Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu Enzym 21-Hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế trờng đại học y h nội [\ Trần kiêm Hảo xác định một số đột biến gen cyp21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase v phát hiện ngời lnh mang gen bệnh tóm tắt luận án tiến sĩ y học Chuyên ngành : Nhi khoa Mã số : 3.01.43 Hà Nội - 2007 Công trình đợc hon thnh tại Trờng Đại học Y H Nội Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn THị Phợng TS. Võ thị thơng lan Phản biện 1: GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi. Phạm Gia Khánh Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Thu Nhạn GS. TS. Đỗ Kim Sơn Phản biện 3: TS. Nguyễn Trần ChiếnGS. TS. Phạm Duy Hiển Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc tại Trờng Đại học Y Hà Nội Vào hồi 14 giờ 00 ngày 06 tháng 06 năm 2007 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Th viện Quốc gia - Th viện Trờng Đại học Y Hà Nội - Th viện Thông tin Y Trung ơng - Th viện Bệnh viện Trung ơng Huế - Th viện Đại học Y khoa Huế Một số công trình liên quan đến luận án 1. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Phợng, Vũ Chí Dũng, Bùi Phơng Thảo (2005), Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh ở trẻ gái, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 35(2), tr. 99-104. 2. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phợng, Võ Thị Thơng Lan (2005), Một số đột biến gen CYP21 và liên quan giữa kiểu gen- kiểu hình của bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh, Hội nghị khoa học toàn quốc 2005, Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản, hớng 8.2, Bộ Khoa học Công nghệ, tr. 8-11. 3. Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Trần Kiêm Hảo (2005), Kết quả điều trị bệnh TSTTBS trong 10 năm 1993-2002 tại BV Nhi Trung ơng, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 38(5), tr. 195-9. 4. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phợng, Võ Thị Thơng Lan (2006), ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh do thiếu 21- hydroxylase, Nhi khoa, tập 14(số đặc biệt), tr. 184-8. 1 đặt vấn đề Tăng sản thợng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một trong những bệnh thuộc hội chứng sinh dục thợng thận, đặc trng bởi sự thiếu hụt hoạt tính một trong các enzym cần thiết sinh tổng hợp hormon vỏ thợng thận. Thiếu enzym 21-hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất, chiếm 90- 95% tất cả các trờng hợp TSTTBS. Đột biến gen CYP21 gây nên thiếu hụt enzym 21-OH, bệnh di truyền đơn gen lặn, thuộc nhiễm sắc thể thờng. Hiện nay, khoảng 10- 15 kiểu đột biến CYP21 là hay gặp ở hầu hết các quần thể. Tuỳ mức độ thiếu hụt hoạt tính enzym 21-OH mà biểu hiện lâm sàng ở các mức độ nặng nhẹ khác nhau nh mất muối (mất muối), nam hoá đơn thuần (NHĐT) hay thể không cổ điển (KCĐ). Bệnh TSTTBS nếu không đợc chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến suy thợng thận cấp đe dọa tử vong; nam hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; ảnh hởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh dục, sinh sản của bệnh nhân (BN), tâm lý của gia đình và bệnh nhi khi lớn lên. Điều trị bệnh TSTTBS dựa vào liệu pháp hormon thay thế suốt đời. Dự phòng bệnh bằng cách sử dụng các biện pháp phòng bệnh di truyền nh sàng lọc phát hiện ngời lành mang gen bệnh, t vấn di truyền tiền hôn nhân, khi mang thai cho những ngời mang gen bệnh và chẩn đoán trớc sinh cho con. ở Việt Nam, cha có nghiên cứu nào về tỉ lệ mắc bệnh này. Tại khoa Nội tiết Di truyền Chuyển hoá Bệnh viện Nhi Trung ơng, số lợng bệnh nhân TSTTBS vào viện ngày càng tăng, trung bình 28 trờng hợp / năm từ 2000-2004. Việc ứng dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR để xác định các đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS thiếu 21-OH chỉ mới đợc đề cập qua 2 công trình nghiên cứu 2 của V. T. Kim Huệ và T. T. Nam. Do vậy, cần phải tiếp tục nghiên cứu sâu hơn vấn đề này. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase và phát hiện ngời lành mang gen bệnh" với các mục tiêu sau: 1. Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR. 2. Đối chiếu, tìm hiểu mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân TSTTBS do thiếu enzym 21-hydroxylase. 3. Phát hiện ngời lành mang gen bệnh cho các thành viên của gia đình bệnh nhân thiếu enzym 21-hydroxylase. Chơng 1 tổng quan ti liệu 1.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng gen CYP21 1.1.1. Vị trí, cấu trúc gen CYP21 Gen CYP21 là thành viên của nhóm Cytochrome P450c21. Gen CYP21 gồm 2 bản sao, một bản có chức năng (CYP21 hay CYP21B) và bản sao còn lại không có chức năng (CYP21P hay CYP21A). Gen CYP21 và CYP21P nằm bên trong phức hợp hoà hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, vùng 21.3 (6p21.3), cách nhau khoảng 30 kb, gần kề và xen kẽ với các gen C4B và C4A mã hoá thành phần C4 bổ thể. Gen CYP21 gối vào gen tenascin-X (TNXB) ở sợi ADN đối diện và gen CYP21P gối vào bản sao thu ngắn của gen TNXB là TNXA. 3 Hình 1.4. Vị trí của gen CYP21 bên trong phức hợp hoà hợp mô chủ yếu MHC trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen xung quanh CYP21. Nh vậy, thứ tự phân bố của các gen này nh sau: RP1-C4A- CYP21P-TNXA-RP2-C4B-CYP21-TNXB (Hình 1.4). Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của gen CYP21. Mỗi gen CYP21 và CYP21P gồm 10 exon, chiều dài 3,4 kb. Trình tự nucleotide của 2 gen này tơng đồng 98% ở các exon và 96% ở các intron. Gen CYP21P không hoạt động do mang một số đột biến ở vùng điều khiển hoặc do đột biến trầm trọng ở các vùng mã di truyền. 1.1.2. Chức năng gen CYP21 Gen CYP21 mã hoá enzym 21-OH gồm 494 acid amin. Quá trình tổng hợp enzym 21-OH của vỏ thợng thận nh sau: đầu tiên gen CYP21 phiên mã tổng hợp phân tử ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các intron, nối chính xác các exon với nhau để tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử ARNm hoàn chỉnh đợc sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH. Enzym 21-OH cùng với các enzym cholesterone desmolase, 3- hydroxysteroid dehydrogenase, aldosterone synthase và 17-OH tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thợng thận (Hình 1.2). 1 Vị trí bắt đầu sao mã cap site 3 5 2 3 4 5 87 10 69 Vùng tăng cờng Yếu tố đặc hiệu mô ATG - mã bắt đầu TAA, TGA, TAG - mã kết thúc Vùng không sao mã Vùng không sao mã 4 1.2. Sinh lý bệnh của TSTTBS Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển progesteron thành 11- deoxycorticosteron (DOC) và 17-Hydroxyprogesteron (17-OHP) thành 11-deoxycortisol. Hình 1.7. Sơ đồ rối loạn sinh tổng hợp hormon vỏ thợng thận do thiếu enzym 21-OH. Khi thiếu enzym 21-OH, progesteron không thể chuyển thành DOC và 17-OHP không thể chuyển thành 11-deoxycortisol (Hình 1.7). Hậu quả là quá trình tổng hợp aldosteron và cortisol bị khiếm khuyết, gây ứ đọng các tiền chất trớc chỗ tắc là progesteron, 17-OHP. Qua cơ chế điều hòa ngợc sẽ kích thích tăng bài tiết ACTH, từ đó tăng sản xuất các hormon theo con đờng không bị tắc (testosteron). 1.3. Lâm sàng của TSTTBS thể cổ điển 1.3.1. Mất muối Enzym 21-hydroxylase thiếu hoàn toàn (0%) hoặc có ít và nồng độ cortisol, aldosteron không thể quay về bình thờng. Bệnh nhân nặng thờng có biểu hiện suy thợng thận cấp, giảm natri máu, tăng kali máu, sốc giảm thể tích xảy ra vào tuần thứ 1-4 sau sinh và có thể dẫn đến tử vong. Các dấu hiệu sớm là nôn, tiêu chảy, mất nớc và sụt cân. Mất muối có thể gồm những triệu chứng không đặc hiệu nh giảm khẩu vị, nôn, li bì và không tăng cân. Cholesterol Pre g nenolon 11-Deox y corticosteron Pro g esteron Corticosteron Aldosteron 17-H y drox yp re g nenolon DHEA 17-Hydroxyprogesteron Androstenedion 11-Deoxycortisol Cortisol Testosteron Dih y drotestosteron Estron Estradiol 21-OH 5 Ngoài ra, bệnh nhân còn có xạm da, trẻ gái có thể phì đại âm vật và trẻ trai có thể to dơng vật. 1.3.2. Nam hoá đơn thuần Thiếu enzym 21-OH ở mức độ vừa phải (1-3%) nên quá trình tổng hợp cortisol, aldosteron vẫn còn. Trẻ gái biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài. Biểu hiện nam hoá thờng có ngay sau khi đẻ, âm vật to, các môi có thể dính với nhau. Chiều cao và tuổi xơng phát triển nhanh. Từ 10-11 tuổi, trẻ ngừng lớn và đạt chiều cao cuối cùng 140-150 cm. Khi trởng thành bệnh nhân thờng có thân hình giống đàn ông, phát triển tuyến vú kém, rối loạn chức năng buồng trứng và không có kinh nguyệt. ở trẻ nam, cờng androgen diễn ra nhanh bắt đầu từ 2-3 tuổi, gồm các dấu hiệu dậy thì sinh dục phụ sớm nh mọc lông mu, lông nách, sau đó mọc trứng cá và giọng trầm. Đồng thời dơng vật to nhanh, thờng cơng cứng, tinh hoàn vẫn nhỏ tơng ứng với tuổi. Chiều cao và tuổi xơng phát triển mạnh, từ 8-10 tuổi trẻ ngừng lớn. Một số trẻ nam không đợc điều trị có thể có vết tích vỏ thợng thận đã tăng sản. 1.4. Một số đột biến gen CYP21 và liên quan kiểu gen kiểu hình Hầu hết các đột biến gen gây thiếu 21-OH là hậu quả của một trong 2 kiểu tái tổ hợp giữa 2 gen CYP21 và CYP21P: trao đổi chéo qua lại không tơng xứng trong quá trình gián phân gây mất đoạn gen; hay chuyển đoạn gen khiến các đột biến từ CYP21P chuyển sang CYP21. Hình 1.8. Vị trí các đột biến gen CYP21 thờng gặp và kiểu hình. Khôn g cổ điển Nam hoá đơn thuần Mất muối 6 Đột biến gen CYP21 có thể chia thành 4 nhóm tùy thuộc vào mức độ hoạt tính 21-OH. Nhóm thứ nhất (nhóm A) bao gồm các đột biến gen CYP21 trầm trọng nh mất đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa, dịch khung (nh mất 8bp ở exon 3, đột biến điểm I2g ở intron 2 ) làm mất hoàn toàn hoạt tính 21-OH; thờng liên quan với thể MM của bệnh, bất kể kiểu gen là đồng hợp tử hay dị hợp tử đột biến. Nhóm thứ hai (nhóm B) chủ yếu là đột biến nhầm nghĩa Ile172Asn, khiến cho hoạt tính 21-OH chỉ còn 1-2% và đợc tìm thấy đặc trng ở thể NHĐT. Nhóm thứ ba (nhóm C) bao gồm những đột biến nh Val281Leu, Pro30Leu và Pro453Ser tạo nên enzym 21-OH với hoạt tính 20-60%; những đột biến này liên quan đến thể bệnh không cổ điển. Nhóm thứ t (nhóm D) bao gồm các đột biến cha đợc sắp xếp còn lại và các đột biến mới. 1.5. Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Phản ứng PCR do Kary Mullis và cs phát minh năm 1985. PCR cho phép nhân một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong genome đạt đến số lợng mong muốn khi biết trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn ADN đó. Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép ADN. Các bớc cơ bản của phản ứng PCR đợc mô tả bởi hình 1.9. Mỗi chu kỳ phản ứng đòi hỏi 3 bớc: + Biến tính (denaturation): Phân tử ADN đợc xử lý ở nhiệt độ cao để tách ADN khuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thờng là 94-95 0 C. + Gắn mồi (annealing): Nhiệt độ hạ thấp dới nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn ADN khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. + Tổng hợp bởi Taq-polymerase (synthesis): Taq sử dụng 4 loại dNTP để kéo dài sợi mồi, tổng hợp sợi ADN mới. 7 3 bớc cơ bản tạo thành 1 chu kỳ trong phản ứng PCR. Khi các chu kỳ đợc lặp lại, các đoạn ADN vừa đợc tổng hợp ở các chu kỳ trớc trở thành khuôn cho chu kỳ sau. Số lợng phân tử ADN tạo ra tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thờng không quá 60. Hình 1.12. Các bớc cơ bản của phản ứng chuỗi trùng hợp PCR. Khuếch đại gen CYP21 bằng PCR Do giả gen CYP21P có tính tơng đồng cao, việc khuếch đại gen CYP21 không dễ thực hiện. Các mồi phải đợc chọn lựa để nhận biết các trình tự ở CYP21 mà không có ở CYP21P. Hầu hết các tác giả đều sử dụng 2 đoạn mà ở đấy CYP21 khác với CYP21P. Đó là đoạn 8 bp ở exon 3 của CYP21 (nhng đã bị mất ở CYP21P) và một số các đột biến ở exon 6 (gồm các khác biệt 4 nucleotide giữa CYP21 và CYP21P). Bằng phơng thức này, gen CYP21 có thể đợc khuếch đại thành 2 đoạn gối chồng lên nhau (Hình 1.13). Hình 1.13. Hai đoạn gen CYP21 đợc khuếch đại gối lên nhau. [...]... và cs vẫn gặp một tỉ lệ lớn 20% các allen không thể xác định kiểu gen đột biến dù đã sàng lọc đợc 17 kiểu đột biến gen CYP21 thờng gặp, điều này gợi ý BN mang đột biến mới cha rõ 3 Kiểu gen và kiểu hình của các đột biến gen CYP21 Bảng 3.8 Kiểu gen và kiểu hình của các đột biến gen CYP21 Kiểu hình Kiểu gen I2g đơn thuần Kiểu dị hợp tử kép I2g+8bp 8bp đơn thuần Pro30Leu Đột biến khác Tổng số ĐHT DHT ĐHT... số đột biến gen CYP21 đợc phát hiện gây bệnh TSTTBS - Tỉ lệ bệnh nhân TSTTBS thiếu enzym 21-hydroxylase bị đột biến I2g, mất đoạn 8bp và Pro30Leu là 55,8% 44,2% bệnh nhân còn lại cha phát hiện đợc đột biến gen CYP21 24 - Đột biến điểm I2g ở intron 2 lần đầu tiên đợc phát hiện ở Việt Nam, chiếm tỉ lệ 22,1% các allen bệnh TSTTBS - Đột biến Pro30Leu ở exon 1 cũng là lần đầu tiên đợc phát hiện ở Việt Nam,... thấy I2g là một trong những kiểu đột biến gen CYP21 thờng gặp và là đột biến điểm thờng gặp nhất của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS cổ điển Tại Việt Nam, nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên phát hiện đột biến điểm I2g Trên thế giới, đột biến này đã đợc tìm thấy từ năm 1988 bởi Higashi và cộng sự (cs) Nhiều tác giả phát hiện đột biến điểm I2g với tỉ lệ tơng tự kết quả của chúng tôi, theo Bachega và cs ở Brazil,... phát hiện Đến nay, khoảng 100 kiểu đột biến gen CYP21 đã đợc tìm thấy và hầu hết là đột biến điểm Mất đoạn nhỏ, đột biến chèn nucleotide cũng đã đợc báo cáo 10-15 kiểu đột biến thờng gặp chiếm 90-95% các allen, các đột biến này xuất phát từ việc tái tổ hợp tơng tác gen của các trình tự ADN giữa CYP21 và CYP21P, trong khi các đột biến còn lại (5-10% các allen) là những đột biến tự nhiên Bachega và cs... đột biến gen có thể giúp xác định anh chị em, nhất là các anh trai mang cùng đột biến (trờng hợp chỉ điểm) hay thậm chí đột biến khác không bị nghi ngờ Kết luận Nghiên cứu đợc thực hiện trên 43 bệnh nhân TSTTBS thiếu enzym 21-hydroxylase cổ điển Tỉ lệ nam nữ tơng đơng Bệnh nhân thể mất muối (72,1%) gặp nhiều hơn thể nam hoá đơn thuần (27,9%) Chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1 Một số đột biến gen. .. Trần Văn T và chị gái Trần Thị Ng, có cùng kiểu hình NHĐT, cha phát hiện đột biến I2g hay mất đoạn 8bp Bố mẹ của BN cũng không thấy mang gen I2g hay mất đoạn 8bp Nh vậy, kiểu đột biến gen CYP21 trong trờng hợp này có thể là những đột biến khác mà chúng tôi cha có điều kiện phát hiện Phân tích kiểu gen CYP21 của 65 gia đình có con mắc bệnh TSTTBS từ năm 1995-1998, Lee và cs xác định 3 đột biến thờng... kiểu đột biến gen I2g (87,5%), mất đoạn 8bp (80%) và dị hợp tử kép I2g+8bp (60%) liên quan với kiểu hình TSTTBS thể mất muối, chỉ một số ít các đột biến này gặp ở thể nam hoá đơn thuần - Bệnh nhân mang đột biến mất đoạn 8bp có triệu chứng lâm sàng nặng nề hơn Bệnh nhân nữ bị nam hoá với Prader týp III-IV Biến đổi sinh hoá và hormon của các kiểu đột biến gen CYP21 cha có sự khác biệt 3 Phát hiện ngời lành. .. 1,2% các allen bệnh TSTTBS - Đột biến mất đoạn 8bp ở exon 3 chiếm tỉ lệ cao nhất, 27,9% tổng số các allen bệnh TSTTBS - Kiểu gen dị hợp tử kép I2g+8bp cũng thờng gặp, chiếm tỉ lệ 11,6% số bệnh nhân Qua nghiên cứu này, mất đoạn 8bp là những đột biến gen CYP21 hay gặp nhất, rồi đến đột biến I2g, còn đột biến Pro30Leu ít gặp 2 Mối liên quan kiểu gen và kiểu hình bệnh TSTTBS thiếu enzym 21-hydroxylase. .. thấy kiểu gen Pro30Leu+I2g ở thể MM 4 Tình hình mang gen bệnh của một số thành viên gia đình bệnh nhân TSTTBS Gia đình số 1: I/ () (I2g+8bp) II/ ĐHT (I2g+8bp) II-8 II-9 Hình 3.14 Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 1 21 Bệnh nhân Nguyễn Văn Th, kiểu gen đồng hợp tử I2g kết hợp đồng hợp tử mất đoạn 8bp, kiểu hình MM Bố không phát hiện mang gen Mẹ mang gen bệnh I2g kèm 8bp Gia đình số 4: ()... A/C656G Enzym giới hạn AciI HhaI Kích thớc đoạn ADN (bp) Bình thờng Đột biến 158 150 89 81/9 153/43 196 378 354/24 2.2.2 Đối chiếu kiểu đột biến gen và đặc điểm kiểu hình Các BN có kết quả đột biến gen CYP21 sẽ đợc chia thành các nhóm theo từng kiểu đột biến gen và đối chiếu với các triệu chứng lâm sàng MM hay NHĐT cũng nh các xét nghiệm sinh hóa Từ đó xác định mức độ nặng nhẹ của từng kiểu đột biến gen