Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X, gây nên do đột biến gen dystrophin. Đột biến mất đoạn chiếm khoảng 60 - 65%, đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 5 - 10%, còn lại là đột biến điểm chiếm khoảng 30 - 35%. Xác định chính xác đột biến gen cho bệnh nhân đóng vai trò quan trọng giúp phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình và hướng tới liệu pháp điều trị gen.
2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA XÁC ðỊNH ðỘT BIẾN GEN DYSTROPHIN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Trần Huy Thịnh1, Trần Vân Khánh1, Phạm Lê Anh Tuấn1, Vũ Chí Dũng2 Trường ðại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Loạn dưỡng Duchenne (DMD) loạn dưỡng Becker (BMD) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính X, gây nên đột biến gen dystrophin ðột biến ñoạn chiếm khoảng 60 - 65%, ñột biến lặp đoạn chiếm khoảng - 10%, lại ñột biến ñiểm chiếm khoảng 30 - 35% Xác ñịnh xác đột b iến gen cho bệnh nhân đóng vai trò quan trọng giúp phát người lành mang gen bệnh cho thành viên gia đình hướng tới liệu pháp ñiều trị gen Trước ñây, kỹ thuật multiplex PCR ñã ñược sử dụng phổ biến ñể xác định đột b iến xóa đoạn gen dystrophin, nhiên kỹ thuật phát ñược ñột b iến vùng trọng ñiểm vùng 5’ tận vùng trung tâm, khơng phát đột biến ngồi vùng trọng điểm đột biến lặp đoạn Kỹ thuật MLPA có ưu điểm phát nhanh xác đột biến xóa đoạn lặp đoạn toàn b ộ 79 exon gen dystrophin ñã ñược ứng dụng rộng rãi năm gần ñây Trong nghiên cứu này, kỹ thuật MLPA ñã ñược ứng dụng ñể xác ñịnh ñột 89 bệnh nhân DMD/BMD Chúng tơi phát thấy 56 (63%) b ệnh nhân có đột b iến xóa đoạn, (6%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin ðột biến xóa đoạn tập trung chủ yếu vùng exon 40 - 55 - 21, ñó ñột b iến lặp ñoạn tập trung chủ yếu vùng exon - 20 Từ khóa: Loạn dưỡng Duchenne/Becker, MLPA I ðẶT VẤN ðỀ hơn, triệu ng lâm s àng nhẹ thời Loạn dưỡng Duchenne (Duchenne gian tiến triển chậm hơn, bệnh nhân loạn Muscular Dystrophy – DMD) loạn dưỡ ng dưỡng Becker có sống kéo dài Becker (Becker Muscular Dystrophy – [2; 3] BMD) nhữ ng bệnh lý di truyền thường gặp nhất, có tần suất mắc bệnh Xác định vị trí đột biến gen dystrophin cho bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne bước vào khoảng 1/3.500 trẻ t rai [1] Loạn dưỡ ng ñầu tiên quan trọng ñể chẩn ñoán trước sinh, Duchenne bệnh nặng với biểu tư vấn di truyền ñiểm cho liệu pháp lâm sàng mang tính chất tuần tiến, trẻ bị gen bệnh loạn dưỡng Duchenne teo cơ, khả ñi lại thườ ng tử vong tương lai [4; 5] Gen dystrophin nằm vị trí trước tuổi trưởng thành suy tim rối loạn Xp21 nhiễm sắc thể X, chiều dài hô hấp Loạn dưỡng Becker dạng 2400 Kb, mã hóa 14-kb mRNA, gen người thể nhẹ c loạn dưỡng Duchenne Phân dài ñược biết cho ñến Gen dystro- biệt loạn dưỡ ng Becker với loạn dưỡng phin tổng hợp nên protein dystrophin, pro- Duchenne lứa tuổi xuất bệnh muộn tein đóng vai trò quan trọng để bảo vệ trình co ðột biến gen dystrophin dẫn đến tồn vẹn protein dystro- ðịa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội Email: vankhanh73md@yahoo.com Ngày nhận: 10/08/2015 Ngày ñược chấp thuận: 9/9/2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 phin, gây nên bệnh loạn dưỡng Duc henne/ loạn dưỡng Becker [6] Trong dạng đột biến gen dystrophin, đột biến xóa ñoạn chiếm tỷ lệ cao (60 - 65%), ñột biến lặp đoạn TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC chiếm khoảng - 10%, lại đột biến + Ngun lý: Sử dụng 79 đoạn dò gen điểm, chiếm khoảng 30 - 35% [7] Có nhiều dystrophin Mỗi probe gồm hai chuỗi oligonu- phương pháp xác ñịnh ñột biến xóa đoạn gen cleotid, DNA (probe) lai đặc hiệu với 79 ex on song gen dystrophin lớ n với 79 chuỗi ngắn chuỗi dài Mỗi exon, nên phương pháp kinh ñiển PCR, multiplex P CR thường bị hạn chế chuỗi có vị trí quan trọng: (1) vị trí liên kết đặc hiệu liền kề trình tự exon mặt thời gian thườ ng phát đích, tạo điều kiện cho enzym ligase gắn ñột biến vùng trọng ñiểm vùng 5’ tận chuỗi thành probe hoàn chỉnh Nếu gen bị đột vùng trung tâm, khơng phát đột biến, probe tương ứng với exon bị xóa khơng biến ngồi vùng trọng điểm đột biến lặp hình thành sợi oligonucleotid khơng đoạn [8 - 10] MLPA (Multiplex Ligation- lại gần ñược với nhau; (2) vị trí gắn mồi dependent Probe Amplification) kỹ thuật xác khuếch đại probe, có trình tự giống hệt nhau, ñịnh ñột biến xóa ñoạn lặp ñoạn nhanh nên cần cặp mồi để khuếch chóng, xác, ứng dụng rộng đại tất probe rãi [11 - 14] ðề tài ñược tiến hành với mục Riêng chuỗi dài có thêm đoạn ñệm tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA xác ñịnh ñôt gồm số nucleotid khác nhau, nhờ biến gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng probe có khác biệt k ích thước, giúp Duchenne/Becker phân tách ñiện di mao quản sau khuếch II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ñại probe Kết ñiện di c ho 79 đỉnh có ðối tượng 89 bệnh nhân ñược chẩn ñoán bệnh loạn dưỡng Duchenne/Becker Khoa Nội tiết, Chuy ển hoá, Di t ruyền, bệnh viện Nhi Trung ương dựa vào dấu hiệu lâm sàng cận lâm sàng điển hình: bệnh nhân có dấu hiệu yếu cơ, lại hay vấp ngã, phì đại cẳng chân, dấu hiệu Gower dương tính, hoạt độ enzym Creatine kinase (CK) tăng cao máu 12 000 UI/l (bình thường 200 UI/l) Phương pháp - Quy trình l+y m-u: 2ml máu tĩnh mạch chống đơng EDTA, đảm bảo tuyệt đối vơ trùng - Quy trình tách chi 2t DNA t6ng s9: theo quy trình phenol/chloroform Nồng ñộ ñộ tinh DNA ñược kiểm tra phươ ng pháp quang phổ (OD 260/280) - Quy trình k< thu=t MLPA xác đCnh đDt bi2n gen kích thước tương ứng với 79 probe ñặc hiệu với 79 exon, exon bị xố đoạn đỉnh c exon khơng phát Với đột biến lặp đoạn, kết tính tốn dựa vào tỉ lệ RPA (Relative Peak Area) tương ứng với exon so với mẫu ng người bình thường, RPA exon tính cường độ tín hiệu tương ứng (As – Peak area) chia cho tổng cường độ tín hiệu 45 ñỉnh probemix (ΣAs), exon lặp ñoạn mà tỉ lệ RPA lớn 1,5 + Tiến hành: Cho µl DNA cần phân tích vào ống P CR, biến tính 98oC/5 phút Nhiệt độ ñược chuyển 2oC trước cho µl hỗn hợp chứa ñoạn oligonucleotid probe Hỗn hợp ñược ủ 60oC/16 giờ, lúc ñoạn lai c phân tử oligonucleotid gắn với exon ñích ñặc hiệu vị trí s át Thêm 32 µl hỗn hợp ligase buffer, ủ 54oC/ 15 phút, enzym ligase nối ñoạn oligonucleotid probe với Phản ứng nối chấm dứt tăng nhiệt ñộ lên 98o C/5 phút, hỗn hợp TCNCYH 96 (4) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC giữ 4oC Khuếch đại sản phẩm lai: khơng muốn tham gia Các thơng tin liên quan Thêm 10 µl sản phẩm lai vào 30 µl hỗn hợp đến bệnh nhân ñược ñảm bảo bí mật o PCR buffer, giữ 60 C trước thêm 10 µl hỗn hợp P CR master, thực chu trình III KẾT QUẢ nhiệt: [95oC/30 giây, 60o C/30 giây, 72o C/1 phút] x 35 chu kỳ, 72oC/20 phút; sản phẩm gen kỹ thuật MLPA, kết cho thấy, ñược bảo quản 4oC Sản phẩm khuếch ñại ñã phát ñược 56 (63%) bệnh nhân có probe điện di mao quản huỳnh quang đột biến xóa đoạn, (6%) bệnh nhân có đột máy giải trình tự để phân tích kết biến lặp đoạn gen dystrophin ðột biến xóa Nếu có đột biến xóa đoạn, probe khơng gắn đoạn phát t ập t rung vùng ñột vào gen đích, kết điện di biến t rọng ñiểm vùng 5’ tận (exon - 21) khơng xuất đỉnh tương ứng exon ñột chiếm tỉ lệ 13% vùng trung t âm (exon 40 - biến [11] Xác ñịnh ñột biến xóa đoạn lặp đoạn 55) chiếm tỉ lệ 73%, ñột biến k éo dài từ vùng ðạo ñức nghiên cứu Các đối tượng tham gia hồn tồn tự nguyện có quy ền rút khỏi nghiên cứu k hi 5’ tận ñến vùng t rung tâm chiếm tỉ lệ 14% ðột biến lặp ñoạn tập t rung chủ yếu vùng exon - 20 Kết phân tích đột biến xóa đoạn kỹ thuật MLPA bệnh nhân MS53 Hình Kết MLPA phân tích DNA bệnh nhân MS53 (A) chứng nam P34 (B) bệnh nhân MS53 với probmix P34 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình ảnh phân tích kết MLPA bệnh nhân MS53 có đỉnh tương ứng với Probe đặc hiệu cho exon 44, ñỉnh tương ứng với exon khác khơng có khác biệt so với chứng nam Kết chứng tỏ bệnh nhân có đột biến xóa đoạn exon 44 Kết phân tích đột biến lặp ñoạn kỹ thuật MLPA bệnh nhân MS12 E62 A B C Hình Kết MLPA phân tích DNA bệnh nhân MS12 (A) chứng nam P34; (B) bệnh nhân MS12 với probmix P34; (C) kết phân tích dựa RPA TCNCYH 96 (4) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ðối với bệnh nhân MS 12, hình ảnh MLPA probe tương ứng với ex on 62 thấy cường độ tín hiệu ñỉnh cao so với c hứng nam Sau phân tích dựa RPA có tỉ lệ RP R exon 62 bệnh nhân so với chứng nam lớn hơ n 1,5 exon khác giao ñộng xung quanh Như vậy, chứng tỏ bệnh nhân có đột biến lặp đoạn đơn lẻ exon 62 IV BÀN LUẬN 19 exon hay xảy ñột biến xóa ñoạn gen Kỹ thuật MLPA với phản ứng MLPA - dystrophin mà chưa khuyếch ñại 60 exon 034 MLPA - 035 thực ñể xác lại Kết phát ñược gần 55% số bệnh định đột biến xóa đoạn gen dystrophin cho 89 nhân DMD có đột biến xóa đoạn, so với tỉ lệ bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne/Becker, phản ứng khuếch ñại 50% tổng số exon, thường gặp 60% ðiều chứng tỏ cần phản ứng PCR khuếch đại tồn 79 exon gen mức ñộ DNA Như vậy, ÷ ngày xác định đột biến x óa đoạn lặp đoạn tất vị trí gen dystrophin [11 - 14] ðây ưu ñặc biệt mà phương pháp P CR truyền thống khơng có [8 - 10] Kết xác ñịnh 56 (63%) bệnh nhân có ñột biến xóa ñoạn, (6%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin, kết tương tự số nghiên cứu trước khoảng gần - 10% ñột biến nằm ngồi vùng 19 exon hay xảy đột biến xóa đoạn Nếu khuếch đại 60 exon lại phải cần 60 phản ứng PCR tốn thời gian hóa chất Kỹ thuật RT- PCR có ưu so với kỹ thuật PCR multiplex PCR xác định đột biến xóa đoạn t ồn gen dystrophin mức độ mRNA cần 15 c ặp mồi, cải thiện ñáng kể nhược điểm c phương pháp chẩn đốn mức ñộ DNA Tuy ñây sử dụng kỹ thuật MLPA ñể xác ñịnh ñột nhiên, việc xác ñịnh ñột biến gen mức ñộ biến [7; 11 - 14] So sánh với nghiên cứu mRNA phải ÷ tuần, mặt khác khác Việt Nam kết có cao hơn, mRNA dễ bị phân hủy nên quy trình tách điều lý giải cỡ mẫu nghiên cứu khác sử dụng chiết, bảo quản phân tíc h cần thao phương pháp xác định ñột biến khác [4; phục nhược ñiểm phươ ng pháp kinh 8; 9] Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật MLPA ñiển với việc sử dụng DNA làm khn nên khơng bỏ sót đột biến Trong nghiên cứu khuếch đại tồn gen dystrophin với này, đột biến xóa đoạn phát t ập phản ứng PCR cho kết phân tích trung vùng ñột biến trọng ñiểm vùng 5’ xác nhanh chóng tận (ex on - 21) chiếm tỉ lệ 13% vùng trung t âm (ex on 40 - 55) c tỉ lệ 73%, ñột tác cẩn trọng ñặc biệt Kỹ thuật MLPA ñã khắc V KẾT LUẬN biến kéo dài từ vùng 5’ tận ñến vùng trung tâm Nghiên cứu ñã áp dụng thành công kỹ chiếm tỉ lệ 14% Kết tương tự thuật MLPA phân tích đột biến xóa đoạn nghiên cứu tác giả Việt Nam lặp ñoạn gen dystrophin bệnh nhân giới [7 - 14] loạn dưỡng Duchenne/Becker Kết ñã Trước ñây, ñể xác ñịnh ñột biến mức ñộ xác ñịnh 56 (63%) bệnh nhân có đột biến xóa DNA, người ta sử dụng kỹ thuật P CR đoạn, (6%) bệnh nhân có ñột biến lặp ñoạn gen dystrophin multiplex PCR với 19 cặp mồi ñể khuyếc h ñại TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Lời cảm ơn Trần Vân Khánh, Matsafumi Matsuo ðề tài ñược thực với hỗ trợ kinh cộng (2004) Chẩn đốn 85 bệnh nhân phí đề tài cấp nhà nước KC.04.08-11/ 15 Việt Nam mắc bệnh nhược Duc henne/ “Nghiên cứu xây dựng quy trình điều trị gen Becker phương pháp PCR Tạp chí Y cho bệnh loạn dưỡng Duchenne” học Việt Nam, 33 - 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Harvey B (1992) Neuromuscular Disorders Nelson textbook of pediatrics, 12th edition, 1539 - 1560 Matsuo M Poh-san Lai, Van Khanh Tran (2002) Comparative study on deletions of dystrophin gene in three Asian populations J Hum Genet, 47, 552 - 555 10 Chamberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier (2002) Duc henne and J.E., Nguyen P.N., Caskey C.T (1998) Dele- Becker muscular dystrophy: from molecular tion screening of the Duchenne muscular dys- diagnosis to gene t herapy IUB MB Life, 53, trophy locus via multiplex DNA amplification 147 - 152 Nucleic Acids Res, 16, 11141-11156 Mendell R.J., Griggs C R (1991) 11 Kent K.S Lai, Ivan F.M Lo (2006) Muscular dystrophin Harrison’s principles of Detecting ex on deletions and duplications of internal medicine, 12th edition, 2112 - 2118 the DMD gene using Multiplex Ligation- Nguyễn Thị Băng Sương (2009) Xác ñịnh ñột biến ñoạn gen dystrophin gây dependent Probe Amplification (MLPA) Clinical Biochemistry, 39, 367 - 372 bệnh loạn dưỡng Duc henne mức ñộ 12 Marzese D.M., Mampel A., Gomez mRNA phát người lành mang gen bệnh Luận án Tiến sỹ Y học, Trườ ng ðại học L.C., Echeverria M.I (2008) Detection of de- Y Hà Nội, 41 - 42 cular Dystrophy gene by the molecular method Van Deutekom JC, van Ommen GJ (2003) Advances in Duchenne Muscular Dystrophy gene therapy Nat Rev Genet, (10), 774 - 883 Yaffe D (2002) The Duchenne muscular letions and duplications in the Duchenne MusMLPA in the first Argentine affected families Genetic and Molecular Research, 7, 223 - 233 13 Hwa H.L., Chang Y.Y., Chen C.H et al (2007) Multiplex Ligation-dependent P robe Amplification identification of deletions and dystrophy gene: Structure, evolution, expres- duplications sion and function of products Mol Cell Bio, dystrophy of the Duchenne muscular gene in Taiwanese 324 - 326 J Formos Med Assoc, 106, 339 - 346 subjects Takeshima Y, Yagi M, Okizuka Y et al 14 Lai K K., Lo I.F., Tong T.M (2006) (2010) Mutation spectrum of the dystrophin Detecting ex on deletions and duplications of gene in 442 Duchenne/Becker muscular dys- the DMD gene using Multiplex Ligation- trophy cases from one Japanese referral center J Hum Genet, 55(6), 379 - 388 dependent P robe Amplification (MLPA) Clin Biochem, 39, 367 - 372 TCNCYH 96 (4) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary USE OF MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE APLICATION FOR DUCHENNE/BECKER MUSCULAR DYSTROPHY GENE MUTATION ANALYSIS Duchenne (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD) are X - linked recessive disorders, caused by mutations in the dystrophin gene Deletions account for approximately 60 - 65% of mutations, duplications for - 10% The remaining cas es are mainly point mut ations Genetic diagnosis of the proband becomes crucial, and forms the base for carrier analysis, genetic counselling and eligibility for therapeutic strategies Traditional multiplex PCR assay is the common method used to detect DMD gene deletions, mainly in the ho t- spot region Deletions of exons outside the hot - spot or duplications are often left without precise genetic diagnosis and require efficient dosage/quantitative analysis Recently, MLPA is powerful and effective in detection of deletions and duplications in 79 exon of dystrophin gene In t his study, we used multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) t o study deletions and duplications in the DMD gene in 89 DMD/BMD patients clinically diagnosed as BMD/DMD We identified 56 DMD/BMD case with deletions and cases with duplications Deletions involved mainly exons 40 - 55 and - 21, whereas most duplications involved exons - 20 Keywords: Duchenne and Becker muscular dystrophy DMD/ BMD, MLP A TCNCYH 96 (4) - 2015 ... ñoạn gen dystrophin bệnh nhân giới [7 - 14] loạn dưỡng Duchenne/Becker Kết ñã Trước ñây, ñể xác ñịnh ñột biến mức ñộ xác định 56 (63%) bệnh nhân có đột biến xóa DNA, người ta sử dụng kỹ thuật. .. xảy đột biến xóa đoạn Nếu khuếch đại 60 exon lại phải cần 60 phản ứng PCR tốn thời gian hóa chất Kỹ thuật RT- PCR có ưu so với kỹ thuật PCR multiplex PCR xác định đột biến xóa đoạn t ồn gen dystrophin. .. vậy, chứng tỏ bệnh nhân có ñột biến lặp ñoạn ñơn lẻ exon 62 IV BÀN LUẬN 19 exon hay xảy đột biến xóa đoạn gen Kỹ thuật MLPA với phản ứng MLPA - dystrophin mà chưa khuyếch đại 60 exon 034 MLPA -