- Kết quả phân tích gen dystrophin của thai nhi:
4.3.Xác định người lành mang gen bệnh
DMD là bệnh di truyền có tiên lượng nặng, bệnh nhân mất khả năng đi lại, tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị bệnh hiệu quả. Do vậy, việc phát hiện những người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái) trong gia đình bệnh nhân, tiến hành chẩn đoán trước sinh trên những người mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di truyền vẫn là biện pháp cơ bản, được các nhà khoa học đặt lên hành đầu. Có rất nhiều phương pháp giúp phát hiện kiểu gen dị hợp tử như kỹ thuật PCR, Southern blot, FISH, MLPA [52], [70], [75], [76], [88]. Tuy nhiên với các gia đình đã phát hiện được vị trí đột biến ở bệnh nhân thì Fortina, Hung và các tác giả cho rằng nên chọn lựa phương pháp PCR định lượng trờn mỏy điện di mao quản vì dễ thực hiện, giá thành hợp lý và có độ tin cậy cao [52], [66], [70], [75].
4.3.1. Kết quả phân tích của nhóm đối chứng
Trong các phản ứng giúp xác định người mẹ dị hợp tử, phân tích kết quả của nhóm chứng là bước đầu tiên phải thực hiện ngay sau khi có kết quả điện di. Nếu kết quả điện di mẫu đối chứng không phù hợp, phải hủy bỏ kết quả vì việc xác định người mẹ mang gen ảnh hưởng rất lớn đến sự ra đời của thai nhi mà người mẹ mang thai lần sau. Bởi tầm quan trọng đó, trong mỗi phản ứng PCR, chúng tôi sử dụng hai thông số đối chứng khác nhau. Thứ nhất, sử dụng chứng nam và chứng nữ để phát hiện sai số của phản ứng
multiplex PCR. Mặc khác, trong mỗi phản ứng PCR, chúng tôi khuếch đại đồng thời 4 exon của gen dystrophin, trong đó có 2 exon mà bệnh nhân không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội trong một hỗn hợp master mix chung cho tất cả các ống PCR. Với việc sử dụng hai lần đối chứng, kết quả phân tích có độ chính xác rất cao. Theo Hung (2006) và Hwa (2007), độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp lên đến 100% [66], [69].
Hình 3.6 biểu hiện kết quả điện di trên gel agarose của nhóm chứng, ở nam giới đậm độ vạch điện di (tương ứng với nồng độ) các exon ở các chứng nam chỉ bằng ẵ so với chứng nữ. Kết quả tương tự khi phân tích định lượng trờn mỏy Agilent 2100 Bioanalyzer (hình 3.7), nồng độ các exon (tương ứng với chiều cao) của gen dystrophin sau khi khuếch đại ở các đối chứng nam luôn luôn bằng 1/2 so với exon tương ứng ở đối chứng nữ. Kết quả này hoàn toàn phù hợp vì gen dystrophin nằm trên NST giới tính X. Nam giới chỉ mang 1 NST X, trong khi đó nữ giới mang 2 NST X. Do vậy, khi chúng ta dựng cỏc cặp mồi cùng nồng độ để khuếch đại các exon ở nam và nữ thì nồng độ của chúng ở sản phẩm PCR của nữ sẽ gấp đôi ở nam. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hung (2006), phân tích 38 exon của gen dystrophin trờn nhúm chứng gồm 50 nam và 50 nữ bình thường; tác giả nhận thấy đỉnh các exon của nam luôn bằng ẵ so với đỉnh exon tương ứng của nữ [66].
4.3.2. Kết quả phân tích của các gia đình có mẹ không mang gen bệnh
Phân tích kết quả điện di trên agarose của gia đình bệnh nhân mã số 1 chúng tôi thấy rằng đậm độ của cả 4 exon được khuếch đại ở người mẹ và em gái bệnh nhân đều bằng với đậm độ các exon tương ứng của chứng nữ và đều gấp đôi đậm độ các exon tương ứng của chứng nam. Kết quả trên được khẳng định bằng cách định lượng nồng độ của các exon. Hình ảnh điện di mao quản
cho thấy nồng độ của các exon (kể cả 2 exon bị đột biến mất đoạn ở bệnh nhân là exon 46 và 49) ở mẹ và em gái bệnh nhân bằng với nồng độ các exon ở chứng nữ. Như vậy ở gia đình này, người mẹ mang gen dystrophin hoàn toàn bình thường nên em gái bệnh nhân cũng mang gen dystrophin bình thường. Điều này chứng tỏ đột biến mất đoạn gen ở bệnh nhân là đột biến mới phát sinh. Theo Fortina, tỷ lệ đột biến mới xuất hiện ở trẻ DMD là 1/3, còn 2/3 bệnh nhân DMD là do nhận gen bị đột biến từ người mẹ. Nghiên cứu của Abbs và của Hussey cũng đưa ra kết quả tương tự [23], [52], [67].
Quan sát hình ảnh điện di của bệnh nhân mã số 1 trên agarose, chỉ xuất hiện hai vạch tương ứng với hai exon không bị đột biến. Kết quả tương tự khi điện di định lượng, xuất hiện hai đỉnh của hai exon 41 và exon 51 là hai exon không bị đột biến, đỉnh của hai exon 46 và 49 không xuất hiện do chỳng đó bị đột biến mất đoạn. Hiện nay, khi tiến hành phân tích đột biến gen dystrophin, các tác giả thường sử dụng phương pháp multiplex PCR định lượng trờn mỏy điện di mao quản thay thế phương pháp PCR đơn thuần điện di trên agarose [66], [69]. Ngoài việc phát hiện được đột biến mất đoạn, phương pháp PCR định lượng cũn giỳp phát hiện đột biến lặp đoạn gen và phát hiện các trường hợp dị hợp tử mà phương pháp điện di agarose khó thực hiện chính xác được. Theo Hung, khi đỉnh điện di mao quản của exon ở bệnh nhân cao gấp đôi so với mẫu đối chứng nam, tức là bằng với mẫu đối chứng nữ thì bệnh nhân bị đột biến lặp đoạn exon đó [66].
Phân tích tương tự với gia đình bệnh nhân mã số 8, kết quả điện di cho thấy, sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR, nồng độ bốn exon của gen dystrophin ở người mẹ và em gái của bệnh nhân luôn bằng exon tương ứng ở đối chứng nữ và đều gấp đôi exon tương ứng ở chứng nam. Như vậy, mẹ ở
bệnh nhân là người bình thường, không mang gen bệnh và đột biến ở bệnh nhân là đột biến mới phát sinh.