2. Đo mật độ quang trên máy Nanodrop
2.4.4. Thực hiện kỹ thuật MLPA.
Trước tiên cần đo lại nồng độ DNA và kiểm tra độ tinh sạch của mẫu. Qui trình kỹ thuật
o Bước 1: Biến tính DNA (ngày 1)
1. Chuẩn bị ống effendorf loại 0,2 ml chạy PCR
2. Cho 5 µl dung dịch DNA chứa 60ng DNA (sử dụng nồng độ đo được bằng máy NanoDrop100 để tính toán pha bằng nước cất cho vừa đủ)
3. Bắt đầu chu trình nhiệt đã được cài sẵn: biến tính ở 98ْ C trong 5’, rồi giữ ở 25 ْ C
o Bước 2 : Lai hóa( ngày 2)
1. Chuẩn bị master mix: Mỗi phản ứng
MLPA buffer 1,5 µl
Probe mix 1,5 µl
Tổng 3,0 µl
2. Khi nhiệt độ về 25 ْ C, mở nắp máy PCR, cho vào mỗi mẫu 3 µl master mix, trộn đều
3. Tiếp tục chu trình nhiệt: ủ 95 ْ C trong 1 phút, rồi 60ْ C trong 16-20 giờ
o Bước 3: Nối sau lai
Chuẩn bị Ligase master mix
Ligase 65 buffer B 3 µl
Nước 25 µl
Trộn đều
1. Thêm 1 µl Ligase 65 cho mỗi phản ứng vào hỗn hợp Ligase Master Mix. Trộn nhẹ nhàng
2. Tiếp tục chu trình nhiệt, giữ ở 54 ْ C
3. Mở nắp máy PCR, thêm 32 µl Ligase Master Mix cho mỗi phản ứng. Trộn đều
4. Tiếp tục chu trình nhiệt: 15 phút ở 54 ْ C ( cho lai hóa), 5 phút ở 98ْ C ( bất hoạt ligase 65, rồi dừng ở 15ْ C
o Bước 4: Chạy PCR (khuếch đại, nhân bản probe)
1. Chuẩn bị các tube effendorf mới loại 0,2ml chạy PCR
2. Chuẩn bị PCR buffer mix
SALSA PCR buffer 4 µl
Nước cất 2 lần 26 µl
Trộn nhanh
3. Thêm 30 µl PCR buffer mix vào mỗi tube
4. Ở nhiệt độ phòng, lấy các tube trong máy PCR ra chuyển 10 µl sản phẩm nối trong máy PCR vào các tube tương ứng.
Chuẩn bị Polymerase master mix
SALSA PCR-primers 2 µl
SALSA enzyme dilution buffer 2 µl
Nước cất 2 lần 5,5 µl
SALSA Polymerase 0,5 µl
Trộn đều, giữ trong đá cho tới khi dùng
5. Tiếp tục chu trình nhiệt, dừng ở 60ْ C
6. Thêm 10 µl polymerase mix vào mỗi tube. Trộn đều và tiếp tục chu trình nhiệt:
95°C trong 30 giây
60°C trong 30 giây 35 chu kỳ 72°C trong 1 phút
Tiếp tục 72°C trong 20 phút, giữ ở 15°C
Sản phẩm được phân tích trên máy. Mỗi đỉnh tương ứng với 1 exon. Độ cao thấp của các đỉnh (peak) sẽ được so sánh với mẫu chứng để phát hiện đột
Như vậy chu trình nhiệt chạy máy PCR dành cho kỹ thuật MLPA được cài đặt như sau:
1) Biến tính 1. 98°C 5 phút 2. 25°C dừng 2) Lai hóa 3. 95°C 1 phút 4. 60°C dừng
3) Nối ghép sau lai
5. 54°C dừng 6. 54°C 15 phút 7. 98°C 5 phút 8. 15°C dừng 4) Chạy PCR 9. 60°C dừng
35 chu kì: 95°C trong 30 giây 60°C trong 30 giây
72°C trong 1 phút
10. 72°C 20 phút
11. 15°C dừng
2.4.5.Thực hiện các kỹ thuật PCR và giải trình tự.
MLPA có thể cho kết quả dương tính giả nếu chỉ có một probe thay đổi tín hiệu. Điều này có thể xảy ra nếu như tại vị trí lai và nối ghép của probe có đột biến điểm hoặc vì nguyên nhân nào đó. Do đó cần thực hiện thêm PCR và giải trình tự khi có 1 probe bị thay đổi tín hiệu.
2.4.5.1.Thực hiện phản ứng PCR: Mix hỗn hợp phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích 10µl gồm:
• GoTaq: 5
• H2O : 3
• Mỗi ngược : 0.5
• DNA : 1
- Hỗn hợp phản ứng được cho vào máy chạy PCR đã được cài đặt chu trình nhiệt: 940C : 5 phút 940C : 30 giây 550C : 20 giây x 35 chu kỳ 720C : 2 phút 720C : 5 phút 150C giữ
Hình 2.1: Chu trình nhiệt chạy máy PCR trong bệnh DMD 2.4.5.2.Giải trình tự gen • Mix PCR giải trình tự Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự - Thành phần của 1 phản ứng: STT Thành phần Thể tích (µl) 1. DNA 0.5 2. Buffer 1.5 3. BigDye 1 4. Mồi 0.5 5. Nước cất 2 lần 6.5
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 960C : 1 phút 960C : 10 giây 500C : 5 giây x 25 chu kỳ 600C : 4 phút 150C Bảo quản ở 40C 2.4.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
Sản phẩm PCR giải trình tự được tinh sạch bằng phương pháp tủa Ethanol:
- Thêm vào ống hỗn hợp phản ứng:
+ 64 µl Ethanol lạnh 95%
+ 26 µl nước.
- Votex rồi để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
- Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Hút bỏ dung dịch giữ lại tủa DNA ở đáy ống.
- Thêm 250 µl Ethanol lạnh 70% (-20 ºC). Trộn đều rồi để nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 15000 vòng/phút x 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Để khô hoàn toàn.
- Thêm 20 µl Hi-Di. Trộn đều (votex nhẹ)
- Để ở 95oC trong 2 phút.
- Làm lạnh trong 5 phút, votex rồi chuyển sang giải trình tự bằng máy ABI 3100.
2.4.4.3. Giải trình tự trực tiếp trên máy tự động
2.4.6.Chạy điện di kiểm tra sản phẩm
- Đổ gel agarose 1,5%
o Bản lớn: cân 0,375g bột thạch agarose hòa trong 25ml dd TE1X
o Bản nhỏ: cân 0.225g bột thạch agarose hòa trong 15ml dd TE1X
+ Đun hỗn hợp bằng lò vi sóng tới khi bột thạch tan hết thành dung dịch đồng nhất.
+ Đổ gel vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng .
+ Để 30 phút tới khi gel đông đặc hoàn toàn.
+ Bản gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm và được ngâm chìm hoàn toàn trong bể điện di đã đổ sẵn đệm TBE.
- Tra mẫu điện di:
+ Hút 5µl
• sản phẩm khuếch đại PCR vào các giếng lần lượt trên bản gel.
• Marker 100pb Chạy điện di:
Tiến hành điện di mẫu DNA bệnh cùng với thang DNA chuẩn trong 30 phút ở hiệu điện thế 90V.
- Nhuộm bản gel điện di:
• Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm ethidium bromide trong 3phút.
• Ngâm bản gel bằng nước để loại bỏ phần ethyldium bromid dư.
- Chụp ảnh gel:
Bản gel sau khi nhuộm với ethyldium bromid được soi bằng đèn tử ngoại (UV). Quan sát các vạch sáng xuất hiện trên bản gel và chụp hình lưu trữ kết quả.
CHƯƠNG 3