- Nhóm nghiên cứu:
2.3.5. Phản ứng nested PCR xác định đột biến
Phản ứng nested PCR được ứng dụng sử dụng 15 cặp mồi khác nhau
để khuếch đại toàn bộ chiều dài gen dystrophin nhằm xác định đột biến mất đoạn ở mức độ mRNA. Trong đó có 5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 là: 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B, 4A-4B, 5A-5B. Mười cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 2 là: 1C-1D, 1E-1F (khuôn mẫu là sản phẩm PCR lần 1 khuếch đại bởi cặp mồi 1A-1B), 2C-2D, 2E-2F, 3C-3D, 3E-3F, 4C-4D, 4E-4F, 5C-5D và 5E-5F (hình 2.1).
Hình 2.1. Sơ đồ 15 cặp mồi khuếch đại toàn bộ chiều dài gen dystrophin * Cách tiến hành:
+ Phản ứng PCR lần 1: thành phần của phản ứng:
Thành phần Thể tích (μl)
10 x buffer 2,0
2,5 mM dNTP 2,0
Taq polymerase (Takara, Japan) 0,2
10 pmol mồi xuôi 1,0
cDNA 5,0
Nước cất 8,8
Tổng số 20μl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:
+ Phản ứng PCR lần 2:
Thành phần Thể tích (μl)
10 x buffer 2,0
2,5 mM dNTP 2,0
Taq polymerase (Takara, Japan) 0,2
10 pmol mồi xuôi 1,0
10 pmol mồi ngược 1,0
Sản phẩm PCR lần 1 1,0
Nước cất 12,8
Tổng số 20
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:
Sản phẩm sau PCR lần 2 được điện di 10 μl trên gel agarose 1,5% (nhuộm bởi ethidium bromid) để kiểm tra có sự đột biến mất đoạn gen hay không. Kết quả của bệnh nhân được so sánh với mẫu đối chứng. Nếu vạch PCR khuếch đại từ cDNA của bệnh nhân có kích thước nhỏ hơn so với mẫu đối chứng tức là bệnh nhân có đột biến mất đoạn gen. 10 μl còn lại của sản
phẩm PCR lần 2 sẽ được nhõn dòng gen và đọc trình tự để xác định chính xác những exon đột biến.