2. Đo mật độ quang bằng máy Nanodrop
4.1.Quy trình tách chiết DNA.
Ngày nay các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Nguyên liệu đầu vào quan trọng cần nói tới là DNA của bệnh nhân dùng để phân tích. Do đó khâu tách chiết DNA được coi là quan trọng nhất có thể ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả của sinh học phân tử. Yêu cầu của DNA tách chiết cần đạt tiêu chuẩn là: không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm, nồng độ DNA đạt tiêu chuẩn không quá thấp (thường trên 50 ng/ µl với kỹ thuật PCR). Trong kỹ thuật MLPA mức độ tinh sạch của DNA tách chiết đóng vai trò rất quan trọng, việc bị tạp nhiễm ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả phân tích. Lượng DNA cần lấy thường nằm trong khoảng 50 – 100 ngDNA trong mỗi phản ứng (thường lấy 60ng DNA) (24, 25). Do đó trước khi tiến hành kỹ thuật, đặc biệt là kỹ thuật MLPA thì bắt buộc phải kiểm tra lại nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết. Trong nghiên cứu này, DNA được tách chiết theo quy trình phenol/chloroform. Và kết quả DNA tách chiết thu được có chất lượng tốt.
Saukhi tách chiết và trước khi làm kỹ thuật MLPA, DNA của bệnh nhân và mẫu chứng đều được xác định nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch bằng cách điện di DNA tổng số và đo mật độ quang trên máy Nanodrop 100 tại các bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). DNA có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 260nm, trong khi protein có độ hấp thụ cực đại tại hai bước sóng là 260nm và 280nm. Tỉ số A260/A280 nằm trong khoảng 1.8-2.0 cho biết DNA tách được không bị tạp nhiễm. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch.
lệ A260/A280đều nằm trong khoảng 1,8÷2,0. Hàm lượng DNA thu được đều trên 50 ng/µl, đảm bảo đủ yêu cầu để tiến hành kỹ thuật.