa đoạn giả
Kết luận
BN Loại đột biến Vị trí đột biến
BN mã số1 Đột biến xóa đoạn (frameshift) Exon 46 tới 50 BN mã số 2 Đột biến xóa đoạn (inframe) Exon từ 61 tới 67
BN mã số 3 Đột biến điểm Exon 18
BN mã số 4 Đột biến xóa đoạn (frameshift) Exon 50 tới 52 BN mã số 5 Đột biến xóa đoạn (frameshift) Exon 3 tới 7 BN mã số 6 Đột biến xóa đoạn (inframe) Exon 51 tới 52