Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 - 5,6%.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ÁP DỤNG KỸ THUẬT MLPA TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2 GÂY BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASE Trần Vân Khánh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Lương Hồng Long1, Lê Thị Phương1, Ngơ Thị Thu Hương1, Tạ Thành Văn1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên đột biến gen CYP21A2 đột biến xóa đoạn phát chiếm tỉ lệ 20 - 25% Kỹ thuật MLPA kỹ thuật thường áp dụng với hiệu độ xác cao Kỹ thuật MLPA áp dụng để xác định đột biến xóa đoạn 102 bệnh nhân Kết cho thấy 35/102 (34,3%) bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 Trong số bệnh nhân phát đột biến, 85,7% đột biến phát bệnh nhân thể muối, 14,3% phát bệnh nhân thể nam hóa đơn Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8% Nghiên cứu phát kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất cao dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon - chiếm tỉ lệ 14,3%, dạng đột biến lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 5,6% Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn, gen CYP21A2, MLPA I ĐẶT VẤN ĐỀ đột biến điểm chiếm 70 - 75% [5] Tùy Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu dạng đột biến gen CYP21A2, kỹ thuật 21-Hydroxylase bệnh di truyền lặn nhiễm khác sử dụng để xác định đột sắc thể thường, khiếm khuyết phần biến Kỹ thuật Southern blotting, PCR hoàn toàn số enzym MLPA thường dùng để xác định đột biến tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol xóa đoạn gen [6] Những bệnh nhân khơng tuyến thượng thận, gây bệnh cảnh lâm sàng xác định đột biến xóa đoạn tiến suy thượng thận cấp nam hóa hành giải trình tự tồn gen CYP21A2 để trẻ gái, dậy sớm giả trẻ trai [1; 2] Các xác định đột biến điểm [7] nghiên cứu cho thấy 95% ca mắc tăng sản Kỹ thuật ứng dụng để xác thượng thận bẩm sinh có nguyên nhân đột định đột biến xóa đoạn Southern blotting, nhiên kỹ thuật có nhược điểm thời biến gen CYP21A2, gen quy định tổng hợp cho enzym 21-Hydroxylase [3; 4] Cho đến nay, nhiều dạng đột biến phát đột biến xóa đoạn chiếm 20 - 25%, Địa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 14/8/2018 Ngày chấp thuận: 22/10/2018 TCNCYH 117 (1) - 2019 gian thực lâu cần sử dụng phóng xạ Hiện nay, phương pháp thường sử dụng để xác định đột biến xóa đoạn MLPA, phương pháp đảm bảo độ xác cao, thời gian thực nhanh xác định tồn dạng đột biến xóa đoạn gen [8] Nghiên cứu thực với mục tiêu: Xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 bệnh tăng sản thượng thận TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase kỹ thuật MLPA 1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 1/2014 đến tháng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1/2016 Địa điểm: Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di Đối tượng truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương Trung 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase chẩn đoán điều trị Khoa Nội tiết Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương tâm nghiên cứu Gene - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp 2.1 Kỹ thuật tách chiết DNA 1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Trẻ gái: có nam hóa phát sinh nam hóa sau sinh, tăng trưởng sớm chiều cao tuổi xương - Trẻ trai: dậy sớm giả, tăng sớm chiều cao tuổi xương DNA tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform Tất mẫu DNA tiến hành đo nồng độ độ tinh sạch, có mẫu DNA đạt giá trị ≥ 1,8 đạt yêu cầu tinh sử dụng để phân tích 2.2 Kỹ thuật MLPA - Cả hai giới: có biểu muối tuần đầu sau sinh: nước, hạ natri clo, Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) để phát đột biến xóa đoạn bệnh tăng kali huyết nhân người lành mang gen bệnh Thành - Tăng 17-OHP huyết vào lúc sáng sớm: Trẻ sơ sinh ≥ ng/ml (bình thường < ng/ ml) phần kit gồm đầu dò (probe) để khuyếch đại gen CYP21A2, đầu dò tương ứng với vùng gen, ngồi có đầu dò đặc trưng cho gen người Sau tuổi sơ sinh: ≥ ng/ml sử dụng để làm đối chứng đầu dò cho nhiễm sắc thể X Y để xác định giới 1.2 Tiêu chuẩn loại trừ tính Sản phẩm khuếch đại điện di - Loại trừ thể tăng sản thượng thận bẩm sinh khác (được khẳng định chẩn đoán phân tử) bao gồm thiếu 11 βhydroxylase; thiếu 3β - hydroxysteroid dehydrogenase typ - Loại trừ bệnh nhân suy thượng thận bẩm sinh nguyên nhân khác giảm sản thượng thận bẩm sinh, suy thượng thận mao quản máy giải trình tự Số lượng sản phẩm khuếch đại đầu dò tỷ lệ thuận với số copy đoạn DNA đích đặc hiệu với đầu dò Quy trình MLPA: Cho 5µl DNA cần phân tích vào ống PCR, biến tính 98oC phút Nhiệt độ chuyển 2oC trước cho 3µl hỗn hợp chứa đoạn oligonucleotid probe Hỗn hợp ủ 60oC bẩm sinh suy yên - Loại trừ bệnh nhân nam dậy sớm 16 giờ, lúc đoạn lai phân tử giả bệnh nhân nữ nam hóa nguyên oligonucleotid gắn với exon đích đặc hiệu nhân khác u vỏ thượng thận nam hóa vị trí sát Thêm 32µl hỗn hợp ligase TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC buffer, ủ 54oC 15 phút, lúc enzym exon đột biến Trong trường hợp bệnh nhân ligase nối đoạn oligonucleotid probe với có đột biến dị hợp tử xóa đoạn, đỉnh tín hiệu Phản ứng nối chấm dứt tăng có chiều cao nửa chiều cao nhiệt độ lên 98oC phút, hỗn hợp mẫu đối chứng giữ 4oC Để khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10µl sản phẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR buffer, giữ 60oC trước thêm 10µl hỗn hợp PCR master vào hỗn hợp, thực chu trình nhiệt sau: [95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - phút] x 35 chu kỳ; 72oC - 20 phút; sản phẩm bảo quản 4oC Sản phẩm khuếch đại probe điện di mao quản huỳnh quang máy giải trình tự để phân tích kết Nếu có đột biến xóa đoạn, probe khơng gắn vào gen đích, kết điện di khơng xuất đỉnh tương ứng Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối quy định đạo đức nghiên cứu y sinh Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thơng tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Bảng Kết phát đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 bệnh nhân Kiểu gen Thể bệnh Dạng đột biến n % Mất toàn gen (Del/Del) Mất muối Homozygous 10 28,6 exon del/ exon del Mất muối Homozygous 2,9 exon - del /exon - del Mất muối Homozygous 2,9 Đồng hợp tử exon - del/exon - del Mất muối Homozygous 14,3 57,2% exon - del/exon - del Mất muối Homozygous 5,6 exon del/exon del Mất muối Homozygous 2,9 exon - del/exon - del Mất muối Heterozygous 5,6 Del/exon - del Mất muối Heterozygous 2,9 Del/– Mất muối Heterozygous Del/– NHĐT Heterozygous Tổng cộng 35 Dị hợp tử 42,8% 34,3 100% Dạng đột biến chiếm tỉ lệ cao đột biến đồng hợp tử với 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8% Nghiên cứu phát kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất cao dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp đến kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon - chiếm tỉ lệ 14,3%, dạng đột biến lại chiếm tỉ lệ thấp từ 2,9 - 5,6% (bảng 1) TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ Tỉ lệ thể bệnh Bằng kỹ thuật MLPA, 35/102 (34,3%) bệnh nhân phát có đột biến xóa đoạn gene CYP21A2 Trong bệnh nhân thể muối chiếm 85,7% (30 bệnh nhân), bệnh nhân thể nam hóa đơn chiếm 14,3% (biểu đồ 1) 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 47% 17% 15% 6% Del - Exon 1-3 Exon 1-8 del del 3% 3% Exon Exon 1-2 del del 3% 3% Exon del 3% Exon 1-6 Exon 4-6 del del Biểu đồ Tỉ lệ allele đột biến Del allele xóa tồn gen CYP21A2; (-) allele khơng phát đột biến xóa đoạn Biểu đồ mô tả tỉ lệ allele đột biến nghiên cứu, allele xóa tồn gen chiếm tỉ lệ cao với 47%, tiếp đến allele xóa đoạn exon - (15%), allele xóa đoạn lại chiếm tỉ lệ từ - 6% Tuy nhiên, 17% allele lại khơng phát đột biến xóa đoạn Kết hình cho thấy chiều cao đỉnh exon exon bệnh nhân nửa so với mẫu đối chứng đỉnh khác có chiều cao giống mẫu bệnh mẫu chứng Điều chứng tỏ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon - TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Mẫu chứng Ex4 Ex3 Ex1 E1P Ex8 E10P I2P Ex6 Mẫu bệnh nhân Ex3 Ex1 Hình Kết đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron exon 10 gen giả CYP21A1P; Y đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính Hình hình ảnh tương ứng với kết người bình thường, hình bên hình ảnh tương ứng với kết bệnh nhân bị xóa đoạn dị hợp tử exon đến exon gen CYP21A2 IV BÀN LUẬN Áp dụng kỹ thuật MLPA, 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH phân tích để phát đột biến gen Kết cho thấy 34,3% bệnh nhân phát có đột biến xóa đoạn Nghiên cứu phát dạng đột biến xóa đoạn gen gồm: tồn gen (Del), exon del, exon - del, exon - del, exon - del, exon - del, exon - del exon del Kết phù hợp với dạng xóa đoạn tìm thấy nghiên cứu khác giới [5; 9] 14,3% Như đột biến xóa đoạn lớn chiếm tỷ lệ cao số đột biến tỷ lệ phù hợp với nghiên cứu chủng tộc khác Xóa đoạn lớn chiếm tỷ lệ từ 18,8% đến 45% nước châu Âu bao gồm: Phần Lan, Đan Mạch, Áo, Anh, Đức, Thụy Điển, Hà Lan, nước Đông Âu [5; 9; 10; 11] Tỷ lệ thấp đột biến xóa đoạn lớn gặp nước châu Á Trung quốc (25,4%), Nhật Bản (12%) [12; 13] Sự khác cỡ mẫu nghiên cứu khác có yếu tố chủng tộc Tỉ lệ đột biến xóa đoạn di hợp tử với allele không xác định đột biến 34,3% Nghiên cứu xác định kiểu Theo quy luật di truyền Menden, gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất cao dị hợp tử xóa đoạn Del/– (34,3%), tiếp bệnh lý di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, cần phải có allele đột biến biểu đến kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon - 3, chiếm tỉ lệ bệnh Chúng tơi giả thiết allele lại bệnh nhân đột biến điểm Do TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu áp dụng kỹ thuật MLPA để quy trình phát người mang gen bệnh xác định đột biến xóa đoạn, đột biến nhỏ đột biến điểm cần phải áp dụng chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh kỹ thuật sinh học phân tử” kỹ thuật giải trình tự gen Tương tự 67 (65,6%) bệnh nhân không phát giúp đỡ cán Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Bộ môn Nhi, Trường đột biến cần áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phát đột biến điểm Đại học Y Hà Nội; Khoa Nội tiết-Chuyển hóaDi truyền,Bệnh viện Nhi Trung ương Nghiên cứu xác định đột biến xóa đoạn đồng hợp tử gặp 20 bệnh nhân (57,2%) (bảng 1) Kết tỉ lệ đồng hợp tử phát cao so với số nghiên cứu khác Nghiên cứu Finkielstain GP cộng tìm thấy có 21% bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử Nghiên cứu bệnh nhân Hàn Quốc cho thấy đột biến đồng hợp tử TÀI LIỆU THAM KHẢO Merke D.P and Bornstein S.R (2005) Congenital adrenal hyperplasia The Lancet, 365(9477), 2125 - 2136 Gonỗalves J., Frióes A., and Moura L (2007) Congenital adrenal hyperplasia: focus on the molecular basis of 21-hydroxylase defi- xóa đoạn chiếm tỷ lệ 43,1% [14] Chúng giả thiết cho khác nghiên ciency Expert Rev Mol Med, 9(11), - 23 cứu chúng tơi có tỷ lệ cao ca thể cổ điển muối nên dẫn đến tỷ lệ cao ca có et đột biến đồng hợp tử xóa đoạn lớn Yếu tố chủng tộc góp phần vào khác biệt V KẾT LUẬN Bằng việc áp dụng kỹ thuật MLPA, nghiên cứu phát được: 35/102 (34,3%) bệnh nhân có đột biến xóa đoạn Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8% Nghiên cứu phát kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất cao dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,3%, tiếp đến kiểu gen đồng hợp tử Del/Del với 28,6%, exon White P.C., Tusie-Luna M.T., New M.I al (1994) Mutations in steroid 21- hydroxylase (CYP21) Hum Mutat, 3(4), 373 378 Wedell A., Thilén A., Ritzén E.M et al (1994) Mutational spectrum of the steroid 21hydroxylase gene in Sweden: implications for genetic diagnosis and association with disease manifestation J Clin Endocrinol Metab, 78(5), 1145 - 1152 Krone N., Arlt W (2009) Genetics of congenital adrenal hyperplasia Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 23(2), 181 - 192 van der Kamp H.J Wit J.M (2004) Neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia Eur J Endocrinol, 151(3), U71 - 75 - del chiếm tỉ lệ 14,3%, kiểu gen lại chiếm tỉ lệ thấp từ 2,9 - 5,6% Allele White P.C., Speiser P.W (2000) Congenital adrenal hyperplasia due to 21- đột biến có tỉ lệ cao Del với 47%, tiếp đến exon - del (15%), allele đột biến hydroxylase deficiency Endocr Rev, 21(3), 245 - 291 lại chiếm tỉ lệ từ - 6% Kazmi D., Bailey J., Yau M et al (2017) New developments in prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia J Steroid Bio- Lời cám ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu chem Mol Biol, 165, 121 - 123 Trapp C.M., Speiser P.W., Oberfield S.E (2011) Congenital adrenal hyperplasia: TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC an update in children: Curr Opin Endocrinol the CYP21A2 gene: an efficient multistep ap- Diabetes Obes, 18(3), 166–170 proach to the molecular diagnosis of congeni- 10 Vrzalová Z., Hrubá Z., Hrabincová E.S et al (2011) Chimeric CYP21A1P/ CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia Eur J Med Genet, 54(2), 112 - 117 11 New M.I., Abraham M., Gonzalez B et al (2013) Genotype–phenotype correlation in 1,507 families with congenital adrenal hyperplasia owing to 21-hydroxylase deficiency Proc Natl Acad Sci, 110(7), 2611 - 2616 12 Xu Z., Chen W., Merke D.P et al (2013) Comprehensive mutation analysis of tal adrenal hyperplasia J Mol Diagn, 15(6), 745 - 753 13 Asanuma A., Ohura T., Ogawa E et al (1999) Molecular analysis of Japanese patients with steroid 21-hydroxylase deficiency J Hum Genet, 44, 312 - 317 14 Choi J.-H., Jin H.-Y., Lee B.H et al (2012) Clinical phenotype and mutation spectrum of the CYP21A2 gene in patients with steroid 21-hydroxylase deficiency Exp Clin Endocrinol Diabetes Off J Ger Soc Endocrinol Ger Diabetes Assoc, 120(1), 23 - 27 Summary MLPA ANALYSIS FOR MUTATION DETECTION OF CYP21A2 GENE IN PATIENTS WITH STEROID 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency is a chromosomal recessive disease commonly caused by the CYP21A2 mutation One of the common mutations in CYP21A2 is deletion Among all methods of identifying deletion mutations, MLPA is most commonly used The study was conducted with the purpose of identifying gene deletion in congenital hypercholesterolaemia due to 21-hydroxylase deficiency using the MLPA technique Methods: 102 patients diagnosed with 21-hydroxylase-deficient CAH were analyzed by MLPA technique Results showed that 35 out of 102 (34.3%) patients were found to have CYP21A2 deletion Of which, patients with salt wasting phenotype accounted for 85.7%, simple virilizing phenotype accounted for 14.3% Homozygote mutation accounted for 57.2% and heterozygous mutation accounted for 42.8% The study identified nine mutant genotypes The mutation with highest incidence was heterozygous deletion Del/- (34.1%), followed by Del/Del with 28.6%, and homozygous deletion of exon - accounted for 14.3% The other mutations accounted for 2.9 - 5.6% Keywords: Congenital Adreanal Hyperplasia, CYP21A2 gene, deletion, MLPA TCNCYH 117 (1) - 2019 ... cứu áp dụng kỹ thuật MLPA để quy trình phát người mang gen bệnh xác định đột biến xóa đoạn, đột biến nhỏ đột biến điểm cần phải áp dụng chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh kỹ. .. Áp dụng kỹ thuật MLPA, 102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH phân tích để phát đột biến gen Kết cho thấy 34,3% bệnh nhân phát có đột biến xóa đoạn Nghiên cứu phát dạng đột biến. .. đồ Tỉ lệ thể bệnh Bằng kỹ thuật MLPA, 35/102 (34,3%) bệnh nhân phát có đột biến xóa đoạn gene CYP21A2 Trong bệnh nhân thể muối chiếm 85,7% (30 bệnh nhân), bệnh nhân thể nam hóa đơn chiếm 14,3%