2. Đo mật độ quang bằng máy Nanodrop
4.3. Phân tích các ưu, nhược điểm của kỹ thuật MLPA:
Qua tiến hành nghiên cứu xác định đột biến xóa đoạn gen, kỹ thuật MLPA cho thấy nhiều ưu điểm vượt trội. Giảsử ta sử dụng phương pháp PCR thay cho kỹ thuật MLPA để phát hiện đột biến gen dystrophinở mức độ DNA. Để phát hiện đột biến xóa đoạn trong vùng hotspot các nghiên cứu thường sử dụng từ 19-25 cặp mồi cặp mồi tương ứng từng đó phản ứng PCR để khuếch đại từng exon từ 1 đến 19 và từ 43 đến 60 (ưu tiên xác định đột biến ở hai vùng trọng điểm trước, chưa tính đến việc khuếch đại các exon ngoài hai vùng này), cùng với điện di trên gel agarose 19-25 lần để xác định sự xuất hiện vạch DNA hay không, quá trình được tiến hành song song với 19-25 lần của mẫu đối chứng. Không kể việc lặp lại phản ứng để kiểm định lại kết quả. Điều này gây tốn kém rất nhiều về thời gian, sức lực và kinh phí trong khi đó vẫn chưa thể khảo sát hết 79 exon của gen dystropin.
Với BN mã số 1, kỹ thuật PCR như đã nói ở trên sẽ không phát hiện được đột biến do đột biến nằm ngoài vùng hotspot nên không được phân tích.
Với BN mã số 3, phân tích bằng kỹ thuật PCR thường sẽ không phát hiện được bất thường trên exon 18 để đem giải trình tự exon này. Ta cũng khó sử dụng kỹ thuật giải trình tự đơn lẻ để phát hiện đột biến do gen dystropin là một gen rất dài, khó giải trình tự toàn bộ 79 exon của từng bệnh nhân được. Do đó giải trình tự là phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác đột biến.
Trong kỹ thuật MLPA, lượng DNA sử dụng phân tích là không nhiều trong khi nếu sử dụng kỹ thuật PCR, việc phân tích trên nhiều exon là khó tránh khỏi dẫn tới việc hết DNA tách chiết. Do đó, có nhiều trường hợp, còn nhiều exon cần phân tích nhưng DNA tách chiết đã hết dẫn tới phải tách chiết thêm. Lúc này, mẫu máu đã được giữ trong một thời gian dài, không còn đảm bảo tốt nhất cho chất lượng của DNA gây ảnh hưởng tới kết quả tách chiết và kết quả phân tích về sau.
Tuy nhiên, phương pháp nào cũng có những hạn chế nhất định. Bất kì lí do nào khiến probe trong kỹ thuật MLPA không gắn được vào vị trí gen đích đều dễ gây kết luận nhầm là mất exon. Nhưng tín hiệu mất exon giả này thường chỉ gặp ở các exon đơn lẻ, rải rác trên gen. Ví dụ với BN mã số 3, đột biến điểm xảy ra tại vị trí gắn probe khiến probe không được nối và khuếch đại làm mất đỉnh của probe exon tương ứng. Do đó PCR và giải trình tự gen là các phương pháp hỗ trợ, bổ sung cần thiết để xác định đột biến gen một cách chính xác.
KẾT LUẬN
Sử dụng kỹ thuật MLPA đã phát hiện được 5/6 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn trên gen dystropin, 1 bệnh nhân có đột biến điểm trên exon. Không phát hiện thấy các bệnh nhân có đột biến lặp đoạn trong số các bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Trong số 5 BN có đột biến xóa đoạn phát hiện được, 4 BN có đột biến nằm trong vùng hotspot, 1 BN có đột biến ngoài vùng hotspot.
Mỗi kỹ thuật sinh học phân tử đều có những ưu, nhược điểm riêng tuy nhiên dođiều kiện thời gian, cỡ mẫu nhỏ nên nghiên cứu chưa thể kiểm chứng được kết quả của BN bằng nhiều phương pháp khác nhau và chưa thể đưa ra được tỉ lệ đột biến xóa đoạn và tỉ lệ vùng xảy ra đột biến xóa đoạn (vùng hotspot và ngoài vùng hotspot). Do đó nghiên cứu cần được tiếp tục với thời gian lâu hơn và cỡ mẫu lớn hơn để xác định được đột biến trên người bệnh một cách chính xác, phục vụ tốt hơn cho chẩn đoán, điều trị, tiên lượng và tư vấn.
1. Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Thu Nhạn, Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trần Vân Khánh, Masafumi Matsuo (2006), “Đột biến mất đoạn gen Dystrophin của các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker Việt Nam”, Hội Nhi khoa Việt Nam, Đại hội hội Nhi khoa Việt Nam lần thứ XVIII 4/5/2006, tr.202-8.
2. Đặng Diễm Hồng, Luyện Quốc Hải, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trần Vân Khánh (2006).“ Phân tích và phát hiện 10 trường hợp đột biến gen Dystrophin ở 33 bệnh nhân Việt Nam được chẩn đoán Duchenne, Becker”, Tạp chí nghiên cứu Y học, số1, 1/2006.
3. Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh và Tạ Thành Văn(2005). “Phát hiện một trường hợp đột biến dài 27 exon ở vùng Rod của gen Dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne”. Tạp chí Y học Việt Nam 4, tr: 23-28.
4. Trần Vân Khánh và Tạ Thành Văn (2005). “Phát hiện một trường hợp đột biến lặp đoạn exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen Dystrophin gen ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne”. Tạp chí Y học thực hành 2, tr: 12-16.
5. Trần Vân Khánh (2005) . “Đột biến ở vùng Rod của gen Dystrophin gây nên bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”. Tạp chí Y học Việt Nam 6, 33-39.
6. Tạ Thành Văn “PCr và một số kỹ thuật sinh học phân tử”, nhà xuất bản y học
phương pháp PCR”. Tạp chí Y học Việt Nam. Tr 33-38.
TIẾNG ANH
9. Agus Surono,Van Khanh Tran, Yasuhiro Takeshima, Hiroko Wada, Mariko Yagi, Miho Takagi, Makoto Koizumi and Masafumi Matsuo,(2004). “Chimeric RNA/ Ethylene-Bridged Nucleic Acids Promote Dystrophin Expession in Mytocytes of Duchenne Muscular Dystrophy by Inducing Skipping of the Nonsense Mutation Encoding Exon”. Human gene therapy. 15, 749-757.
10. Ahn A. H.,Kulkel L.M. et al (1993) “The structural and functional diversity of Dystrophin”. Nat Gent 3, 283- 291.20
11. Alvarez Leal M., Ortiz Mariscal J.D. (1990). “Evaluation of The activity of Creatine phosphokinase for the detection of carrers of Duchenne typ Mascular Dystrophy in families in the city of Monterey Mexico, Rev – Invest clin”. Jan – Mar 42 , 9 - 45.
12. Asakawa J., Satoh C., Yamasali Y., Chen S.H. (1992). “Accurate and rapid detection ofheterozygous carriers of a deletion by combined polymerase chain reaction anh high performance liquid chromatoghraphy”. Proc – Natl – Acad – Sci USA , 89.
13. Baiget M., Del Roi E., Gallano P. (1989). “Use of Dystrophin cDNA for direct dianosis of Duchenne muscular dystrophy in female carriers”.
Russia”. Prenat Diagn 13, 323 – 333.
15. Barannzini S.E., Giliberto F., Herrera M.(1998). “Bernathv, Deletion Pattern in Argentine patients with Duchenne and Backer muscular dystrophy”. Neurol res 20, 409 – 414.
16. Bertoni C. (2007). “Clinical approaches in the treatment of Duchenne muscular dustrophy (DMD) using oligonucleotides”.
17. Browne C.S., Thomas N.S.T. (1985). “Genetic linkage relationships af seven DNA probes with Duchenne and Becker muscular dystrophy,”.Humgenet 90
18. Behrman, Kliegman, Arvin (1998). Nelson texbooks of pediatrics Edition 15th .
19. Prior TW, Bridgeman SJ (2005), “Experience and Strategy for the Molecular Testing of Duchenne Muscular Dystrophin”
20. Forrest S.M., Cross G.S., Speer A.,Robson K.J.H.(1988), Davies K.E. et al. “Futher studies of gen deletion that cause Duchenne and Becker musculardystrophy”. Genomic 2, 109 - 114.
21. Foster K., Foster H., Dickson J.G. (2006). “Gene therapy progress and prospects: Duchenne muscular dystrophy”. Gene Ther 13(24)
22. Gruemer H.D., Greg Miller W.G.,Chinchillin V.M., et al (1985). “Prediction of carrer status in Duchenne dystrophy by creatine kinase iso enzymes: Pathophysiology and clinical application”. Springer – Verlag, Berlin Heidelberg New York, 178 -182.
23. MRC- Holland, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) General Protocol, DNA protocol version MDP-v002, last update 23-01-2012
splice site is active in the lymphocytes, but not in the skeletal muscle of a DMD patient”.Hum Genet.120, 737-742.
26. Tran VK., Zhang Z., Yagi M., Nishiyama A., Habara Y., Takeshima Y., Matsuo M. (2005).A novel cryptic exon identified in the 3’region of intron 2 of the human Dystrophin gene. J. Hum. Genet. 50, 425-433.
27. Lindenbaum R. H., Clarke G., Patel, C., Moncrieff M., Hughes J.T. (1979). “Muscular dystrophy in an X; translocation female suggesst that Duchenne locus is on X chromosome short arm”. J Med Gent 16, 389- 392.
28. Emery A.E (1993). “Duchenne muscular dystrophy Meryon’disease”.
Neuromuscul – Disord 3, 263-266.
29. Fauci, Braunwald, Isselbacher, Wilson, Martin, Kasper, Hauser, Longo (1998). Harrison’s principle roles of internal medicine, 14th
edition, 2473 – 2485.
30. Forrest S.M., Cross G.S., Speer A.,Robson K.J.H.(1988), Davies K.E. et al. “Futher studies of gen deletion that cause Duchenne and Becker musculardystrophy”. Genomic 2, 109 - 114.
31. Foster K., Foster H., Dickson J.G. (2006). “Gene therapy progress and prospects: Duchenne muscular dystrophy”. Gene Ther 13(24),
32. Edward Winnick. (2004) “DNA Sequencing Industry Sets its Sights on the Future”. The Scientist, 18(18), 44.
PHỤ LỤC