Xác định đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

Nội dung bài viết với mục tiêu: (1) xác định đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật giải trình tự gen và scorpions ARMS, (2) so sánh kết quả phát hiện đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật giải trình tự gen và kỹ thuật scorpions ARMS.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHƠNG TẾ BÀO NHỎ Nguyễn Minh Hà* TĨMTẮT Đặt vấn đề: Liệu pháp điều trị trúng đích (LPĐTTĐ) liệu pháp điều trị mới, hứa hẹn có hiệu cho bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN); hiệu biểu rõ nhóm bệnh nhân có đột biến gen EGFR Mục tiêu nghiên cứu: (1) Xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN kỹ thuật giải trình tự gen Scorpions ARMS,(2) So sánh kết phát đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN kỹ thuật giải trình tự gen kỹ thuật Scorpions ARMS Đối tượng, phương pháp nghiên cứu: 70 bệnh nhân UTPKTBN; sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification Refractory Mutation System) để xác định đột biến gen EGFR Kết quả: 25/70 (35,71%) bệnh nhân UTPKTBN có đột biến exon 18, 19, 21 gen EGFR; tỷ lệ dạng đột biến G719S (exon 18), LREA deletion (exon 19) L858R (exon 21) 4%, 56% 40% Kết luận: (1) Bằng kỹ thuật giải trình tự gen Scorpions ARMS phát đột biến gen EGFR với tỷ lệ 35,71% (25/70); (2) Kết phát đột biến gen EGFR kỹ thuật giải trình tự Scorpions ARMS tương đồng Từ khóa: Ung thư phổi tế bào khơng nhỏ; đột biến gen EGFR; liệu pháp điều trị trúng đích ABSTRACT IDENTIFYING OF EGFR MUTATION IN NON SMALL CELL LUNG CANCER Nguyen Minh Ha * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - No - 2013: 34 - 37 Background: Targeted therapy is an effective method for treatment of non small cell lung cancer (NSCLC) However, the response was demonstrated only in EGFR-mutated NSCLC patients Objectives: (1) Identifying EGFR mutations in NSCLC patients by sequencing and Scorpion ARMS methods, (2) Comparing sequencing and Scorpions ARMS techniques in identifying EGFR mutations of NSCLC Methods: 70 NSCLC patients were studied; using sequencing and Scorpions ARMS (ScorpionsAmplification Refractory Mutation System) to identify mutations Results: 25/70 (35,71%) NSCLC patients have EGFR mutations in exon 18, 19, 21; the rates of mutation G719S (exon 18), LREA deletion (exon 19) and L858R (exon 21) were 4%, 56% and 40%, respectively Conclusion: Identifying EGFR mutations in NSCLC by sequencing and Scorpion ARMS has the same results in most of the cases Keywords: Non small cell lung cancer; EGFR mutation; Targeted therapy Nam, ung thư phổi loại ung thư phổ biến ĐẶTVẤNĐỀ có tỷ lệ tử vong cao nhất(2,3) Mối liên Hiện nay, toàn giới Việt quan việc hút thuốc ung thư phổi * Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Tác giả liên lạc: ThS.BS.Nguyễn Minh Hà ĐT: 0989212382 34 Email: nguyenminhha@pnt.edu.vn Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 làm sáng tỏ; ngày nhiều chế phân tử trình phát sinh, phát triển ung thư phổi tìm ra(5,7) 80-90% trường hợp ung thư phổi thể khơng tế bào nhỏ, lại thể tế bào nhỏ Khác với khối u đặc khác, đến nay, khó phát sớm khối ung thư phổi, hầu hết trường hợp phát rơi vào giai đoạn tiến triển di Mặc dù có nhiều tiến phương thức điều trị phẫu thuật, hóa trị xạ trị, tỷ lệ sống toàn thể sau năm bệnh nhân ung thư phổi thấp, xấp xỉ 15%(2) Trong năm gần đây, y học phát nhiều đích phân tử bệnh học tiềm ung thư phổi, thúc đẩy đời dược phẩm giúp ức chế hoạt động chúng, kéo dài thời gian sống nâng cao chất lượng sống người bệnh Đó chất ức chế hoạt tính tyrosine kinase thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR – epidermal growth factor receptor) gồm gefitinib erlotinib, gọi liệu pháp điều trị trúng đích (LPĐTTĐ) Nhiều nghiên cứu chứng minh mối liên quan chặt chẽ đột biến gen EGFR với mức độ đáp ứng thuốc khối u LPĐTTĐ Khoảng 10−40% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) có đột biến exon 18, 19, 20 21 gen EGFR Các đột biến mã hóa nên protein EGFR có lực mạnh với thuốc điều trị đích, bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến gen EGFR thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích(4) Việc xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN cung cấp thông tin quan trọng cho bác sĩ lâm sàng để định LPĐTTĐ Có nhiều kỹ thuật phát đột biến gen EGFR độ nhạy kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tế bào ung thư mẫu mô Hai kỹ thuật sử dụng phổ biến giải trình tự gen Scorpions ARMS Kỹ thuật giải trình tự gen có giá thành cạnh tranh khơng phát đột biến gen mẫu mơ có tế bào đột biến Kỹ Nghiên cứu Y học thuật Scorpions ARMS có độ nhạy cao phát đột biến gen EGFR alen đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ; giá thành cao nên khó áp dụng số lượng lớn bệnh nhân Với mục đích áp dụng kết xét nghiệm đột biến gen EGFR để định hướng điều trị cho bệnh nhân UTPKTBN Việt Nam, đề tài nghiên cứu thực với mục tiêu: (1) Xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN kỹ thuật giải trình tự gen Scorpions ARMS, (2) So sánh kết phát đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN kỹ thuật giải trình tự gen kỹ thuật Scorpions ARMS ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu 70 mẫu mô bệnh nhân UTPKTBN thu thập Bệnh viện K Trung Ương, Bệnh viện Hữu Nghị Bệnh viện Bạch Mai Bệnh nhân chẩn đoán xác định dựa vào kết mô bệnh học không mắc ung thư khác Các mẫu mô ung thư phổi đúc parafin, tìm đột biến gen EGFR Trung Tâm Nghiên Cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp nghiên cứu - Kỹ thuật tách chiết DNA: Mẫu mơ lựa chọn xác vùng tế bào ung thư Parafin loại bỏ xylen DNA tách chiết theo qui trình phenol/chloroform Nồng độ độ tinh DNA xác định máy Nano-Drop, mẫu DNA đạt giá trị OD 280/OD260 ≥ 1.8 sử dụng để phân tích - Kỹ thuật giải trình tự gen: Sau khuyếch đại exon 18, 19, 20, 21 gen EGFR kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR tinh từ gel agarose Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA), sau giải trình tự phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự EGFR kiểu dại 35 Nghiên cứu Y học GeneBank (National center for biotechnology information, NCBI) - Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS): kết hợp kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) công nghệ Scorpions phản ứng Real-time PCR để phát đột biến Quy trình kỹ thuật theo Kit hãng QIAGEN(6) KẾTQUẢ Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 biến GGC>AGC vị trí 2155 exon 18 gen EGFR (đột biến G719S)(Hình 1C) Kết giải trình tự phát thấy đột biến EGFR bệnh nhân khác; bệnh nhân MS76 nghi ngờ mang đột biến L858R (tín hiệu đột biến thấp) (Hình 2A) Bệnh nhân kiểm tra lại với kỹ thuật Scorpions ARMS, kết cho thấy có đột biến L858R (Hình 2B) Tổng hợp kết kỹ thuật xác định 25/70 bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến gen EGFR (Bảng 1) B Hình Kết giải trình tự gen EGFR (A) Hình ảnh đột biến L858R exon 21; (B) Hình ảnh đột biến xóa đoạn 15 nucleotit (LREA deletion), mũi tên vị trí bắt đầu có đột biến xóa đoạn exon 19; (C)Hình ảnh đột biến G719S exon 18 Nhận xét: Bệnh nhân MS08 mang đột biến CTG>CGG vị trí 2573 thuộc exon 21 gen EGFR (đột biến L858R) (Hình 1A); bệnh nhân MS39 bị đột biến xóa 15 nucleotit vị trí 2235 thuộc exon 19 gen EGFR (đột biến LREA deletion) (Hình 1B); bệnh nhân MS102 bị đột 36 Hình Kết xác định đột biến exon 18 bệnh nhân MS76 (A) Kỹ thuật giải trình tự gen cho kết nghi ngờ (B) Kỹ thuật Scorpion ARMS xác định có đột biến L858R Bảng Tỷ lệ dạng đột biến gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN Exon ñột biến Dạng ñột biến Số trường hợp Tỷ lệ % 18 G719S 4% 19 LREA deletion 14 56% 21 L858R 10 40% Tổng cộng 25 100% Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 BÀNLUẬN Cho đến thời điểm tại, y văn giới báo cáo 40 dạng đột biến gen EGFR đóng vai trò bệnh sinh đáp ứng hiệu LPĐTTĐ bệnh UTPKTBN, đột biến LREA exon 19 đột biến L858R exon 21 hai dạng thường gặp (chiếm 85-90% tổng số đột biến gen EGFR liên quan đến tính đáp ứng thuốc điều trị đích)(4,6) Nghiên cứu thực 70 mẫu mô UTPKTBN cho kết tương tự với tỷ lệ đột biến gen EGFR exon 19 56% exon 21 40% Đây hai dạng đột biến gây tăng tính nhạy cảm khối u tác nhân ức chế EGFR tyrosine kinase Các dạng đột biến khác chiếm tỷ lệ nhỏ vai trò chúng LPĐTTĐ chứng minh, đột biến exon 18 (phát trường hợp nghiên cứu này), exon 19 21 giúp tăng tính nhạy cảm đột biến exon 20 (chiếm 5%) lại khiến tế bào u đề kháng với thuốc điều trị đích(4) Nghiên cứu áp dụng quy trình xét nghiệm đột biến exon 18, 19, 20, 21 gen EGFR bệnh nhân UTPKTBN theo hai kỹ thuật: trước tiên kỹ thuật giải trình tự, sau trường hợp có kết nghi ngờ xác định lại kỹ thuật Scorpions ARMS Nghiên cứu phát đột biến gen EGFR 25/70 mẫu mô UTPKTBN, chiếm tỷ lệ 35,71% với trường hợp nghi ngờ đột biến exon 18 (bệnh nhân MS76) đỉnh tín hiệu đột biến thấp (có thể mẫu mơ lấy vùng có tế bào ung thư), khẳng định lại kỹ thuật Scorions ARMS Đây lần kỹ thuật Scorpion ARMS thực Việt Nam, cho phép phát xác đột biến gen mơ phân tích có tỷ lệ tế bào ung thư thấp (