xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ duchenne ở mức độ mrna và phát hiện người lành mang gen bệnh

Phát hiện người lành mang gen bệnh mẹ, chị em gái và dì trong giađình của bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên.. - Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phư

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)

là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả cácchủng tộc khác nhau trên thế giới Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai.Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ,biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầuthang Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lạivào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rốiloạn hô hấp [62], [146]

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gendystrophin Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiềudài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau Đây là gen lớnnhất của người được phát hiện cho đến nay Gen này sao mã ra mRNA 14kb

và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin Protein này có mặt ởmàng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổnđịnh màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ Khi gen

bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ củabệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109]

Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định.Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60% Đột biến điểmđứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30% Đột biến lặp đoạn,khoảng 10-15% [106] Nhiều công trình nghiờn cứu cho thấy đột biến mấtđoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trungtâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107] Vìvậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mấtđoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69]

Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử,nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu

và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD Tuy nhiên

ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến mấtđoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2vùng trọng điểm [1], [7], [10] Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rảirác khắp 79 exon Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ởnhững exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiềnmRNA

Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằngphản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phảikhuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79exon để xác định đột biến Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ vớicác intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNAngười ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon Điềunày gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian Ngược lại, ở cấu trúc củamRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau Do vậy, đểkhuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cầndùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gendystrophin [9], [77], [129] Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNAgiúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất

Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tửvong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơDuchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặngcủa gia đình cũng như của cộng đồng Theo nhiều nghiờn cứu, 2/3 bệnh nhânDMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biếnmới phát sinh [66] Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán

trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh là

sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận [93], [107]

Ở Việt Nam, năm 2005, Nguyễn Thị Trang và CS nghiên cứu về lâmsàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoánngười mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu

có khả năng là người mang gen bệnh [20] Tuy nhiên, những kết quả trên chỉmang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sứcthuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau:

1 Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơDuchenne ở mức độ mRNA

2 Phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong giađình của bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên

3 Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những người mẹ dị hợp

tử mang gen dystrophin bị đột biến mất đoạn

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD

- Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về

8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnhloạn dưỡng cơ Duchenne Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm cácyếu tố dinh dưỡng [49]

- Năm 1861, Duchenne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công

mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai Năm

1868, Duchenne thực hiện một nghiên cứu quy mô về bệnh lý này, ông đưa ranhững tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh và kíchthích điện Duchenne nhận thấy có sự thay thế mô cơ bằng những mô xơ hoặc

mô liên kết trên tiêu bản sinh thiết cơ Sau đó ụng đó sử dụng thủy trị liệu kếthợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân và nhận thấy có sự cải thiện bệnh ởmột số bệnh nhân Chính nhờ sự phát hiện quan trọng này mà sau đó bệnhđược mang tờn ụng [34]

- Năm 1879, Gowers đã thu thập bệnh án 220 bệnh nhân và mô tả mộtcách kỹ lưỡng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết.Ông cũng phát hiện một phụ nữ có những đứa con trai khác cha cùng bị bệnh.Gowers nhận thấy rằng các trẻ mắc bệnh có một đặc điểm giống nhau khithay đổi tư thế từ nằm sang đứng Từ đó, dấu hiệu này được xem là dấu hiệuđiển hình của bệnh DMD và được mang tên ông: dấu hiệu Gowers [62]

- Nếu tớnh từ thời Meryon thì bệnh DMD đã được biết hơn 150 năm.Tuy nhiên, trong suốt một thời gian dài, bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ởmức độ lâm sàng và điều trị chỉ tập trung vào chăm sóc hỗ trợ trong quá trìnhcủa bệnh [140]

- Trong những năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặcbiệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện

dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym CK, phục vụ cho điều trị và tưvấn di truyền [58], [102]

- Năm 1981, Zatz và CS đã phát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị tríXp21.1 nhờ quan sát những trẻ gái mắc bệnh DMD Những bệnh nhân nữ nàymang chuyển đoạn giữa NST X và NST thường [140]

- Năm 1984-1987, Hoffman và CS đã phát hiện ra gen dystrophin và sảnphẩm protein tương ứng của gen này [38], [65]

- Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp ditruyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát hiện đột biến gen dystrophin,tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tưvấn di truyền nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38]

- Năm 1987-1988, các nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60exon

- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb [47]

- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiệnđầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112]

- Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càngđược làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗlực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng

nề do bệnh gây ra [92], [109]

1.2 Đặc điểm của bệnh DMD

1.2.1 Biểu hiện lâm sàng của DMD

Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấpngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ

- Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệuGowers rõ Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốnngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chốngnạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lầnlượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy Sự tiếp nối cácđộng tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến

- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi.Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được Cuối cùng trẻthường tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96]

1.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng

1.2.2.1 Định lượng hoạt độ CK toàn phần

CK được Lohman phát hiện vào năm 1934 CK là enzym xúc tác sự tạonăng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong

tế bào cơ Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việcđịnh lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ.Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhânloạn dưỡng cơ tiến triển Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăngtrong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104]

Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trướckhi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh Hoạt độ CK huyếtthanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới

160 UI/L) Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thểloại trừ chẩn đoán DMD Tuy nhiên, trong giai đoạn muộn của quá trìnhbệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp Lý do của hiện tượng trên là vào giaiđoạn cuối, khối cơ còn lại quỏ ớt, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nênlượng cơ thoái hóa cũng ít đi [4], [91], [102]

1.2.2.2 Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ

Ghi điện cơ là phương pháp nghiên cứu hoạt động điện của cơ bằngcách ghi lại điện thế hoạt động của các sợi cơ ở những trạng thái khác nhau

Nhờ nghiên cứu của Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), phương phápghi điện cơ được ứng dụng để chẩn đoán sớm các bệnh loạn dưỡng cơ tiếntriển trước khi có biểu hiện lâm sàng Năm 1979, Stalberg và Trontelj mô tảchi tiết hình ảnh tổn thương trên điện cơ đồ ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ [103].Trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, điện cơ đồ cho thấy những biến đổiđặc trưng của bệnh lý cơ nhưng không đặc hiệu cho DMD, khụng có bằngchứng của hiện tượng suy giảm phân bố thần kinh trong cơ, tốc độ dẫn truyềnthần kinh cảm giác và vận động bình thường [34]

1.2.2.3 Sinh thiết cơ

Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phươngpháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34] Trong nhiều năm sau đó,phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnhDMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác

Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổiđặc trưng trên tiêu bản sinh thiết Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồmtăng sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và táisinh rải rác Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơnnhân, đõy là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại

tử sợi cơ; song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiệnnhững thay đổi nhẹ về mặt cấu trúc [34]

Vị trí sinh thiết thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoàicủa cơ tứ đầu đùi hoặc cơ sinh đôi ngoài [62]

1.2.2.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ)

Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ Bởi vậy với phương phápmiễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bìnhthường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trongkhi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắtmàu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt củaprotein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89]

Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker(BMD) Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với

ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậmhơn Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tếbào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28]

thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD

Hình 1.1 Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin

(Nguồn: Matsuo, 2002)

1.2.2.5 Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến

Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự mấtđoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạtnhững nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD Hiện nay, có rất nhiều kỹthuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuậtPCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization

(FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA) [90], [91], [107] Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4.

Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khiNST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang genbệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56]

Bảng 1.1 Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con

XDXD

lành

XDXd

lành manggen bệnh

1.2.5 Điều trị bệnh DMD

Điều trị bệnh DMD vẫn còn là vấn đề khó khăn đối với nền y học Hiệntại, chưa có những biện pháp điều trị đặc hiệu cũng như ngăn cản sự tiến triểncủa bệnh Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể điều trị các triệu chứng, các biếnchứng của bệnh và nâng cao chất lượng sống cho đứa trẻ

1.2.5.1 Điều trị nội khoa

Điều trị bệnh DMD chủ yếu phối hợp điều trị nội khoa và phục hồichức năng nhằm trì hoãn sự tiến triển của bệnh Các thuốc điều trị nội khoacho bệnh nhân DMD như prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhómsteroid) hoặc aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy

tế bào cơ Vật lý trị liệu có tác dụng làm chậm lại các biến chứng thoái hóa,

co rút cơ [92]

1.2.5.2 Liệu pháp thay thế gen

Mục đích là đưa vào trong tế bào gen có khả năng tổng hợp ra proteindystrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ Hai phươngpháp đã được thực nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những plasmid chứađoạn gen dystrophin và sử dụng vật truyền trung gian Tuy nhiên phươngpháp này gặp những khó khăn sau: (1) trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớnvào vật truyền trung gian, (2) đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơsau phân bào, (3) sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của hệthống miễn dịch Vì những trở ngại đú nờn hiện nay các phương pháp này vẫnchưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD ở người [53], [96]

Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen mới đã thu đượcnhiều thành quả, đó là việc chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹBMD Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớmhoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin khôngđược sản xuất Sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhõn, các nhàkhoa học đã chọn lọc xúa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị độtbiến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì đượckhung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần Phương pháp này đãđược áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đángkhích lệ [93], [144]

1.2.5.3 Liệu pháp điều trị tế bào

- Chuyển ghộp nguyờn bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng

cách nuôi cấy in vitro cỏc nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một

người thân không mắc bệnh DMD, thường là người cha Các tế bào hình saohiện diện trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thainhưng ở trạng thái ngủ Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới cáctác động khác nhau, tế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào

cơ Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh.Các tế bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh

lý, nhờ đó chức năng của cơ được tái lập Trước khi thực hiện chuyển ghộpnguyờn bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cảnphản ứng thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy liệu phápnày có thể có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư, [34] Hiện nay,phương pháp này vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD một cáchrộng rãi

- Phương pháp sử dụng tế bào gốc: trong những năm gần đây, tế bào

gốc từ tủy xương được nghiên cứu rất nhiều do không gặp phải cản trở về vấn

đề đạo đức và nguồn cung cấp dễ dàng Trong tủy xương, ngoài dòng tế bàotạo mỏu cũn có nhiều dòng tế bào khác và các tế bào đó có khả năng biệt hóathành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào cơ hệ vận động, tế bào cơ tim,

tế bào nội mạc, tế bào thần kinh, Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, khi

tiêm trực tiếp tế bào tủy xương vào cơ sẽ có một lượng nhỏ sợi cơ được tạo ra[143], [138]

1.2.6 Phòng bệnh DMD

DMD là bệnh di truyền có tiên lượng nặng, làm hạn chế và mất khả năng

đi lại, dẫn đến tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay, chưa cóphương pháp điều trị bệnh hiệu quả Những nhà khoa học quan tâm đến bệnhDMD đều nhận định rằng, cho tới khi chưa tìm được phương pháp điều trị cóhiệu quả cho bệnh DMD thì việc nghiên cứu nhằm phát hiện những người

lành mang gen bệnh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bệnh nhân, hoặc chẩnđoán trước sinh trên những người mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di truyềnvẫn là biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh DMD [93], [107].

1.3 Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin

1.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophin

1.3.1.1 Vị trí của gen dystrophin

Hình 1.2 Sơ đồ NST X và vị trí của gen dystrophin

(Nguồn: www.ghr.nlm.nih.gov/gene )

Gen dystrophin nằm trên NST X, nhánh ngắn vùng 2, băng 1, băng phụ 2

1.3.1.2 Cấu trúc của gen dystrophin

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của gen dystrophin (Nguồn: Yaffe, 2002)

Gen dystrophin là một phức hợp gồm:

- Bộ phận khởi động (promotor): cho phép gen hoạt động, khi đóng,

khi mở và sản xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu mô tương ứng Có bảy

promotor đặc hiệu là: promotor não, promotor cơ, promotor tiểu não,promotor Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 [139]

- Các exon: gen dystrophin chứa 79 exon, đây là các vùng của gen

được phiờn mó có mặt trong mRNA trưởng thành, chứa đựng thông tin ditruyền để tổng hợp ra protein tương ứng

- Các intron: là những đoạn DNA của gen xen kẽ giữa những exon,

được sao mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạomRNA trưởng thành [136], [139]

1.3.1.3 Chức năng của gen dystrophin

Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNAtrưởng thành có chiều dài 14 kb Phân tử mRNA này tổng hợp nên proteintương ứng là dystrophin [136]

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin

1.3.2.1 Cấu trúc của protein dystrophin

Là protein được mã hóa bởi gen dystrophin có trọng lượng phân tử 427

kD với khoảng 3685 acid amin Protein dystrophin nằm ở màng bào tươngcủa tế bào cơ và được chia làm 4 vùng:

1 Vùng N-tận gồm 240 acid amin, là vùng gắn với actin

2 Vùng trung tâm rod có 2700 acid amin

3 Vùng giàu cystein gồm 280 acid amin

4 Vùng C-tận chứa 420 acid amin, có chức năng liên kết với màng tế bào Vùng 5’-tận, vùng giàu base cystein và vùng C-tận là những vùngtương đối quan trọng đối với chức năng của dystrophin Những vùng này là vịtrí bám của actin và phức hợp dystrophin-glycoprotein (Dystrophin-Glycoprotein Complex-DGC) Trong khi đú vùng rod được coi là vựng ớtchức năng nhất [65], [107]

Hình 1.4 Cấu trúc mô phỏng của protein dystrophin và một số protein

tương tác với nó (Nguồn: www.jennyndesign.com )

1.3.2.2 Chức năng của protein dystrophin

Protein dystrophin có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ xương, đúngvai trò quan trọng trong cấu trúc của cơ Nhiều protein màng tế bào liên kếtvới protein dystrophin tạo thành phức hợp DGC (Dystrophin-GlycoproteinComplex) Phức hợp này cho phép nối những sợi actin với khung xươngngoài tế bào xuyên qua màng sợi cơ [109] Đầu amin tận của proteindystrophin gắn với F-actin và đầu carboxyl tận gắn với phức hợp DGC tạimàng sợi cơ (hình 1.4) Các thành phần quan trọng của phức hợp DGC baogồm dystroglycan, sarcoglycan, dystrobrevin, syntrophin và NOS Sự đột biếnxảy ra ở bất cứ vị trí nào trong các thành phần này đều gây ra bệnh loạndưỡng cơ di truyền Phức hợp DGC sẽ bị mất ổn định khi protein dystrophinvắng mặt Sự mất ổn định này dẫn đến hoại tử dần dần các sợi cơ và tổnthương màng Phức hợp DGC cũn có vai trò như một tín hiệu hóa học Sự mấttín hiệu này cũng góp phần gây bệnh [65], [109]

1.3.3 Cơ chế bệnh sinh của DMD

Sự thiếu hụt protein dystrophin làm mất tính ổn định của phức hợpDGC, từ đó sẽ gây ra bất thường ở màng tế bào với rách màng tế bào khu trú,tạo điều kiện cho ion Ca++ đi vào tế bào Ion Ca++ vào tế bào sẽ hoạt hóa cácenzym protease, gây phân hủy các protein của sợi cơ và bộ khung tế bào Do

vậy, màng tế bào bị tổn thương rộng hơn và ion Ca lại ồ ạt đi vào tế bào tạo

ra một vòng luẩn quẩn và dẫn đến rối loạn cân bằng nội mô canxi Hậu quảcuối cùng là sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và hoại tử tế bào [109]

Hình 1.5 Cơ chế bệnh sinh của DMD

(Nguồn: Rando, 2004)

1.3.4 Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin

1.3.4.1 Đột biến mất đoạn gen dystrophin

Đột biến mất đoạn gen là dạng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD,chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD Những đột biến mấtđoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không cóchức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD Những mất đoạn genkhụng gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ởgiữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn làBMD Tuy nhiên, khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% cáctrường hợp có đột biến mất đoạn [90], [106]

Đột biến mất đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợpDMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm vàđầu 5’ của gen dystrophin [106] Các đột biến mất đoạn gen được phát hiệnbằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phươngpháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75]

1.3.4.2 Đột biến điểm

Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30% Hầuhết đột biến điểm trong bệnh DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnhnặng Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trongviệc xác định đột biến Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gendystrophin đã được xác định [106], [112]

1.4.3.3 Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn

Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên DMD trong hầuhết các trường hợp còn lại Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy

ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107] Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnhnhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107]

1.4 Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin

Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để pháthiện bất thường của gen dystrophin

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba bước:

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch

phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA

được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,thường là 94oC-95oC trong vòng 30-60 giây

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phép

các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tm củacác mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng

lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,

Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian

phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30giây đến nhiều phút [121]

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùnglàm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sảnphẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đụi cú chiều dàibằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩmđược xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [94]

Hình 1.6 Các bước cơ bản của phản ứng PCR

(Nguồn: Vierstraete, 1999)

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNAban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôilượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, một DNA đớch đó nhân bảnthành 2n bản sao Đó là số lượng DNA đủ để có thể tách ra khi điện di và cóthể phát hiện được sau khi nhuộm, đủ để có thể tạo dòng hoặc giải trình tự[6], [17], [81].

1.4.1.2 Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh DMD

* PCR đơn mồi (monoplex PCR): đõy là kỹ thuật PCR kinh điển nhất.

Mỗi phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đạimột đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào [22], [138]

Trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả đã sửdụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen dystrophin bằng phảnứng PCR, sau đó điện di sản phẩm trên gel agarose Mẫu bệnh nhân được tiếnhành song song với mẫu đối chứng Nếu mẫu đối chứng xuất hiện vạch DNAtương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu bệnhnhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon đó ỞViệt Nam, Nguyễn Đức Bách (2003), Đặng Thị Diễm Hồng (2004) đã sửdụng phương pháp PCR đơn mồi để xác định đột biến mất đoạn gen ở bệnhnhân DMD Năm 2006, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã khuếch đại 22 exon (1, 3,

4, 6, 8, 11, 12, 13, 17, 19, 20, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 và 60) của

84 bệnh nhân DMD và phát hiện được 32 bệnh nhân (chiếm 38%) có đột biến mấtđoạn [1], [7], [8]

* PCR đa mồi (multiplex PCR): là phương pháp PCR sử dụng đồng thời

nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhõn cỏc đoạn DNA đặc trưng khácnhau trên một phân tử DNA, hoặc trờn cỏc phân tử DNA khác nhau [114].Điều quan trọng nhất là phải thiết kế các cặp mồi cú cựng nhiệt độ bắt cặp lênDNA đích, đồng thời các mồi này không bắt cặp với nhau Tuy nhiên, rất khó

để đạt được các điều kiện như vậy nên phương pháp PCR đa mồi có nhượcđiểm là đôi khi cho kết quả không chính xác như PCR đơn mồi [41], [74]

Ứng dụng trong chẩn đoán DMD:

Do gen dystrophin có số lượng lớn exon (79 exon) nên để phát hiện độtbiến mất đoạn gen dystrophin, các tác giả thường sử dụng phương pháp PCR

đa mồi hơn là phương pháp PCR đơn mồi nhằm tiết kiệm thời gian, công sức

và hóa chất Trước đây và cho đến hiện nay, phương pháp multiplex PCR vẫn

là phương pháp được ưu tiên sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn gendystrophin như trong nghiên cứu của Coutelle (1989), Lee (1993), Prior(2005), Basak (2006), Sura (2008), Năm 2006, Trần Võn Khỏnh đó sử dụngphương pháp này để phát hiện đột biến trên 85 bệnh nhân DMD Kết quả chothấy tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin của bệnh nhân DMD ở Việt Nam

là 38% [10], [32], [33], [43], [82], [125] Hiện nay, phương pháp multiplexPCR là một trong những phương pháp được sử dụng để chẩn đoán đột biến mấtđoạn gen dystrophin ở Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein của trường Đại học Y

Hà Nội

Hình 1.7 Phản ứng multiplex PCR xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin (Trung tâm Nghiờn cứu Gen-Protein, Đại học Y Hà Nội)

* Kỹ thuật PCR lồng (nested PCR): nguyờn lý của kỹ thuật nested PCR là sử

dụng 2 cặp mồi có trình tự nucleotid lồng vào nhau để khuếch đại đoạn DNA đích,nghĩa là cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotid nằm bên trong cặp mồi thứ nhất.Sản phẩm PCR được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu chophản ứng PCR lần thứ 2 Phương pháp này làm tăng chất lượng và độ đặc hiệu chophản ứng PCR [6], [18], [74]

* Kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR): trước hết, mRNA được chuyển

thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi được sử dụng hoặc làoligonucleotid oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), hoặc là các

hexanucleotid (trình tự gồm 6 nucleotid) để bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tựngắn trên RNA Sau đó, cDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzym

Taq polymerase [110].

Đối với bệnh DMD, RT-PCR đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quátrình xác định đột biến Như đã trình bày gen dystrophin là một trong nhữnggen lớn nhất của cơ thể (dài 2400 kb), có cấu trúc gồm 79 exon, sao mã raphân tử mRNA dài 14 kb; trong cấu trúc DNA, các exon nằm xen kẽ với cácintron có kích thước rất lớn [26] Do vậy, để khuếch đại 79 exon mang chứcnăng mã hóa protein từ DNA, người ta phải thiết kế 79 cặp mồi; nhưng nhờphản ứng RT-PCR, phân tử mRNA được chuyển thành cDNA Trên phân tửcDNA, 79 exon nằm liên tục với nhau, không bị xen kẽ bởi các intron; vì thế,chỉ cần thiết kế 15 cặp mồi và sử dụng 15 phản ứng nested PCR (trong đó có

5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 và 10 cặp mồi thiết kế cho phản ứngPCR lần 2), toàn bộ chiều dài của gen dystrophin sẽ được khuếch đại [129].Với 10 cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 2, 10 đoạn DNA chứa toàn bộ

79 exon được khuếch đại và mỗi đoạn có kích thước khoảng 1000-1400 bp.Sau khi khuếch đại, các đoạn DNA được điện di trên agarose để xác định độtbiến mất đoạn gen Mặt khác, 10 đoạn gen này có thể được tạo dòng và giảitrình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen dystrophin nhưđột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay và Lai đã sử dụng phươngpháp này để xác định dạng đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD ởSingapore [129] Hiện nay, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn ở Trung tõmNghiờn cứu Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội cũng ứng dụng kỹthuật RT-PCR để xác định đột biến điểm và đột biến mất đoạn gen dystrophin

agarose rồi chuyển sang màng lai Bước tiếp theo, các đoạn DNA cần xácđịnh nằm trên màng được lai với các oligonucleic đặc hiệu có gắn chất đánhdấu như phóng xạ, chất màu huỳnh quang, biotin Các phương pháp xác địnhhình ảnh tương ứng được sử dụng để chỉ ra các vạch sản phẩm chứa các đoạnDNA cần phát hiện lai với oligonucleotid đánh dấu trên màng Phương phápnày cho phép xác định được những đoạn DNA có kích thước lớn chỉ với mộtnồng độ nhỏ trong hỗn hợp vốn khó có thể xác định được bằng các phươngpháp khác như nhuộm ethedium bromide [12], [126].

1.4.2.2 Ứng dụng trong chẩn đoán DMD

Ngoài việc phát hiện được đột biến xóa đoạn, Southern blot còn chophép xác định các đột biến lặp đoạn gen dystrophin Ở bệnh nhân đột biếnmất đoạn, băng lai của các exon bị đột biến và đoạn dò đặc hiệu không xuấthiện trên phim Đối với các bệnh nhân đột biến lặp đoạn, có hiện tượng tăngcường độ phát sáng của băng lai với exon bị lặp đoạn khi so sánh với mẫu đốichứng Ngoài ra, Southern blot còn được sử dụng để phát hiện người mẹ vàchị em gái của bệnh nhân ở dạng dị hợp tử Prior (2005) đã sử dụng phươngpháp này để xác định đột biến mất đoạn ở một bệnh nhân DMD, đồng thờiphát hiện được mẹ và chị gái của bệnh nhân cũng là người mang gen bệnh [107]

Hình 1.8 Kỹ thuật Southern blot xác định đột biến gen dystrophin

(Nguồn: Prior, 2005)

Người mẹ (I-1) sinh một người con trai bị DMD (II-3) với đột biến mất đoạn exon 50 và 2 người con gái (II-1 và II-2) Phản ứng Southern blot được tiến hành với 2 exon, 1 exon bệnh nhân không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội là exon 19 và 1 exon mà bệnh nhân bị mất đoạn (exon 50) Để tránh sai số, Prior phân tích kết quả dựa vào tỷ lệ đậm độ băng lai của exon 50:19 và so sánh tỷ lệ này của các thành viên với đối chứng nữ Kết quả cho thấy ở mẹ bệnh nhân (I-1) và II-1

có tỷ lệ đậm độ exon 50:19 giảm 50% so với tỷ lệ này ở đối chứng nữ, như vậy hai người nữ này ở dạng dị hợp tử Còn người nữ II-2 thì tỷ lệ đậm độ exon 50:19 tương đương với chứng nữ, chứng

tỏ không mang gen bệnh.

1.4.3 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

1.4.3.1 Nguyên tắc

Sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, được gọi là mẫuDNA dò (probe DNA) để phát hiện một trình tự đớch Cỏc mẫu DNA dòđược đánh dấu huỳnh quang và sẽ lai với DNA đớch trờn NST ở kỳ giữa hoặcgian kỳ Nhờ sự lai của mẫu DNA dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện,định vị được vị trí chuỗi DNA đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnhquang [5]

1.4.3.2 Ứng dụng trong chẩn đoán DMD

FISH là một kỹ thuật giúp chẩn đoán hiệu quả các bệnh lý di truyền nóichung và bệnh lý DMD nói riêng Để chẩn đoán đột biến gen dystrophin,Ligon (2000) đã sử dụng 2 loại probe:

- Các probe giúp xác định đột biến mất đoạn các exon của gendystrophin gọi là cosmid probe có gắn chất huỳnh quang digoxingenin Khi

có hiện tượng lai đặc hiệu xảy ra, digoxingenin gắn trên probe sẽ phát ra màu đỏ

- Loại probe thứ hai giúp định vị các NST X (vì gen dystrophin nằmtrên NST X), probe này có gắn biotin Khi probe lai với NST X thì tâm độngcủa NST X phát ra màu xanh [84]

Kết quả của nghiên cứu của ba gia đình được thể hiện ở hình 1.9

Hình 1.9 Hình ảnh xác định đột biến gen dystrophin nhờ phương pháp FISH

(C) FISH sử dụng probe cosmid đặc hiệu cho exon 44, xác định trên người chị của gia đình thứ 3 Kết quả cho thấy hiện tượng lai xảy ra ở cả 2 NST X, như vậy người chị này không mang gen đột biến exon 44.

1.4.4 Phương pháp MLPA

Trong những năm gần đây, kỹ thuật MLPA được nhiều nhà khoa học sửdụng để phát hiện các bệnh lý di truyền Phương pháp này cho phép phát hiệncác tổn thương gen một cách nhanh chóng [78], [111]

1.4.4.1 Chuẩn bị probe

Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các probe gắn đặc hiệu với cácđoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng Thông thường, mỗi probechứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau (hình 1.10):

Hình 1.10 Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

(Nguồn: Schouten, 2002)

- Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:

+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ laivới DNA đích khi tiến hành phản ứng lai Đoạn này có khoảng 21-30nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe

+ Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotidcủa đoạn này giống nhau cho tất cả các probe Đõy là vị trí gắn với mồi Y đểkhuếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR.

- Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau chotất cả các probe Đõy là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe,

+ Đoạn 3’ cũn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’

và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid không đặc hiệuvới DNA đớch nờn nú khụng gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khácnhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau Do

đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di [115], [117]

1.4.4.2 Các bước tiến hành phản ứng MLPA

- Mẫu DNA hòa với 5 μl TE được biến tính ở 98°C trong 5’.

- Cho hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe vào

- Hỗn hợp được ủ ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua đêm) Hai đoạn laicủa 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với DNA đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau

- Cho enzym ligase vào và ủ ở 54°C trong 15 phút, enzym lipase xúctác, nối hai đoạn oligonucleotid của probe lại với nhau (hình 1.10) Phản ứngnối sẽ chấm dứt bởi sự tăng nhiệt độ lên 98°C trong 5 phút của phản ứng PCR

để khuếch đại các probe

- Hai đầu 5’ và 3’ của các probe có trình tự nucleotid hoàn toàn giốngnhau, đây cũng là vị trí gắn mồi khi tiến hành phản ứng PCR Do vậy, chúng

ta chỉ cần dùng duy nhất 1 cặp mồi nhưng khuếch đại được toàn bộ các probekhác nhau có trong hỗn hợp

- Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bảnsao Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm củachúng khác nhau Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di(thường sử dụng phương pháp điện di mao quản) Số lượng sản phẩm khuếch

đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu

với probe đó [115], [117]

1.4.4.3 Ứng dụng MLPA trong chẩn đoán DMD

Hiện nay, MLPA là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoánđột biến mất đoạn, lặp đoạn gen dystrophin Ngoài ra, MLPA cũn giỳp chẩn đoánngười lành mang gen bệnh với độ chính xác cao, cho kết quả nhanh chóng [66], [69]

Để chẩn đoán đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen, người ta thiết kế cácprobe gắn đặc hiệu với 79 exon của gen Trong mỗi phản ứng PCR, 40-45probe đặc hiệu cho 40-45 exon của gen có thể được khuếch đại đồng thời vớimột cặp mồi duy nhất Như vậy chỉ cần tiến hành 2 phản ứng PCR, đột biến ở

79 exon của gen dystrophin được khảo sát với thời gian từ 8-10 giờ Trongkhi đó bằng phương pháp multiplex PCR hoặc Southern blot việc phát hiệncác đột biến của bệnh nhân cần 1-2 tuần [117]

Năm 2008, Marzese ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán DMD, tácgiả tiến hành 2 phản ứng PCR Một phản ứng sử dụng hỗn hợp probe gọi làPO34, gắn đặc hiệu với các exon 1-10, 21-30, 41-50 và 61-70 Phản ứng PCRthứ hai sử dụng hỗn hợp probe gọi là PO35, có thể phân tích exon 11-20, 31-

40, 51-60 và 71-79 [90] Kết quả nghiên cứu của Marzese trên hai gia đìnhbệnh nhân được thể hiện ở hình 1.11

Hình 1.11 Kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến lặp đoạn (A) và đột biến

mất đoạn gen dystrophin (B) (Nguồn: Marzese, 2008)

1.4.5 Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động

Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụngdideoxynucleotid (ddNTP) do Sanger và CS phát minh Với cỏc mỏy thế hệsau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loạiddNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ốngnghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng chứ không phải trên 4 hàng khácnhau như trước đây Đối với phương pháp giải trình tự tự động, hệ thống điện

di thường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua,phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnhquang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phântích Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đóbiết được trình tự của DNA đích [73] Phương pháp này giúp xác định các độtbiến khó phát hiện của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến nhỏ, độtbiến lặp đoạn,

Hình 1.12 Hình ảnh giải trình tự gen dystrophin của bệnh nhân DMD (Nguồn: Trung tâm Nghiờn cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội)

1.5 Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD

Hiện nay chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh DMD, 100% bệnhnhân DMD tử vong Bởi vậy, xác định người mẹ mang gen bệnh, chẩn đoántrước sinh đóng vai trò rất quan trọng và là cơ sở đưa ra lời khuyên di truyềnnhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh [92]

Chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán sau sinh của các bệnh lý di truyềnnói chung hay bệnh DMD nói riêng khác nhau ở phương thức lấy mẫu Lấyđược mẫu tế bào và DNA có nguồn gốc từ thai nhi trong chẩn đoán trước sinhđóng một vai trò quan trọng Muốn chẩn đoán xác định thai bị bệnh lý ditruyền phải dựa vào các xét nghiệm di truyền Các xét nghiệm này có thểphân tích ở mức độ tế bào (phân tích NST), ở mức độ phân tử (phân tíchDNA, RNA) hoặc cả ở mức độ tế bào và phân tử (kỹ thuật FISH) [44] Tất cảxét nghiệm này cần phải lấy được tế bào hoặc DNA có nguồn gốc từ thai Haiphương pháp lấy mẫu xét nghiệm để chẩn đoán trước sinh là phương phápxâm phạm thai và phương pháp không xâm phạm thai [108]

1.5.1 Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu xâm phạm thai

Phương pháp lấy mẫu này ảnh hưởng trực tiếp đến thai nhi và có thểgây tai biến cho thai cũng như cho mẹ (sẩy thai, rỉ ối, ) Để giảm bớt rủi rotrên, việc sàng lọc để xác định những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bịbệnh sẽ giảm đáng kể số thai phụ phải thực hiện xét nghiệm xâm phạm thai

1.5.1.1 Sàng lọc thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh DMD

Các yếu tố được sử dụng trong sàng lọc chẩn đoán trước sinh bệnhDMD là: phả hệ của gia đình, nồng độ enzym CK của thai phụ và thai phụ cómang gen bệnh hay không

* Sàng lọc dựa vào phả hệ:

Các thai phụ đã có con bị bệnh DMD được xếp vào nhóm thai phụ cónguy cơ cao, các trường hợp này phải tiến hành lấy mẫu để chẩn đoán trướcsinh Theo quy luật di truyền, người mẹ dị hợp tử có khả năng truyền bệnhcho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái của họ [96]

Những phụ nữ không có con mắc bệnh nhưng gia đình có người mắcbệnh cũng được xếp vào nhúm cú nguy cơ cao Bệnh nhân có thể là anh emruột hoặc anh em họ, cậu, cháu của người mẹ [122]

* Sàng lọc dựa vào giá trị CK huyết thanh mẹ:

CK là một xét nghiệm hữu ích trong sàng lọc các người mẹ có nguy cơcao Các nghiên cứu cho thấy, CK tăng cao trong 2/3 trường hợp dị hợp tử bắtbuộc [85], [99]

* Sàng lọc dựa vào kết quả phân tích gen của người mẹ:

Kết quả phân tích gen cho biết thai phụ có mang gen bệnh hay không làyếu tố sàng lọc quan trọng nhất Nếu người mẹ ở trạng thái dị hợp tử, việc lấymẫu tế bào thai nhi để phân tích phát hiện đột biến là điều không tránh khỏi,cho dù việc lấy mẫu xâm phạm thai sẽ ảnh hưởng an toàn đến thai nhi [85],[122] Nếu người mẹ không mang gen đột biến, có thể tư vấn cho gia đìnhkhông cần tiến hành chẩn đoán trước sinh vỡ cỏc phương pháp chẩn đoántrước sinh hiện nay vẫn thực hiện quy trình lấy mẫu bằng kỹ thuật chọc hútdịch ối, ảnh hưởng không tốt đến mẹ và thai nhi

Sau quá trình phân tích sàng lọc, những thai phụ có nguy cơ cao sinhcon bị bệnh DMD sẽ được tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích vàxác định đột biến

1.5.1.2 Một số kỹ thuật lấy mẫu xâm phạm thai

Có nhiều kỹ thuật lấy mẫu tế bào thai theo phương pháp xâm phạm thai

* Chọc hút dịch ối: được thực hiện khi thai được14 đến 20 tuần Dịch ối

cú các loại tế bào ối, da, phổi và tế bào biểu bì đường tiết niệu của thai nhi.Những tế bào này sẽ được nuôi cấy với các môi trường thích hợp để thu được

lượng tế bào thai nhi nhiều hơn; mặt khác, nuụi cấy tế bào dịch ối còn giúploại bỏ tế bào máu của mẹ Tỉ lệ sẩy thai do chọc ối khoảng 0,5-1,0% [120],[123]

* Lấy mẫu nhung mao màng nuôi (Chorionic Villus Sampling-CVS): kỹ

thuật CVS được thực hiện đầu tiên vào những năm 1960 Từ năm 1983, CVS

đã trở thành một xét nghiệm phổ biến để chẩn đoán trước sinh trong 3 thángđầu của thai kỳ [57] CVS được thực hiện vào vào khoảng tuần thứ 9 đến tuần

12 của thai kỳ [120] Lợi điểm quan trọng nhất của CVS so với chọc ối là cóthể cho kết quả nhanh hơn, đồng thời có thể thực hiện vào giai đoạn sớm hơncủa thai kỳ Các bất thường của thai nhi có thể được phát hiện vào giai đoạnsớm hơn, do đó việc quyết định chấm dứt thai kỳ sẽ được chấp nhận dễ dànghơn về mặt tâm lý, kỹ thuật thực hiện và hậu quả Một bất lợi của CVS so vớichọc ối là tỷ lệ sẩy thai cao hơn, chiếm 2-3% trường hợp; theo nghiên cứu củaViện Sức khỏe Hoa Kỳ, tỷ lệ sẩy thai ở nhóm chọc hút nhung mao màng nuôităng 0,8% so với nhóm chọc ối [51], [135]

* Lấy máu cuống rốn qua da (Percutaneous Umbilical Blood Sampling-PUBS): là phương pháp thu thập máu thai nhi, được thực hiện sau

tuần thai thứ 16 Ưu điểm của PUBS là tế bào lympho trong máu phát triển rấtnhanh nên cho phép chẩn đoán gen rất nhanh chóng [120] Kỹ thuật này cũngrất có ích trong đánh giá chuyển hóa của bào thai cũng như các bất thường vềhuyết học Tỷ lệ sẩy thai do PUBS khoảng 1-2%, nghĩa là cao hơn so vớiphương pháp chọc ối [130]

* Sinh thiết mô thai: trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD, sinh thiết cơ

thai nhi được thực hiện dưới hướng dẫn của siêu âm vào khoảng tuần thứ 18của thai kỳ để phân tích húa mụ miễn dịch các sợi cơ [119]

* Kỹ thuật PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis): kỹ thuật này được

áp dụng cho những phôi thai hình thành nhờ phương pháp thụ tinh trong ống

nghiệm nhằm giúp việc chọn lọc phôi không bị rối loạn di truyền (loạn dưỡng

cơ Duchenne, xơ nang tụy, hội chứng Down, ) trước khi chuyển và cấy phôivào tử cung [61], [88]

1.5.2 Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai

Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫuthai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai Phương pháp lấy mẫukhông xâm nhập giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai và người

mẹ Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai đó là:

- Thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ,

- Tách DNA thai nhi tự do lưu hành trong máu của người mẹ

1.5.2.1 Phương pháp thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ

Từ năm 1893, người ta đã cho rằng tế bào của thai nhi có thể lưu hànhtrong máu mẹ với sự kiện Schmorl phát hiện được cỏc nguyờn bào nuôi trongphổi của một thai phụ bị tử vong vì sản giật [64] Một số tác giả khác cũng cónhững quan sát tương tự như vậy; nhưng cho đến khi phát hiện được những tếbào lympho mang NST Y trong máu một thai phụ (mang thai có giới tínhnam), người ta mới chắn chắn được rằng tế bào thai nhi thực sự có lưu hànhtrong máu mẹ [134] Từ đó, các công trình nghiên cứu về tế bào thai nhi trongmáu mẹ ngày càng nhiều và đặc biệt nở rộ vào những năm 1990 Sự xuất hiện

tế bào thai nhi trong máu mẹ là do tế bào máu thai nhi có thể đi vào tuần hoàn

mẹ thông qua nhung mao nhau thai Những tế bào thai nhi có thể được thuthập một cách an toàn từ khoảng tuần thứ 18 của thai kỳ trở đi Hiện nay, vớinhững kỹ thuật hiện đại, người ta có thể thu thập các tế bào này vào tuần thứ

12 của thai kỳ [100]

Có nhiều loại tế bào thai nhi xuất hiện trong máu mẹ, tuy nhiên nguyênhồng cầu được sử dụng nhiều nhất để phân tích và xác định bệnh lý di truyềnnói chung Sau khi lấy máu mẹ, cần phải tiến hành các công đoạn gồm (1) làm

giàu các tế bào thai nhi do số lượng của chúng trong một mẫu máu là rất hạnchế, (2) nhận diện tế bào thai nhi trong số các tế bào được làm giàu và (3)thực hiện các chẩn đoán di truyền học [64]

* Một số tế bào thai xuất hiện trong máu mẹ:

- Tế bào hồng cầu: Sự hiện diện của tế bào hồng cầu thai nhi trong máu

mẹ được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu [64] Tuy nhiên hồng cầu lànhững tế bào khụng nhõn nờn không có tác dụng trong chẩn đoán di truyền học

- Nguyên bào nuôi: việc sử dụng nguyên bào nuôi trong chẩn đoán

trước sinh có một số khó khăn nhất định Thứ nhất, hiện tượng nguyên bàonuôi đi vào tuần hoàn của mẹ không phải xảy ra ở tất cả các trường hợp mangthai Thứ hai, nếu hiện tượng này có xảy ra thỡ cỏc nguyờn bào nuôi cũngnhanh chóng bị đào thải bởi tuần hoàn phổi [30] Ngoài ra, nguyên bào nuụi

cú nguồn gốc ngoài phôi, tức là một phần của bánh rau, do vậy nguyên bàonuôi có khả năng biểu hiện tình trạng khảm trong khoảng 1% trường hợp, dovậy nú khụng phản ánh chân thực bộ gen của thai nhi [59]

- Tế bào bạch cầu: việc sử dụng tế bào bạch cầu thai nhi trong máu mẹ

cũng gặp một số khó khăn nhất định Bianchi và CS đã phát hiện rằng các tếbào gốc tạo mỏu, cỏc tế bào tiền thân lympho và tủy và tế bào lympho T củathai nhi có thể tồn tại trong máu một phụ nữ đến 6 năm Do vậy, nếu kỹ thuậtnày thực hiện ở các lần mang thai con rạ thì rất có thể sẽ thu nhận những tếbào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước [36] Ngoài ra, việc nhậndiện các tế bào bạch cầu thai nhi cũng gặp bất lợi là hiện nay chúng ta không

đủ các loại kháng thể đơn dòng để phát hiện bạch cầu tương ứng [64]

- Tế bào gốc và các tế bào gốc tạo máu: phương pháp này có lợi điểm

là tế bào gốc có thể nhân lên nhanh chóng in vitro do vậy có thể cung cấp đủ

một lượng tế bào cần thiết cho các xét nghiệm di truyền học [64] Tuy nhiờncác tế bào này lại có khả năng tồn tại lâu trong máu mẹ, do vậy, như trên đãnói, nếu kỹ thuật này thực hiện ở các lần mang thai con rạ thì rất có thể sẽ thunhận những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước [37]

- Nguyên hồng cầu: các tế bào hồng cầu có nhân (nguyên hồng cầu) của

thai nhi là loại tế bào có thể đáp ứng tốt nhất các tiêu chí của kỹ thuật pháthiện tế bào thai nhi trong máu mẹ vỡ nú cú đời sống tương đối ngắn, có hìnhthái đặc trưng và hầu như luôn hiện diện trong máu mẹ ở bất kỳ trường hợpmang thai nào [101] Do vậy, hiện nay người ta thường tiến hành tách, làmgiàu cỏc nguyờn hồng cầu thai từ máu mẹ để tiến hành phân tích, xác địnhbệnh lý di truyền nói chung và bệnh DMD nói riêng

* Phương pháp làm giàu nguyên hồng cầu thai nhi trong máu mẹ:

Có nhiều phương pháp làm giàu nguyên hồng cầu thai nhi trong máu

mẹ, như kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu, kỹ thuật ly tâm theogradient nồng độ, nuôi cấy tế bào, sử dụng cột avidinbiotin, [108]

- Phương pháp FACS và MACS: FACS (Fluorescence-Activated Cell

Sorting) và MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting) là những phương pháp

được ưa chuộng để làm giàu tế bào vào những năm 1990 Cả hai kỹ thuật nàyđều dựa trên nguyên lý nhận diện khỏng nguyờn-khỏng thể bằng cách sửdụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu nguyên hồng cầu Để thực hiện FACS,đầu tiên các kháng thể được gắn với các chất nhuộm huỳnh quang; còn trongMACS thỡ cỏc kháng thể này gắn với các hạt từ [35], [39], [46], [60]

- Phương pháp ly tâm theo gradient nồng độ: quy trình thực hiện bởi

Parano (2001) được tóm tắt như sau [101]:

+ Lấy 8ml máu của người mẹ vào tuần thai thứ 14-16 Giữ mẫu máu ởnhiệt độ phòng trong 5 giờ hoặc ở 48°C qua đêm

+ Để loại bỏ các tế bào hồng cầu khụng nhõn, cho vào dung dịchHistopaque (Sigma Diagnostic) và quay ly tâm 3000 vòng trong 30 phút ởnhiệt độ phòng Sau quay ly tâm, để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

+ Nguyên hồng cầu nằm ở lớp dịch nổi trên cùng, có tỷ trọng khoảng1,077 đến 1,083 g/ml Hút khoảng 2ml dịch nổi bằng pipet Pasteur

+ Rửa tế bào 2 lần với dung dịch PBS (phosphate buffer saline).

Mẫu tế bào thai sau khi làm giàu được làm tiêu bản để nhận diện tế bào thai nhi

* Nhận diện tế bào thai nhi tách từ máu mẹ:

Do quá trình làm giàu nguyên hồng cầu chỉ cho sản phẩm có độ tinhkhiết thấp nên việc tầm soát sau đó rất tốn công sức Zheng và CS [141] cũngnhư Ferguson-Smith [50] tìm ra phương pháp phát hiện nguyên hồng cầubằng cách nhuộm kộp nguyờn hồng cầu với các kháng thể kháng hemoglobinthai nhi và huỳnh quang Parano (2001) phát hiện nguyên hồng cầu bằng cáchnhuộm với kháng thể kháng hemoglobin đặc hiệu của thai nhi (anti-hemoglobin F), sau đó phát hiện sự hiện diện của nguyên hồng cầu bằng quansát dưới kính hiển vi Nguyên hồng cầu được xác định khi băng nhuộm phátsáng [101]

Hình 1.13 Phát hiện nguyên hồng cầu thai nhi trong máu mẹ bằng kỹ thuật nhuộm với kháng thể kháng hemoglobin F (Nguồn: Parano, 2001)

Các tế bào máu thai nhi có thể được phân tích để chẩn đoán rối loạn ditruyền bằng cách sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử thông qua phân lậpDNA, RNA, khuếch đại bởi phản ứng PCR, RT-PCR và một số kỹ thuật như

đã trình bày ở mục 1.4 [27], [45]

1.5.2.2 Phương pháp tách DNA thai nhi tự do lưu hành trong máu của người mẹ

Năm 1948, Madel và Metais [145] đã công bố trong huyết tương của cảngười khỏe mạnh lẫn người bệnh đều có chứa các nucleic acid Trong huyếtthanh của các bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống [128], viêm khớp dạng thấp

và ung thư đều có một lượng lớn DNA [83] Năm 1997, Lo và CS đã chứngminh được sự hiện diện của DNA thai nhi tự do lưu hành trong huyết tương

và huyết thanh của phụ nữ có thai [86] Các nhà nghiên cứu cũng đã sử dụng

kỹ thuật real time PCR để định lượng DNA của thai nhi, cụ thể là SRY, mộtchuỗi trình tự đặc hiệu cho NST giới tính Y trong máu những người mẹ mangthai nam Kết quả rất đáng ngạc nhiên: trung bình có đến 25,4 copy của DNAthai nhi trong 1ml máu mẹ trong giai đoạn sớm của thai kỳ, nghĩa là cao hơngấp nhiều lần số tế bào thai nhi trong máu mẹ [87] Nguồn gốc của DNA thainhi tự do trong máu mẹ vẫn chưa được biết chắc chắn Có thể chỳng cú nguồngốc từ (1) các tế bào thai nhi trong máu mẹ bị phá hủy và giải phóng ra, (2)DNA tự do của thai nhi được vận chuyển qua rau thai hoặc (3) sự phá hủy của cácnhung mao màng nuôi nằm sát với các khoang gian nhung mao trong rau thai [116].

* Kỹ thuật chiết tách DNA tự do lưu hành trong máu mẹ:

- Lấy 3,5 ml máu thai phụ, chống đông bằng EDTA Ly tâm 16000gtrong 10 phỳt Hỳt dịch nổi cho vào ống polypropylene, ly tâm ở 16000gtrong 10 phút Hút 900 μl dịch nổi cho vào ống polypropylene khác và bảoquản ở nhiệt độ -80°C

- Sau khi để tan băng, 400 μl mẫu nghiệm được ly tâm ở 16000g trong

10 phút và DNA được tách chiết bằng kit High Pure PCR TemplatePurification của hãng Roche

- Sử dụng 40 μl proteinase K để làm tiêu protein và rửa DNA với 50 μldung dịch đệm rửa Cần lưu ý, trước khi rửa, mẫu nghiệm được đặt trong tủlắc ở nhiệt độ 70°C trong 5 phút DNA thu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C để

sử dụng cho các kỹ thuật di truyền phân tử [142]

* Ứng dụng của kỹ thuật phát hiện DNA thai nhi tự do trong máu mẹ:

Đầu tiên, kỹ thuật phát hiện DNA thai nhi bên ngoài tế bào lưu hànhtrong máu mẹ được sử dụng để chẩn đoán giới tính thai nhi và định nhómmáu hệ Rh Sau đó kỹ thuật này được sử dụng để chẩn đoán các bệnh lý ditruyền đơn gen [116]

Việc xác định giới tính thai nhi được thực hiện bằng cách phát hiện cỏcdóy trình tự đặc hiệu của NST Y Nếu phát hiện được dãy trình tự đặc hiệu

NST Y thì thai nhi là nam Ngược lại, vắng mặt các chuỗi trình tự trên chứng

tỏ thai nhi là nữ Cỏc dóy trình tự đặc hiệu cho NST Y thường được dùngtrong chẩn đoán giới tính thai nhi là SRY, DYS và DAZ [116]

Bất đồng nhóm máu Rh giữa một thai phụ có Rh(-) và thai nhi có Rh(+)

có thể gây nên đáp ứng miễn dịch ở mẹ với những hậu quả trầm trọng như tánhuyết ở con gây nên vàng da nặng nề, thậm chí vàng da nhân hoặc có thể gâynên sẩy thai liờn tiếp ở các lần có thai sau [116] Vì vậy, việc xử trí kịp thờinhững người mẹ có nhóm máu Rh(-) mang thai Rh(+) là rất quan trọng DNAthai nhi tự do trong máu mẹ đã được sử dụng để chẩn đoán sớm nhóm máu

Rh của thai nhi ở những người mẹ có Rh(-) [87]

Năm 2000, Saito và CS lần đầu tiên thành công trong việc sử dụngDNA thai nhi tự do trong máu mẹ để chẩn đoán bệnh tạo xương bất toàn[113] Sau đó, DNA thai nhi tự do trong máu mẹ cũng được sử dụng để chẩnđoán trước sinh các bệnh lý xơ nang tụy [98], beta-thalassemia [133] và tăngsản thượng thận bẩm sinh [42] Phương pháp này có thể sử dụng để chẩn đoánmột gen bất thường của thai nhi có nguồn gốc từ bố hoặc một đột biến khôngphải từ mẹ Nếu gen bệnh của thai nhi có nguồn gốc từ mẹ (như bệnh DMD,hemophilia,…) thì phương pháp này không sử dụng được Chớnh vỡ lý donày mà phương pháp chẩn đoán bệnh lý di truyền đơn gen sử dụng DNA thainhi tự do có chỉ định hạn chế [116]

1.6 Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở Việt Nam

- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã nghiêncứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tạiBệnh viện Nhi Trung Ương Kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số

107 gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh [13]

- Năm 1996, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Phượng và CS đã nghiêncứu giá trị của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen bệnh và đãnhận thấy khả năng phát hiện người dị hợp tử của CK là 54% [21].

- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Thanh Hương, Nguyễn ThịTrang đã sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứngPCR thăm dò ở mức độ gen cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế

hệ bị bệnh [131]

- Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn và CS đã công bố tình hình bệnh DMD

ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc tế lần thứ 23

- Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 đã nghiên cứu đột biếngen gây bệnh DMD bằng phương pháp multiplex PCR và đã phát hiện 6trường hợp mất đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu [15]

- Năm 2004, Trần Võn Khỏnh và CS đã chẩn đoán 85 bệnh nhân ViệtNam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38% trong

số này có đột biến mất đoạn gen dystrophin [10]

- Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện 13bệnh nhân có đột biến mất đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán làDMD [20]

- Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ mất đoạn exon 46, 51 và cả hai exon là23/58, chiếm tỷ lệ 39,7% [19]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm chứng: gồm 20 người nam, 20 người nữ bình thường, tiền sử

gia đình không có ai mắc bệnh di truyền Nhóm chứng này được dùng đểchuẩn kỹ thuật PCR và được dùng làm mẫu đối chứng để chạy PCR cùng vớimẫu bệnh nhân và người nhà bệnh nhân

- Nhóm nghiên cứu:

(1) 58 bệnh nhân nam được chẩn đoán DMD dựa vào các triệu chứnglâm sàng và cận lõm sàng điển hình, trong đó có 18 bệnh nhân đã được Bệnhviện Nhi Trung Ương chẩn đoán xác định có đột biến mất đoạn gendystrophin và 40 bệnh nhân chưa được tiến hành phân tích gen

(2) 48 thành viên nữ (gồm mẹ, chị em gái và cỏc dì của bệnh nhân)của 30 gia đình bệnh nhân, mà các bệnh nhân này đã được phát hiện có độtbiến mất đoạn gen dystrophin

(3) Đối tượng chẩn đoán trước sinh là hai thai phụ được xác định cómang gen dystrophin bị đột biến mất đoạn gen

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ: Phải được vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 120°C trong 20 phút)

- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA),

- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO), máy điện di: Mupid (Nhật Bản),

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động thạch đã điện di: (Dolphin ChemiWealtec, USA),

- Máy quang phổ kế Thermo Electron Corporation của hãng Biomate,

- Máy điện di mao quản Agilent 2100 Bioanalyzer,

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức),

- Lò vi sóng (Samsung), tủ ấm, pipet, đầu cụn cỏc loại,

- Tủ nuôi cấy có chế độ lắc,

- Máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM

- Eppendorf 1,5 ml, ống Falcol, cóng đo sạch,

- Chai nuôi cấy tế bào: diện tích mặt đáy 25 cm2, nhãn hiệu Nunc

2.2.2 Hóa chất

* Hoá chất dùng để tách chiết DNA:

- Dung dịch lysis buffer, dung dịch K, dung dịch SDS 10%,

- Proteinase K (10 mg/l),

- Dung dịch phenol : chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25:24:1,

- Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24:1,

- Ethanol 100%, ethanol 70%, sodium acetate 3M, pH=5,2,

* Hóa chất tách chiết RNA tổng số (Wako):

+ Isogen, Isopropanol, ethanol 70%, DEPC - water

* Hóa chất tổng hợp cDNA (Invitrogen):

+ Random primer, dNTP 10mM, PCR buffer 5X,

+ DTT 0,1M (proteinase inhibitor), HPRI (RNAase inhibitor),

+ MMLV-RT (enzym tổng hợp ngược)

* Hóa chất chạy PCR (Invitrogen):

+ 10 X buffer, dNTP mix, Taq polymerase,

+ Các cặp mồi (xuôi và ngược)

* Hoá chất nhân dòng gen:

+ Vector tạo dòng, môi trường nuôi cấy khuẩn lạc,

+ X-gal, ITPG, kháng sinh

* Hoá chất để đọc trình tự:

+ Big dye, cột lọc

* Hóa chất nuôi cấy tế bào ối:

+ Môi trường nuôi cấy AmnioMax của hóng Gibco,

+ Huyết thanh bê, trypsin 2,5%,

+ Colcemid, dung dịch Hank’s của hóng Gibco