Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ cây cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng

Đặc biệt là các carotenoid được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất thức ăn cho chăn nuôi gà, nuôi trồng thủy sản như tôm, cá hồi… Nguồn nguyên liệu chính sản xuất carotenoid là thực v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT: Alanine aminotransferase (GPT: Glutamate pyruvate transaminase)

AST: Aspartate aminotransferase (GOT: glutamate oxalate transaminase)

BCC: Công ty phân tích thông tin thị trường Massachusetts, Mỹ

CNSH: Công nghệ sinh học

COX-2: Protein tiền viêm

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

ELISA: Enzyme - linked immunosorbent assay

FDA: Food and Drug Administration (Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ)

HPLC: High performent liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu năng cao) IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (Liên hiệp Hóa học Thuần túy và Ứng dụng Quốc tế)

KB : Epidermic carcinoma (Ung thư biểu mô)

LCMS: Liquid Chromatography Mass Spectrometry (sắc ký lỏng khối phổ) LDL: Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp)

LNCap: Hormone dependent human prostate carcinoma (Ung thư tuyến tiền liệt)

LU: Lung carcinoma (ung thư phổi)

MCF: Human breast carcinoma (ung thư vú)

NCI: National Cancer Institute (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ)

NEI: National Eye Institue (Viện mắt Quốc gia Hoa Kỳ)

NMR: Nuclear Magnetic Resonance spectrometry (cộng hưởng từ hạt nhân)

nNOS: neuronal Nitric Oxyde Synthetase (enzyme tổng hợp oxit nitric não) OD: Optical density (mật độ quang học)

OECD: Organization for Economic Cooperation and Development (Tổ chức

hợp tác và Phát triển Kinh tế)

PBS Đệm PBS (đệm huyết thanh phôi bò)

SDS: Sodium Dodexyl Sulphate

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm chức phổ biến

Bảng 1.2 Một số ví dụ về nhóm chức và các carotenoid chứa chúng

Bảng 2.1 Các mẫu thực vật sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các hệ dung môi sử dụng trong các thí nghiệm tách chiết và tinh sạch carotenoid

Bảng 2.3 Thành phần các loại đệm, dung dịch sử dụng trong các nghiên cứu hoạt tính sinh học

Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.1 Thành phần viên nang thực phẩm chức năng Ocpola

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc khung carbon của các carotenoid

Hình 1.2 Cấu trúc chung của các carotenoid hydrocarbon

Hình 1.3 Eschoscholtxanthin

Hình 1.4 β-citraurin

Hình 1.5 Peridinin

Hình 1.6 Astacen

Hình 1.7 Những tác hại do các gốc tự do gây nên cho cơ thể sống

Hình 1.8 Các tác dụng sinh học của carotenoid

Hình 1.14 Một số sản phẩm TPCN chứa các carotenoid sử dụng ở Việt nam

Hình 2.1 Đường chuẩn β-carotene

Hình 2.2 Đường chuẩn lycopene

Hình 2.3 Đường chuẩn lutein

Hình 3.1 Ảnh hưởng của β-carotene lên hoạt độ catalase máu người

Hình 3.2 Ảnh hưởng của lycopene lên hoạt độ catalase máu người

Hình 3.3 Ảnh hưởng của lutein lên hoạt độ catalase máu người

Hình 3.4 Ảnh hưởng của -carotene lên hoạt độ peroxidase máu người

Hình 3.5 Ảnh hưởng của lycopene lên hoạt độ peroxidase máu người Hình 3.6 Ảnh hưởng của lutein lên hoạt độ peroxidase máu người

Hình 3.7 Sự tăng khối lượng chuột ở các lô thí nghiệm

Hình 3.8 Sự thay đổi hoạt độ catalase trong máu chuột ở các lô thí nghiệm Hình 3.9 Sự thay đổi hoạt độ catalase trong gan chuột ở các lô thí nghiệm Hình 3.10 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase máu chuột ở các lô thí nghiệm

Hình 3.11 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase gan chuột ở các lô thí nghiệm

Hình 3 12 Hàm lượng cytochrome b5 trong máu và gan ở các lô thí nghiệm Hình 3.13 Các giá trị GOT, GPT trong máu ở các lô chuột thí nghiệm

Hình 3.14 Các giá trị GOT, GPT trong gan ở các lô chuột thí nghiệm

Hình 3.15 Hình ảnh quan sát tiêu bản đúc cắt tế bào gan chuột ở 10 lô thí nghiệmHình 3.16 Giá trị IC50 các chế phẩm carotenoid và TPCN Ocpola

trên dòng tế bào KB và LNCap

Hình 3.17 Nồng độ chế phẩm carotenoid và TPCN Ocpola tại giá trị IC50

của tế bào ung thư KB và LNCap

Hình 3.18 Hình ảnh tế bào KB, LNCap dưới tác dụng của lycopene ở nồng độ khác nhau Hình 3.19 Hoạt độ caspase-3 ở dòng tế bào ung thư phổi dưới tác động của các

carotenoid tinh sạch và TPCN Ocpola

Hình 3.20 Hoạt độ caspase-3 ở dòng tế bào ung thư vú dưới tác động của các

carotenoid tinh sạch và TPCN Ocpola

Hình 3.21 Sản phẩm TPCN Ocpola

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.TỔNGQUANVỀCAROTENOID 3

1.1.1 Carotenoid 3

1.1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.1.2 Cấu trúc hóa học và phân loại các carotenoid 3

1.1.1.3 Tính chất vật lý 6

1.1.1.4 Tính chất hóa học 6

1.1.2 Vai trò của các carotenoid 7

1.1.2.1 Vai trò của carotenoid trong thực vật 7

1.1.2.2 Chức năng của các carotenoit đối với đời sống động vật và sức khỏe con người 8

1.1.3 Một số carotenoid điển hình 12

1.1.3.1 Beta-carotene 12

1.1.3.2 Lycopene 14

1.1.3.3 Lutein 16

1.2.CÁCNGHIÊNCỨUVỀTHỰCPHẨMCHỨCNĂNG,DƯỢCPHẨM PHỤCVỤĐỜISỐNG 18

1.2.1 Khái niệm về thực phẩm chức năng 19

1.2.2 Vai trò của thực phẩm chức năng trong cuộc sống hiện đại 20

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.NGUYÊNLIỆU 24

2.1.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm 29

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 31

2.2.1 Phương pháp chiết xuất và tinh chế các carotenoid 31

2.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các carotenoid tinh chế 36

2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học các carotenoid lên các dòng tế bào ung thư in vitro 40

2.2.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học của các carotenoid lên chuột thực nghiệm theo

phương pháp của Favari [50] 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1.KẾTQUẢTHUVÀCHỌNMẪUNGHIÊNCỨU E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED 3.1.1 Kết quả thu mẫu và khảo sát các mẫu nghiên cứuError! Bookmark not defined 3.1.2 Kết quả nghiên cứu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kết qủa tinh sạch các carotenoid 50

3.2.KẾTQUẢTHỬHOẠTTÍNHSINHHỌCCỦACÁCCAROTENOIT 53

3.2.1 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trong điều kiện in vitro 53

3.2.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa của các chế phẩm tinh sạch các carotenoid lên catalase 53

3.2.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa của các chế phẩm tinh sạch các carotenoid lên peroxidase 55

3.2.1.3 Kết quả khả năng chống oxy hóa lên tế bào gan chuột in vitro 57

3.2.2 Hoạt tính chống oxy hoá của -carotene, lycopene và lutein trong điều kiện in vivo trên chuột 58

3.2.2.1 Sự thay đổi trọng lượng trung bình chuột trước và sau thí nghiệm 59

3.2.2.2 Hoạt tính của catalase trong máu và chuột 60

3.2.2.3 Hoạt tính của peroxidase trong máu và gan chuột 61

3.2.2.4 Enzyme cytochrome b5 trong máuvà gan chuột 64

3.2.2.5 Các chỉ số GOT và GPT máu và gan chuột 64

3.2.2.6 Kết quả làm tiêu bản đúc cắt tế bào gan chuột 67

3.2.3 Kết quả thử nghiệm các hoạt tính của β-carotene, lycopene và lutein lên các dòng tế bào ung thư 69

3.2.3.1 Kết quả thử độ độc lên tế bào Error! Bookmark not defined 3.2.3.2 Kết quả cảm ứng enzyme Caspase 3 của của β-carotene, lycopene và lutein lên LU1 và MCF7 73

3.3.KẾTQUẢỨNGDỤNGVÀOTHỰCTẾ 75

3.3.1.Thực phẩm chức năng TPCN Ocpola 77

3.3.2 Thực phẩm chức năng Kingpharocula 89

KẾT LUẬN 90

KIẾN NGHỊ 91

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN

ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 1 Hình ảnh sắc ký bản mỏng các mẫu nghiên cứu

PHỤ LỤC 2 Kết quả sắc ký bản mỏng các carotenoid trong các mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC 3 Hình ảnh sắc ký hiệu năng cao các mẫu nghiên cứu

PHỤ LỤC 4 Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao các mẫu nghiên cứu

PHỤ LỤC 5 Các bảng số liệu nghiên cứu trong luận án

PHỤ LỤC 6 Khối phổ các carotenoid

PHỤ LỤC 7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân các carotenoid

PHỤ LỤC 8 Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm TPCNOcpola

PHỤ LỤC 9 Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm Kingpharocula

Carotenoid còn được dùng rộng rãi làm các phẩm màu thực phẩm Đặc biệt

là các carotenoid được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất thức ăn cho chăn nuôi

gà, nuôi trồng thủy sản như tôm, cá hồi… Nguồn nguyên liệu chính sản xuất carotenoid là thực vật và vi sinh vật, một số carotenoid đã được sản xuất bằng tổng hợp hóa học như astaxanthin và canthaxanthin

Gần đây, carotenoid được sử dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm chức năng

bổ sung dinh dưỡng bởi chúng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư như  – carotene,  – carotene,  – carotene, lutein, zeaxanthin, lycopene…

Trên thị trường quốc tế,  - carotene được chiết xuất từ củ cà rốt, dầu cọ đỏ

và từ vi tảo Dunaliella salina…; lycopene được chiết xuất từ quả cà chua; lutein

được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ, zeaxanthin được chiết từ ngô vàng…

Ở nước ta có nguồn nguyên liệu carotenoid rất độc đáo và đặc hiệu là quả gấc chín Màng đỏ hạt gấc là nguyên liệu giàu  - carotene và lycopene, phần cùi thịt vàng của quả gấc và lá gấc cũng chứa nhiều  - carotene

Đất nước ta với nhiều loại cây cỏ là nguồn tài nguyên đa dạng phong phú để tìm kiếm thêm các loại carotenoid mới và dùng làm nguyên liệu để sản xuất các carotenoid đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới nhằm cung cấp cho nhu cầu sử dụng làm thuốc, mỹ phẩm, phẩm màu, phụ gia thức ăn của gia cầm, cá, tôm… và còn có nhiều tiềm năng xuất khẩu

Từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và xác

định hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ cây cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng”

Đề tài này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn cho công cuộc bảo vệ và nâng cao sức khỏe cộng đồng

Mục tiêu của đề tài:

- Chiết xuất, tinh chế một số carotenoid có trong cây cỏ Việt Nam và xác định bản chất hóa học của một số carotenoid bằng các phương pháp hiện đại như sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, khối phổ và cộng hưởng từ Qua đó sàng lọc, để tìm các thực vật có chứa hàm lượng cao  - carotene, lycopene và lutein

- Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của  - carotene, lycopene, lutein, và

sản phẩm thực phẩm chức năng TPCN Ocpola trong điều kiện in vitro qua các chỉ

số enzyme oxy hóa như catalase, peroxidase, cytochrome b5, GOT, GPT, và lên tế bào gan chuột Nghiên cứu khả năng gây độc lên dòng tế bào ung thư biểu mô miệng KB, ung thư tuyến tiền liệt LNCap, khảo sát khả năng cảm ứng caspase-3 lên dòng tế bào ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7, Nghiên cứu ảnh hưởng của các

hoạt chất carotenoid và TPCN Ocpola trong điều kiện in vivo lên chuột bị gây độc

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CAROTENOID

1.1.1 Carotenoid

1.1.1.1 Giới thiệu chung

Thuật ngữ carotenoid dùng để chỉ một nhóm gồm khoảng 600 sắc tố tồn tại trong lạp màu của thực vật và các cơ quan quang hợp ở một số loài tảo, nấm và thậm chí là một số vi khuẩn, động vật Trong thực vật chúng có vai trò hấp thu năng lượng mặt trời để sử dụng trong quang hợp và đồng thời bảo vệ chlorophyll khỏi tác hại của các photon

Sắc tố carotene màu vàng, dạng tinh thể được tách thành công lần đầu tiên vào năm 1831 bởi Wackenroder, còn xanthophyll được tách chiết thành công lần đầu tiên vào năm 1837 bởi Berzelius [55] Giả thuyết về sự tồn tại của các sắc tố này trong lá cây xanh lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1827 và 30 năm sau đã được chứng minh đầy đủ bởi Fremy và Stokes [54, 55] Tuy nhiên những nghiên cứu về carotene và xanthophyll thực sự phát triển khi Tswett phát minh ra kỹ thuật sắc ký và chỉ ra rằng chúng thuộc cùng nhóm carotenoid [55]; khi Zechmeister phát hiện ra carotenoid là các polyen Sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật quang phổ, cộng hưởng từ hạt nhân và kỹ thuật khối phổ đã tạo ra những bước nhảy vọt trong nghiên cứu về đặc điểm hóa học của carotenoid [55] Ngày nay chúng ta đã có hiểu biết khá đầy đủ về hóa học các carotenoid

Mặc dù trong thiên nhiên số lượng carotenoid nhiều như vậy nhưng chỉ có khoảng 50 loại carotenoid trong các thực phẩm và chỉ có 14 - 20 loại phát hiện thấy trong máu người Như vậy, chỉ một số ít carotenoid được hấp thu, còn lại chúng theo đường ruột thải ra ngoài

1.1.1.2 Cấu trúc hóa học và phân loại các carotenoid

Carotenoid là các hợp chất thuộc nhóm tetra terpenoid, là các hợp chất hữu

cơ có 40 nguyên tử carbon Chúng cấu trúc thành một chuỗi polyen, và đôi khi kết thúc bằng các vòng thơm, có cấu tạo cơ bản gồm 8 đơn vị isoprenoid (ip) liên kết với nhau mà trung tâm phân tử nằm giữa hai nhóm methyl ở vị trí 1, 6 (hình 1.1)

[55, 128] Tất cả các carotenoid khác nhau thường là dẫn xuất từ C40H56 không vòng (acyclic), là các phân tử có cấu trúc chuỗi dài với nhiều liên kết đôi liên hợp tạo thành nhờ các quá trình hydro hoá, đề hydro hoá, vòng hoá hoặc oxy hoá, chuyển liên kết nối đôi, chuyển nhóm methyl, kéo dài chuỗi hay cắt bớt chuỗi hoặc có thể kết hợp các quá trình trên

Hình 1.1 Cấu trúc khung carbon của các Carotenoid [55]

Nguyên tắc định tên cho carotenoid được quy định bởi IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) Trong hơn 600 carotenoid được biết đến hiện nay thì chúng được chia thành các nhóm như sau

 Các carotenoid hydrocarbon (trong cấu trúc phân tử chỉ có H và C)

17

18

1' 2' 3'

4' 5'

6' 7'

8'

9' 10'

19' 20'

Hình 1.2 Cấu trúc chung của các carotenoid hydrocarbon [55]

Các carotenoid này được đặt tên theo các nhóm chức đặc trưng của chúng Các các nhóm chức thường gặp được trình bày trong bảng 1.1

 Các carotenoid oxy (có thêm nguyên tử O trong cấu trúc)

Chúng được biết đến là các xanthophyll, được đặt tên theo vai trò thông thường của chúng, ví dụ điển hình là lutein

Bảng 1.2 Một số ví dụ về nhóm chức và các carotenoid chứa chúng [55]

Nhóm chức Carotenoid tương ứng Hydroxyl Zeaxanthin

Methoxy Spirilloxanthin Glycosyloxy Myxoxanthophyll Carboxy Torularhodin

HO

OH

Hình 1.3 Eschoscholtxanthin [55]

 Các seco- và apo-carotenoid

Một carotenoid sau khi bị loại bỏ O nhƣng số nguyên tử C vẫn không thay đổi thì đƣợc gọi là seco-carotenoid

Còn nếu bộ khung carbon bị rút ngắn đi thì đƣợc gọi là apo-carotenoid

Hệ thống các polyen cộng hợp và đặc trƣng các nhóm chức trong cấu trúc phân tử của carotenoid tạo nên các đặc điểm khác nhau trong phổ hấp phụ của chúng Phổ hấp phụ cực đại là đặc trƣng cho từng chất, từng dạng đồng phân và thậm chí là trong từng hệ dung môi hòa tan chúng

1.1.1.4 Tính chất hóa học

- Phản ứng với acid

Trong điều kiện acid, proton bị loại bỏ ở vị trí đầu vinyl, do đó ví dụ, isocryptoxanthin sẽ bị chuyển thành các dẫn xuất retro

- Phản ứng với base

Hầu hết các carotenoid đều bền với môi trường base Tuy nhiên cũng có ngoại lệ Astaxanthin nhanh chóng bị oxide hóa trong không khí thành astacen, còn peridinin và fucoxanthin lại kém bền với base, thậm chí là trong môi trường yếm khí

1.1.2 Vai trò của các carotenoid

1.1.2.1 Vai trò của carotenoid trong thực vật

Các chức năng được biết đến của carotenoid trong thực vật tất cả đều liên quan đến khả năng hấp thụ ánh sáng nhìn thấy của chúng Trong các mô quang hợp, chúng thể hiện rõ hai chức năng là quang hợp và bảo vệ các mô quang hợp khỏi bị oxy hóa bởi năng lượng mặt trời Còn ở các mô không quang hợp ở thực vật bậc cao, nấm hay vi khuẩn quang hợp thì chúng được biết đến như một tác nhân bảo vệ, tuy nhiên cho đến nay thì các cơ chế này còn chưa được chứng minh cụ thể [37,55,88] Các carotenoid sau khi hấp thụ ánh sáng, sẽ chuyển năng lượng thu được cho diệp lục Sở dĩ các carotenoid có khả năng lấy năng lượng từ ánh sáng mặt trời cũng như bảo vệ các cơ quan trong cây khỏi tác hại của các photon là vì chúng

có khả năng bắt giữ các điện tử, trung hòa các gốc tự do

Quá trình tạo thành carotenoid triplet trực tiếp từ trạng thái singlet kích thích không dễ dàng nhưng nếu lấy năng lượng từ các phân tử ở trạng thái triplet khác truyền tới thì sự hình thành carotenoid triplet lại thuận lợi hơn, vì năng lượng của các carotenoid có nhiều hơn bảy liên kết đôi ở trạng thái triplet thấp

Sự chuyển năng lượng từ các phân tử ở trạng thái triplet tới các carotenoid diễn ra hiệu quả và làm cho các phân tử oxy không nhận được nguồn năng lượng này, do đó không hình thành oxy singlet Mặt khác khi oxy singlet được tạo thành, carotenoid sẽ bắt giữ năng lượng kích thích để cho oxy singlet không thể chuyển tới

trạng thái kích thích cao hơn Carotenoid triplet có năng lượng rất thấp nên chúng không thể truyền cho các phân tử khác, vì thế chúng an toàn

Ta có thể hình dung cơ chế bắt giữ các oxy singlet như sau:

1

O + CAR -> 3O + 3CAR Chúng có thể tương tác với các gốc tự do R. + CAR(H) -> RH +CAR.

Hoặc R. + CAR -> R- +CAR+

1.1.2.2 Chức năng của các carotenoid đối với đời sống động vật và sức khỏe con người

Các sắc tố như carotenoid tìm thấy trong thực vật đóng vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất của chúng [6,55,71] Bên cạnh đó, chúng cũng quan trọng với động vật, đặc biệt là với đời sống con người, bởi khả năng bắt giữ các điện tử, trung hòa gốc tự do, chống oxy hóa…

Các gốc tự do, những mảnh phân tử, phân tử, ion hay nguyên tử tự do có một hay nhiều điện tử không ghép đôi Nếu chúng được sinh ra sẽ phản ứng dây chuyền với các phân tử bên cạnh tạo ra các gốc tự do mới Các gốc tự do được sinh ra trong

cơ thể sống bởi rất nhiều nguyên nhân như hô hấp tế bào, các yếu tố phóng xạ, tia tử ngoại, ánh sáng, dị vật, ô nhiễm, stress, thương tổn… trong đó nguyên nhân từ sự

hô hấp tế bào là chủ yếu Cho đến nay, người ta đã biết đến hơn 60 bệnh thường gặp

có liên quan đến tác hại của gốc tự do như ung thư, lão hóa, tim mạch… Hình 1.6 thể hiện những tác hại do các gốc tự do gây nên cho cơ thể sống

Các chất chống oxy hóa là một trong những hệ thống có vai trò khử các chất oxy hóa và gốc tự do gây hại cho tế bào và cơ thể Đây là cơ chế phản ứng để duy trì sự cân bằng nội bào, chính hệ thống này đã ngăn cản quá trình tạo ra nhiều gốc

tự do và hạn chế những tác hại của gốc tự do Hệ thống này tồn tại chủ yếu trong tế bào, chủ yếu là hồng cầu, ta có thể nói đến là các enzyme như superoxide dismutase, peroxidase, catalase…Việc tăng cường khả năng chống oxy hóa do gốc

tự do gây nên có thể làm chậm quá trình lão hóa, ngăn chặn sự xuất hiện của các bệnh tuổi già, tim mạch, ung thư để từ đó có thể đem lại cho con người sức khỏe tốt hơn, kéo dài tuổi thọ… Do đó, bên cạnh hệ thống nội sinh, việc bổ sung các chất có khả năng chống oxy hóa cũng là một giải pháp hữu hiệu Hiện nay các chất chống

oxy hóa như vitamin E, C, A đã được công nhận và sử dụng rộng rãi, đặc biệt là các chất có nguồn gốc thực vật như một số flavonoid, carotenoid…

Hình 1.6 Những tác hại do các gốc tự do gây nên cho cơ thể sống [85]

Các carotenoid thường định vị trong màng tế bào, ở đây chúng liên kết các thành phần cấu trúc của màng với nhau Vị trí carotenoid trong màng tế bào sẽ phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, cụ thể có sự khác biệt giữa carotene và xanthophyll Các nhóm tận cùng phân cực của xanthophyll sẽ tương tác với phần phân cực nằm phía ngoài màng, cho phép carotenoid được chuyển qua lớp màng kép Trong khi đó, các carotene với các nhóm tận cùng không phân cực sẽ bị chặn lại ở lớp màng kép, vì vậy chúng phải liên kết với các protein vận chuyển qua màng Hình 1.7 tóm tắt các tác dụng của carotenoid với sức khỏe con người

STRESS GỐC TỰ DO

TIM

CHD, xơ vữa, cao huyết áp, thiếu máu cục bộ

DA

Lão hóa da, sạm nắng, vảy nến, viêm da

THẬN

Các bệnh mạn tính

về thận

KHỚP Đau khớp,

thoái hóa khớp PHỔI Dị ứng,

hen, ung thư NÃO

Alzheimer, Parkinson, ung thư, đột quỵ, tự kỉ

Hình 1.7 Các tác dụng sinh học của carotenoid [55]

Từ rất lâu, con người đã nhận biết được những tác dụng có lợi của các sắc tố với sức khỏe Năm 1919, lần đầu tiên Steenbock đã nhấn mạnh rằng các thực vật có màu vàng như ngô vàng, cà rốt, khoai lang có thể ngăn ngừa được các triệu chứng

do thiếu Vitamin A khi nghiên cứu trên chuột trong khi đó các loại thực phẩm tương ứng như củ cải, khoai tây có màu trắng lại không có khả năng này [6,55,71]

Có khoảng 50 loại carotenoid khác nhau được phát hiện có thể làm tiền chất Vitamin A, trong đó chủ yếu là β-carotene Khi các carotenoid tiền Vitamin A được đưa vào cơ thể, chúng được enzyme phân cắt thành retinol (vitamin A) bằng cách này nguồn thực phẩm từ thực vật đã cung cấp khoảng 80% nhu cầu vitamin A hằng năm cho toàn thế giới [82] Chế độ dinh dưỡng thiếu hụt vitamin A rất phổ biến trên thế giới đặc biệt là các nước chưa phát triển và nó gây nên các triệu chứng như khô mắt, mù và thậm chí là chết cho hàng triệu trẻ em hàng năm Chính vì thế mà việc phát triển các nguồn carotenoid tiền chất vitamin A tiềm năng là một hướng rất quan trọng để nâng cao đời sống, sức khỏe con người

Các nghiên cứu về tác dụng của các hợp chất thứ sinh đã chỉ ra rằng, nguồn thực phẩm chứa carotenoid, và cả flavonoid đều giúp con người phòng một số dạng bệnh ung thư và giảm nguy cơ các bệnh về tim mạch [21,58,69] Một điều lí thú là không chỉ các chất tiền vitamin A, các chất như lycopene có nhiều trong cà chua và dưa hấu cũng có khả năng này Lycopene có khả năng chống oxy hóa cholesterol LDLc (low density lipoprotein) và hạn chế sự hình thành các xơ vữa trong động mạch do đó làm giảm các nguy cơ về bệnh tim mạch (LDL là một lipoprotein quan trọng, chúng có vai trò vận chuyển các cholesterol và triglycerit từ gan tới các mô

ngoại biên, đồng thời nó cũng điều hòa sự tổng hợp cholesterol tại những vị trí đó) Theo nghiên cứu của Agarwal S., và cộng sự, nếu cung cấp tối thiểu 40 mg lycopene mỗi ngày cho cơ thể thì có thể giảm được sự oxy hóa LDL, do đó làm giảm được các nguy cơ về bệnh tim mạch [24]

Các nghiên cứu gần đây của nhiều tác giả trên thế giới trên tế bào nuôi cấy, trên các mô hình động vật thực nghiệm cũng như trên người đã cho thấy rằng lutein

và zeaxanthin có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh về tim mạch, thoái hóa điểm vàng, đục nhân mắt và một số dạng ung thư như ung thư vú, phổi, tuyến tiền liệt, buồng trứng, thận cũng như ung thư dạ dày và phòng tránh các đột quỵ [27,32,56] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng chứng minh rằng cung cấp lutein sẽ cho chúng

ta một làn da khỏe mạnh, căng mịn, tránh được các nguy cơ của các tia tử ngoại UVA và UVB [58,96]

Cho đến nay, các carotenoid được biết đến như là một nhóm chất có khả năng chống oxy hóa và có vai trò trong việc phòng tránh một số bệnh như thoái hóa điểm vàng, viêm họng, hen suyễn, đục thủy tinh thể, ung thư cổ tử cung, loạn sản, nhiễm khuẩn, các bệnh về tim mạch, ung thư phổi, viêm phổi, ung thư thanh quản, vòm họng, một số triệu chứng vô sinh, viêm khớp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư

da, AIDS…

Trong khi nhiều thử nghiệm với các hợp chất chống oxy hóa riêng lẻ đã cho kết quả tốt trong việc giảm các nguy cơ có hại cho sức khỏe thì cũng còn nhiều nghiên cứu còn chưa đem lại thành công mong muốn Đây là một trong những dấu hỏi cho các nhà khoa học, bác sỹ và dược sỹ, bởi việc kiểm nghiệm ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa, kết hợp các chất chống oxy hóa với nhau tác động đến sức khỏe con người cần một quá trình lâu dài theo một quy trình nghiêm ngặt Tuy nhiên, một khuyến cáo được đưa ra là chúng ta nên tăng cường bổ sung các nguồn carotenoid từ hoa quả, rau xanh Đây cũng là một hướng đi chúng tôi rất quan tâm khi tiến hành đề tài này Việc điều tra, tìm kiếm những nguồn carotenoid dồi dào từ thiên nhiên có thể đưa ra các chế độ dinh dưỡng hợp lý, có lợi cho sức khỏe

Hình 1.8 β-carotene [55]

(β-carotene có công thức C40H56, M=536,873, có tên định loại theo IUPAC là trimethyl-2-[(1E,3E,5E,7E,9E,11E,13E,15E,17E)-3,7,12,16-tetramethyl-18-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexenyl)octadeca-1,3,5,7,9,11,13,15,17-nonaenyl]cyclohexene Thông thường có màu đỏ tía, nhiệt độ nóng chảy là 180 – 182 0

1,3,3-C

Phân bố phổ biến trong các loài thực vật, β-carotene còn được tìm thấy trong noãn hoàng của trứng Là nguồn thức ăn cho các loài động vật và con người

b Chức năng của β-carotene:

- Phòng chống các triệu chứng thiếu vitamin A Như đã trình bày một phần ở mục 1.1.2.2, đã có khoảng 50 carotenoid tiền vitamin A được phát hiện, tuy nhiên β-carotene cùng với α-carotene và -crytoxanthin là những tiền vitamin A hiệu quả, được sử dụng phổ biến nhất ở các nước Bắc Mỹ và châu Âu

- Chống oxy hóa và tăng cường miễn dịch Những năm gần đây, β-carotene

là một trong những đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất về khả năng phòng chống ung thư và ngăn ngừa các triệu chứng lão hóa ở con người, bởi khả năng loại bỏ các gốc tự do và tăng cường chức năng của hệ miễn dịch [69,79]

- Ngoài ra, người ta còn phát hiện thấy khả năng thúc đẩy sự liên kết giữa các

tế bào của β-carotene, do dó có thể phòng chống một số dạng ung thư [44]

- Bên cạnh đó người ta cũng đã phát hiện thấy có mối liên quan giữa carotene với quá trình sinh sản, nhất là đối với nữ giới

β-Nếu chế độ dinh dưỡng thiếu β-carotene trong một thời gian chưa dài thì có thể gây nên một số triệu chứng của thiếu vitamin A, sức khỏe giảm sút Còn nếu cung cấp lượng β-carotene quá thấp trong một thời gian dài có thể dẫn đến một số vấn đề về bệnh tim mạch cũng như ung thư

Tuy nhiên, nếu lượng -carotene cung cấp quá nhiều cũng có thể dẫn đến một số tác dụng ngược lại như vàng da

Các phát hiện gần đây cho thấy β-carotene có thể là một vũ khí quan trọng trong việc phòng tránh được các vấn đề về trí nhớ như căn bệnh Alzheimer‟s và các chứng bệnh mất trí nhớ khác [71]

Mres J., và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của β-carotene đối với khả năng liên quan đến nhận thức ở hai nhóm tình nguyện viên Một nhóm sử dụng dài hạn chất bổ sung này trong thời hạn trung bình là 18 năm Nhóm kia sử dụng ngắn hạn với thời hạn trung bình là một năm, lâu nhất là ba năm Những người thuộc nhóm

sử dụng β-carotene lâu dài được ghi nhận đạt được điểm cao hơn trong nhiều xét nghiệm liên quan đến nhận thức, đặc biệt là xét nghiệm về trí nhớ bằng lời Trong khi những người thuộc nhóm sử dụng ngắn hạn thì đạt được điểm thấp hơn người bình thường trong các xét nghiệm liên quan đến nhận thức [92]

β-carotene thường gặp trong gấc, cà rốt, dưa đỏ, cọ đỏ, vi tảo, củ cải đỏ, dâu tây, bí ngô, khoai lang, rau chân vịt, bông cải xanh, rau diếp Đặc biệt ở Việt Nam, chúng ta có một nguồn β-carotene rất dồi dào từ gấc Trước đây, người ta đã phát hiện được sự có mặt với hàm lượng rất cao β-carotene trong màng đỏ của quả gấc

chín, tuy nhiên gần đây, hàm lượng của chúng trong thịt quả gấc chín và lá gấc cũng được phát hiện rất cao

Ngoài nguồn thức ăn dồi dào carotene như trên, chúng ta có thể bổ sung carotene bằng cách uống các dạng thực phẩm chức năng chứa cao β-carotene từ cà rốt, tảo, đặc biệt là từ gấc Việt Nam Các sản phẩm dầu gấc Việt Nam như Vinaga, Gacavit… đang ngày được sử dụng rất rộng rãi, không chỉ trong nước mà còn xuất khẩu sang Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản…[75]

Lycopene cũng là một carotenoid hydro carbon, công thức C40H56, có tên

phân loại theo IUPAC là 2,6,10,14,19,23,27,31-Octamethyldotriaconta-2,6,8,10,12,14, 16,18,20,22,24,26,30-

(6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E,20E,22E,24E,26E)-tridecaene, với trọng lượng 536,873; thông thường có màu đỏ sẫm Nhiệt độ nóng chảy là 172–173 °C Cũng như các carotenoid, lycopene không tan trong nước mà tan trong các dung môi hữu cơ [55,128]

b Chức năng

Lycopene là một chất trung gian quan trọng trong các con đường sinh tổng hợp rất nhiều carotenoid [79]

Lycopene có công thức hoá học như hình 1.9 Ngoài khả năng bảo vệ tế bào oxi hoá, lycopene còn góp phần vào quá trình hấp thụ ánh sáng khi quang hợp Một

số nghiên cứu gần đây xác định rằng lycopene có khả năng làm chậm quá trình phát triển của ung thư tuyền tiền liệt, ruột kết và thực quản [71,103]…

Lycopene được biết đến như là một chất chống oxy hóa rất có tiềm năng, có thể trung hòa được các gốc tự do có hạt cho cơ thể con người Khi được hấp thu vào

cơ thể, lycopene tập trung ở gan, phổi, tuyến tiền liệt, ruột kết và ngoài da, và ở những cơ quan này, chúng luôn có nồng độ cao hơn những carotenoid khác [71]

Các nhà khoa học khuyến cáo rằng bổ sung những hoa quả và rau có nhiều lycopene sẽ cho chúng ta một sức khỏe tốt hơn [31,41,82] Trong một nghiên cứu kéo dài 6 năm tại Đại học Dược và Y tế công cộng Harvard, đã có hơn 47000 tình nguyện viên tham gia vào chế độ dinh dưỡng có nhiều lycopene Trong hơn 46 loại thực phẩm có lycopene thì nhóm ăn cà chua (hàm lượng lycopene cao nhất) được phát hiện thấy tỷ lệ bị ung thư tuyến tiền liệt thấp nhất

Theo Kaplan và cộng sự, lycopene - một chất chống oxy hóa có trong thành phần nhiều loại quả và hải sản, có thể làm tăng khả năng sinh sản của nam giới thông qua việc cải thiện chất lượng tinh trùng Ông đã cho 30 người đàn ông độ tuổi 23-45 bị vô sinh uống lycopene 2 lần/ngày, liên tục trong 3 tháng Kết quả cho thấy

có sự cải thiện rõ ràng của tinh trùng về mật độ (73%), hình dạng (63%) và khả năng hoạt động (75%) Vợ của 6 người đã mang thai sau cuộc thử nghiệm Theo các tác giả, việc dùng lycopene uống đã tỏ ra hiệu quả đối với những người bị vô sinh không rõ nguyên nhân Tinh hoàn chứa nhiều lycopene Ở những người đàn ông bị

vô sinh, nồng độ chất này thấp hơn rõ rệt so với người bình thường [79]

c Phân bố của lycopene

Lycopene phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên, thường gặp trong các loại quả như nho, cà chua, dưa hấu, nho đỏ, ổi, đu đủ, bí ngô và một số hải sản như sò, tôm… Trước đây, gấc Việt Nam được coi là nguồn β-carotene dồi dào thì gần đây, nhiều nghiên cứu hiện đại đã phát hiện được gấc chín nhũn có một hàm lượng

lycopene rất cao, bên cạnh đó thì trong lá gấc, quả mướp đắng, lá mướp đắng cũng chứa nhiều lycopene [125]

Khi đưa vào cơ thể thì lycopene từ cà chua ở dạng đã chế biến như sốt, nước

ép hay đã qua nhiệt lại cho hiệu quả cao hơn ở dạng tươi nguyên Đấy là do sự biến đổi về cấu trúc đồng phân từ dạng khó hấp thu về dạng hấp thu dễ hơn

epsilon-Lutein có trọng lượng phân tử là 568,871 g/mol Tan trong các dung môi hữu

cơ và không tan trong nước Cũng như zeaxanthin, nó được biết đến như một loại sắc tố có màu đỏ cam Lutein hấp thụ ánh sáng xanh do đó nó có màu vàng khi ở nồng độ thấp và ở nồng độ cao hoặc tinh thể thì có màu đỏ cam Không giống như

α, β, γ-carotene là những tiền chất của vitamin A, lutein lại không thể chuyển hóa thành vitamin A trong cơ thể [55,128]

b Chức năng

Cũng tương tự như carotene và lycopene, lutein có khả năng phản ứng với các gốc tự do, bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hoá, chống ung thư da, lão hoá da, thuỷ tinh thể Đặc biệt lutein có khả năng làm giảm hiện tượng xơ vữa động mạch, ung thư đường ruột…

Trong cơ thể người, lutein được tìm thấy nhiều ở mắt Lutein và một số carotenoid, tạo thành màu ở điểm vàng của mắt Nhiều nghiên cứu cho thấy khi lượng các carotenoid tăng, màu của điểm vàng cũng tăng Họ tin rằng có nhiều màu hơn sẽ góp phần tăng cường thị lực, bảo vệ điểm vàng tốt hơn Với một chế độ dinh dưỡng thiếu lutein hay carotenoid kéo dài có thể tăng cao các nguy cơ về bệnh tim mạch, ung thư Khi bổ sung hàm lượng lutein cao vào cơ thể thì không thấy có hiện tượng ngộ độc, tuy nhiên các nhà khoa học cũng khuyến cáo chúng ta không nên lạm dụng các chất bổ sung này

Dwyer H., và cộng sự cho rằng lutein có thể giảm bớt nguy cơ bị suy tim và tai biến mạch máu não Những người trong máu có hàm lượng lutein cao đều có khả năng giảm các nguy cơ có hại cho mạch máu [43] Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy lutein cũng có khả năng phòng chống các bệnh ung thư vú và ung thư đường ruột [52,78]

Theo Yang Y., và cộng sự, lutein trong các loại thực vật có lá màu xanh đậm bảo vệ được cho da trước các ảnh hưởng độc hại của nắng Họ thí nghiệm bằng cách cho một nhóm chuột ăn thức ăn chứa lutein liên tục hai tuần lễ, trong khi cho nhóm đối chứng ăn bình thường Sau đó chiếu tia cực tím trong 22 tuần thì thấy rằng số chuột ăn thức ăn chứa nhiều lutein ít bị ung thư, và nếu bị thì các khối u cũng nhỏ hơn và sống lâu hơn nhóm chuột đối chứng [48,122]

Nghiên cứu của E-Siong và cộng sự lại cho rằng lutein có thể bảo vệ võng mạc khỏi sự phá hủy bằng cách ức chế hiện tượng viêm Nghiên cứu này đã xem xét tác động của lutein đối với tình trạng thiếu máu cục bộ tại võng mạc, đây là nguyên nhân gián tiếp góp phần làm chết các tế bào thần kinh ở võng mạc được tìm thấy ở một số bệnh về mắt, như bệnh màng lưới liên quan đến tiểu đường và thoái hóa điểm vàng theo tuổi, là nguyên nhân gây mù phổ biến nhất ở những người trên 50 tuổi Họ đã sử dụng áp suất nội nhãn cao để làm giảm sự thiếu máu cục bộ tại võng mạc ở chuột già Sprague-Dawley Những con chuột được tiêm lutein vào thể kính cho thấy có sự ức chế protein COX-2 (một protein tiền viêm) và nNOS (neuronal Nitric Oxyde Synthsase) – nguyên nhân gây thiếu máu cục bộ võng mạc Đây là

những đóng góp quan trọng để chúng ta hiểu biết sâu hơn về cơ chế tác dụng của lutein trên hoạt động của mắt [49]

Lutein trước đây thường được dùng để bổ sung vào thức ăn cho gà để có lòng đỏ trứng vàng hơn, da vàng hơn, bởi vì nhu cầu thị hiếu của chúng ta là trứng

gà vàng đỏ sẽ tốt hơn, hơn nữa lutein từ lòng đỏ trứng dễ hấp thu hơn những nguồn lutein khác

c Phân bố của lutein

Lutein thường gặp trong nhiều rau quả, nhất là rau quả vùng nhiệt đới như ngô, xoài, khoai lang, bí ngô, rau spinash, ớt ngọt, củ cải, cải xoăn, các loại rau màu xanh đậm… Đặc biệt, lutein phân bố khá phổ biến trong cánh hoa của nhiều loài hoa màu vàng, như hoa cúc, cúc vạn thọ

Cũng như các carotenoid khác, lutein rất nhạy cảm với nhiệt độ và quá trình đun nấu Chế biến các loại thực phẩm, rau xanh quá lâu sẽ dẫn đến sự phân hủy lutein, làm giảm hàm lượng lutein

Một số người muốn bổ lutein bằng cách uống thuốc bổ, các sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung dinh dưỡng, thông thường người ta kết hợp bổ sung lutein

và zeaxanthin cùng với một số vitamin E, Selen Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng khuyên rằng nên ăn những thức ăn chứa nhiều lutein, hơn là chỉ uống những viên thuốc chứa lutein

Ngoài ra, còn có nhiều carotenoid khác phân bố khá rộng rãi và có tác dụng tốt với đời sống con người Zeaxanthin là một carotenoid thường có mặt cùng lutein, có tác dụng sinh học cũng tương đương lutein Asthaxanthin cũng là một carotenoid được sử dụng nhiều trong nông nghiệp, chăn nuôi để bổ sung nguồn vitamin, dinh dưỡng tốt

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG, DƯỢC PHẨM PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG

Những năm gần đây, nhờ những thành tựu mới của công nghệ sinh học (CNSH) chúng ta đã tạo ra được các loại thực phẩm có bổ sung một số tính chất thuốc, được gọi đó là “Thực phẩm chức năng”

1.2.1 Khái niệm về thực phẩm chức năng

Trong tài liệu “Functional Foods: Opportunities and Challenges” phổ biến vào năm 2003, FDA định nghĩa “Thực phẩm chức năng là những thực phẩm và các thành phần thực phẩm có thể cung cấp ích lợi sức khỏe ngoài giá trị dinh dưỡng căn bản Các thực phẩm này bao gồm thực phẩm thường dùng, thực phẩm được bổ sung, tăng cường hoặc hoàn chỉnh hơn và các thực phẩm phụ thêm” Thực phẩm chức năng có hình dáng bên ngoài tương tự như thực phẩm thông thường Ngoài khả năng dinh dưỡng cố hữu, các thực phẩm này phải được chứng minh một cách khoa học là có thể cung cấp những ích lợi sinh học và có khả năng giảm thiểu rủi ro mắc các bệnh mạn tính [75]

Tại Việt Nam, thông tư số 08/TT-BYT ngày 23-8-2004 của Bộ Y tế quy định: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm để hỗ trợ các chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng với các tác động bên ngoài [1,15]

Các loại TPCN không phải là thuốc, chúng an toàn, không có độc tính, không gây phản ứng phụ cho người sử dụng, có thể sử dụng lâu dài và không cần đơn bác sĩ Chúng thường được sản xuất từ các nguồn thực vật, động vật, tảo, khoáng chất, và một số rất nhỏ chất tổng hợp hóa học Ngày nay, với những cải tiến của công nghệ, các thực phẩm chức năng được sản xuất dưới dạng các viên nang cứng, nang mềm, viên nén, thuốc nước, cao thuốc, thuốc bột Hàng năm có hàng chục nghìn sản phẩm TPCN được lưu hành trên thị trường quốc tế Các sản phẩm

có thể là dạng đơn chất hoặc hỗn hợp nhiều loại Chúng có thể được chia thành nhiều nhóm như là nhóm sản phẩm tăng cường sinh lực, làm đẹp, kích thích, tăng cường hệ miễn dịch, hay hỗ trợ điều trị một số bệnh tật

Theo báo Nutrition Business Journal năm 2000, toàn thế giới đã sử dụng khoảng 65 tỉ USD các sản phẩm thực phẩm chức năng, bổ sung dinh dưỡng, trong

đó thị trường Bắc Mỹ chiếm 1/3, thị trường Châu âu chiếm 1/3, còn lại là Nhật bản

và các nước khác [75]

1.2.2 Vai trò của thực phẩm chức năng trong cuộc sống hiện đại

Hiện nay số người mắc bệnh như tiểu đường, ung thư, gan nhiễm siêu vi, huyết áp cao, mỡ trong máu, béo phì, miễn dịch bị suy yếu ngày càng tăng, chiếm 30-40% ở các nước phát triển Có rất nhiều lý do dẫn đến tình trạng này như cường

độ làm việc căng thẳng, thức ăn chế biến hay lương thực không an toàn, nhiều chất béo, dầu mỡ hay thịt cá có hoóc môn tăng trọng, thuốc trừ sâu thực vật, phụ gia, chất hóa học như gia vị, tạo ngọt, mùi, phẩm màu… Chi phí chữa chạy, chăm sóc những căn bệnh này vô cùng tốn kém, các chứng bệnh do lão hóa gây ra như mất trí nhớ (Alzheimer), Parkinson, ung thư… ở những người cao tuổi vẫn chưa có giải pháp can thiệp hiệu quả Do đó khuynh hướng quay trở về với thực phẩm thiên nhiên, khai thác bổ sung những kinh nghiệm về y học cổ truyền (Đông-Nam dược)

là xu thế phát triển của ngành TPCN, hạn chế tối đa việc đưa hóa chất vào cơ thể, làm suy yếu tính đề kháng, miễn dịch… Chính vì thế, các thực phẩm chức năng ngày càng chiếm nhiều ưu thế trong ngành dược hiện đại, bởi chúng có nguồn gốc

từ thiên nhiên, an toàn cho sức khỏe con người

Trong đó, các chất carotenoid ngày càng được sử dụng nhiều trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng, chúng thường được dùng để làm các sản phẩm chống oxy hóa, lão hóa, sáng mắt Trước đây, carotenoid được dùng trong chăn nuôi, người ta dùng asthaxathin từ vi tảo cho cá ăn, hoa cúc làm thức ăn cho gà, lợn Ngày nay, chúng không chỉ dừng lại trong chăn nuôi, các carotenoid được dùng nhiều trong ngành công nghiệp dược phẩm, ví dụ như lycopene được bổ sung vào các loại kem dưỡng da để giúp cho làn da khỏe và hồng hào hơn Hay người ta còn lợi dụng màu đặc trưng của các carotenoid để làm chất nhuộm màu, như bixin

Theo báo cáo trên BCC về thị phần các carotenoid trên toàn thế giới năm

2005 đã cho thấy rằng tất cả các carotenoid ước tính chiếm 887 triệu đô la Mỹ riêng trong năm 2004 và dự tính có thể tăng đến 1 tỉ đô la Mỹ năm 2009 Trong đó, beta-carotene được sử dụng nhiều nhất trong dược phẩm, chiếm 242 triệu đô la Mỹ năm

2004, dự kiến đến năm 2009 là 285 triệu đô la Mỹ Tiếp đến là lutein, đã được người ta chú ý đến, chiếm đến 139 triệu đô la Mỹ trong năm 2004

Theo Dược điển của Mỹ, beta-carotene được sử dụng để sản xuất các thuốc

bổ sung vitamin A, chất chống oxy hóa, thông thường được bào chế ở dạng hỗn hợp với lycopene, lutein hoặc với vitamin C, E, Selen Có nhiều hãng dược phẩm đã đưa

ra nhiều thuốc khác nhau, tuy nhiên, thành phần của chúng đều chứa beta-carotene kết hợp với một số vitamin khác Ví dụ như Natural Beta Carotene của hãng

Nature's Way có thành phần chủ yếu là beta-carotene từ tảo D salina hay Marine

beta-carotene của hãng Jarro Formulas

Hình 1.11 Sản lượng các carotenoid trong năm 2004, dự kiến năm 2009 [51]

Lutein thường được tách chiết từ cánh hoa cúc vạn thọ, quả kỳ tử… kết hợp với flavonoid hoặc một số vitamin, selen để làm thành các sản phẩm có tác dụng chống ung thư, bổ mắt…trên thị trường Ví dụ như hình 1.12, các sản phẩm chứa lutein từ cúc vạn thọ của hãng Nature‟s Bonty, hay rất nhiều sản phẩm của Roche, OPTISHARP™ (chứa zeaxanthin), canthaxanthin (tảo)

Trên thế giới sử dụng lycopene từ cà chua, được đưa vào nhiều sản phẩm như là REDIVIVO™ (lycopene) TIWLAB, MEGAEXTENSION

Mega lycopene của

LifeExtension [125]

Marine Beta-carotene của Jarrow [126]

Lutein của hãng Nature‟s Bonty [127]

Hình 1.12 Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa carotenoid

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu tạo ra các chế phẩm thực phẩm chức năng với phương châm “công nghệ cao, bản sắc cổ truyền” đang là hướng nghiên cứu rất lý thú và có lợi thế, vì lẽ chúng ta có thế mạnh về tài nguyên sinh học nhiệt đới và có kho tàng kinh nghiệm phong phú của y học dân tộc Tuy nhiên, đây là lĩnh vực rất mới, đòi hỏi dây chuyền hiện đại

Hiện tại, chúng ta có thể thấy khá nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng chứa beta-carotene từ gấc được bán trên thị trường và xuất khẩu sang các nước phương Tây, như dầu gấc Vinaga, Garoten, Lycogac (hình 1.14) Nhưng thực ra, những sản phẩm này chỉ là dạng dầu tách từ màng hạt gấc chín, chưa được tiêu chuẩn hóa, không kiểm soát được nguồn gấc tốt và ổn định trong nhân dân

Xí nghiệp dược Trung ương 25, Công ty Cổ phần Dược Traphaco, và Công

ty Inmexpharm đã đăng ký chất lượng hàng hoá tại Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm, được Bộ Y tế cấp giấy phép sản xuất, lưu hành trong toàn quốc Ta có thể kể đến một số sản phẩm như Uphaton, Tiên Dung, Dinta của Xí nghiệp dược Trung ương 25, Hoạt huyết dưỡng não của Traphaco, hay Vinaga của Công ty chế biến dầu TV&TP Việt Nam Imexpharm giới thiệu sản phẩm Max-Go lutein (hình 1.14) đây là sản phẩm với sự kết hợp của 4 hoạt chất: lutein, zeaxanthin, vitamin A, vitamin E giúp phòng các bệnh về mắt, nhất là bệnh thoái hóa điểm vàng và bệnh

đục thủy tinh thể Sản phẩm Max-Go lutein chứa lutein và zeaxanthin lần đầu tiên sản xuất tại Việt Nam và tại Công ty Imexpharm

Thế giới hiện đại đang có xu hướng quay về với các hợp chất thiên nhiên có trong động vật và cây cỏ, khai thác kinh nghiệm y học cổ truyền và nền văn minh

ẩm thực của các dân tộc phương Đông, hạn chế tối đa việc đưa các hoá chất vào cơ thể - thủ phạm của các phản ứng phụ, quen thuốc, nhờn thuốc (hiện nay, 90-95% số nhóm chất quan trọng như kháng sinh, các loại vitamin, các nội tiết tố có nguồn gốc hoá học tổng hợp) Xu thế này cùng với những thành công bước đầu đã đạt được và những tiềm năng to lớn của chúng ta về tài nguyên sinh học, đó là những

cơ sở quan trọng để chúng ta đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất các loại thực phẩm chức năng - một lĩnh vực có nhiều triển vọng

Dầu gấc của

VNPOFOOD [128]

Lycogac của HATAPHAR [129]

Max-Go lutein của Imexpharm [130] Hình 1.13 Một số sản phẩm TPCN chứa các carotenoid sử dụng ở Việt nam

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi đã sử dụng 128 mẫu thực vật như bảng 2.1

Bảng 2.1 Các mẫu thực vật sử dụng trong nghiên cứu

1 Cánh hoa bách nhật Gomphreana globasa L

2 Cánh hoa ban tía Bauhinia purpurea L

3 Cánh hoa bằng lăng Lagerstroemia speciosa (L.) Pers

4 Cánh hoa bí ngô Cucurbita moschata (Duch ex Lamk.) Duch

ex Poir

5 Cánh hoa bông xanh Thubergia grandiflora (Roxb ex Rottl.) Roxb

6 Cánh hoa cải canh Brassica juncea (L.) Czern et Coss

7 Cánh hoa cải cúc Chrysanthemum coronarium L

8 Cánh hoa cúc chuồn chuồn Cosmos sulphureus Cav

9 Cánh hoa cúc gót Melampodium divaricatum Pers

10 Cánh hoa cúc tím Chrysanthemum sp

11 Cánh hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L

12 Cánh hoa cúc vàng Chrysanthemum indicum L

13 Cánh hoa dâm bụt Hibiscus rosa – sinensis L

14 Cánh hoa dâm bụt kép Hibiscus syriacus L

15 Cánh hoa di nha Zinnia elegans L

16 Cánh hoa điệp Caesalpinia crista L

17 Cánh hoa đơn đỏ Ixora coccinea L

18 Cánh hoa đồng tiền Gerbera jamesoni L

19 Cánh hoa găng Randia spinosa (Thunb.) Poir

20 Cánh hoa hồng nhung Rosa chinensis Jacq

21 Cánh hoa hồng tiểu muội Rosa floribanda Lour

22 Cánh hoa hồng vàng Rosa chinensis Jacq

23 Cánh hoa hướng dương Helianthus annuus L

24 Cánh hoa keo lá tràm Melaleua cajuputi Roxb

25 Cánh hoa lục bình Eichhornia crassipes (Mart.) Solms

26 Cánh hoa lưu ly Mysbicus syriacus

27 Cánh hoa ly vàng Lilium spp

28 Cánh hoa mào gà đỏ Celosia argentea L

29 Cánh hoa mười giờ Portμlaca pilosa L

30 Cánh hoa muồng Cassia multijuga Rich

31 Cánh hoa mướp Luffa cylindrica (L.) M Roem

32 Cánh hoa ngâu Aglaia odosata Lour

33 Cánh hoa ngũ sắc Lantana camara L

34 Cánh hoa salem Limonium sinuatum (L.) Mill

35 Cánh hoa súng tím Nymphaea nouchali Burm

36 Cánh hoa thì là Anethum graveolens L

37 Cánh hoa thiên lý Telosma cordata (Burm.) Merr

38 Cánh hoa thông thiên Thevetia peruviana (Pers.) K Schum

39 Cánh hoa tường vi Lagerstroemia indica L

40 Cánh hoa cúc nhật European michaelmas Daisy L

41 Cánh hoa vàng anh Saraca dives Pierre

42 Cây cỏ xước Achyranthes aspera L

43 Cây cối xay Abutilon indicum Sweet

44 Cây con khỉ Pseuderanthemum palatiferum (Ners.) Radlk

46 Cây nghệ đen Curcuma aeruginosa Roxb

47 Cây ngũ gia bì Schefflera heptaphylla L

48 Cây râu mèo Ruellia tuberosa L

49 Trà hoa vàng Cúc Phương Camellia cucphuongensis Ninh ex Rosmann

50 Trà hoa vàng nhạt C flava (Pitard.) Seally

51 Trà hoa vàng Ginbéc C gilbertii (Merr.) Cohen Stuart

52 Trà hoa vàng Hakoda C hakodae Hakoda ex Ninh

53 Trà hoa vàng nhiều lông C hirsuta Ninh

54 Trà hoa vàng Petelo C petelotii Ninh

55 Trà hoa vàng Phan C phanii Ninh

56 Củ khoai lang Ipomoea batatas (L.) Poir

57 Cùi thịt quả gấc chín Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng

58 Cùi thịt quả mướp đắng chín Momordica charantia L

59 Lá bầu Lagenaria siceraria (Mol.) Standl

60 Lá bi đao Benincasa hispida (Thunb ex Murr.) Cogn

61 Lá bí ngô Cucurbita moschata (Duch ex Lamk.) Duch

62 Lá bồ công anh Lactuca indica L

63 Lá cải bẹ Brassica campesstris L

64 Lá cải cúc Chrysanthenum coronarium L

65 Lá cải ngọt Brassica integrifolia L

66 Lá cải soong Rosippa nasturtium aquaticum (L.) Hayek

67 Lá cải thìa Brassica chinensis L

68 Lá cỏ bợ Marsilea quadrifolia L

69 Lá đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms

70 Lá đỗ tương Glycine max (L.) Merr

72 Lá dưa chuột Cucumis sativus L

73 Lá gấc Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng

81 Lá mùi tàu Eryngium foetidum L

82 Lá mướp đắng Momordica charantia L

83 Lá mướp thường Luffa cylindrica (L.) M Roem

84 Lá ngải cứu Artemisia vulgaris L

85 Lá rau dệu Alternanthera sessilis (L.) A DC

86 Lá rau má Centella asiatica (L.) Urb

87 Lá rau muống Ipomoea aquatica Forsk

88 Lá rau ngổ Enydra fluctuans Lour

89 Lá rau ngót Sauropus andpogynus (L.) Merr

90 Lá rau răm Polygonum odoratum Lour

91 Lá rau sam Portulaca oleracea L

92 Lá su su Sechium edμle (Jacq.) Sw

93 Lá tía tô Perilla frutescens (Thunb.) Kudo

94 Lá tỏi tây Allium fistulosum L

95 Lá trầu không Piper betle L

96 Màng hạt gấc chín Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng

97 Màng hạt mướp đắng chín Momordica charantia L

98 Nhị sen trắng Nelumbo nucifera Gaertn

99 Rau cần tây Apiumgra veolens L

100 Rau đay Corchorus olitorius L

101 Rau dền cơm Amaranthus visidis L

102 Rau dền gai Amaranthus spinosus L

103 Rau dền tía Amaranthus tricolor L

104 Rau diếp cá Houttuynia cordata Thunb

105 Rau húng Mentha arvensis L

106 Sâm đại hành Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban

107 Súp lơ xanh Brassica oleracea L

108 Thịt quả bí ngô Cucurbita moschata L

109 Thịt đu đủ chín Carica papaya L

110 Thịt đu đủ xanh Carica papaya L

111 Thịt múi mít Artocarpus heterophyllus Lamk

112 Thịt ớt đỏ Capsicum minimun Roxb

113 Thịt ớt vàng Capsicum acuminatum Bailey

114 Thịt quả bàng Terminalia catappa L

115 Thịt quả bơ Persea americana Miy

116 Thịt quả cà chua Solanum lycopersicum L

117 Thịt quả đa Ficus sumatrana (Miq.) Miq

118 Thịt quả dành dành Gardennia agusta (L.) Merr

119 Thịt quả đào Prunus persica (L.) Batsch

120 Thịt quả dứa Ananas comosus L

121 Thịt quả hồng trứng Diospyros kaki Thunb

122 Thịt quả mận Prunus salicina Lindl

123 Thịt quả ớt đỏ Capsicum fruntescens L

124 Thịt quả ớt xanh ngọt Capsicum fruntescens L

125 Thịt quả sim Rhodomyrtus tomentosa (Ait.) Hassk

126 Thịt quả trứng gà Lucuma mammosa (L.) Gaertn

127 Thịt quả xoài Mangifera indica L

128 Thịt vỏ hạt chanh leo Passiflora edulis Sims

- Máu người được cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung Ương

- Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

- Các dòng tế bào ung thư biểu mô miệng KB, ung thư tuyến tiền liệt LNCap, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi LU-1, do GS J M Pezzuto (Đại học Hawaii, Hoa

tôi sử dụng các hóa chất đạt độ tinh khiết phân tích (PA) Các chất chuẩn được mua

từ các hãng uy tín như Lutein (Sigma 95507-5MG), β-carotene (Sigma 5MG), lycopene (Sigma 36275-5G), Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Merck, Silicagel sắc ký cột của Merck (60756-50G), silicagel HPLC 100 C18 pha đảo

2 Hệ dung môi 2 (sắc ký lớp mỏng) n-hexane:ether dầu hỏa:acetone~2:1:1(v/v/v)

3 Hệ dung môi 3 (sắc ký lớp mỏng) n-hexane:ether dầu hỏa :acetone~20:19:1(v/v/v)

4 Hệ dung môi 4 (sắc ký cột lọc gel) ether dầu hỏa: acetone~9:1(v/v)

5 Hệ dung môi 5(HPLC) acetonitrine:methanol:chloroform~

55:23:22 (v/v/v)

- Hóa chất sử dụng cho các thí nghiệm thử hoạt tính sinh học: CCl4 (Sigma), curcumin (Sigma), ellipticine (Sigma), H2O2 (Fluka), NADH (Sigma), môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Gibco, Mỹ) và các hóa chất pha đệm đạt độ tinh khiết đảm bảo độ tin cậy cho các kết quả nghiên cứu

Bảng 2.3 Thành phần các loại đệm, dung dịch sử dụng trong các

nghiên cứu hoạt tính sinh học

1 CCl4 CCl4: dầu lạc ~ 1:10(v/v)

2 Dung dịch muối sinh lý NaCl 0,9%

3 Đệm acetate Natri acetate 0,2N, pH 4,7

4 Đệm phosphate 100nM Na2HPO4, 100mM NaH2PO4, pH 7,4

5 Đệm phân hủy 50mM Tris-HCl, pH 7,5

Các dung dịch, hệ đệm, hệ dung môi được pha đúng quy cách, theo đúng quy trình của từng thí nghiệm yêu cầu từ các hóa chất tinh khiết ở trên

Thiết bị:

Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị chiết xuất và tinh chế carotenoid

3 Máy sắc ký hiệu năng cao HPLC LC 10Av Shimazu (Nhật)

4 Máy đo phổ cộng hưởng từ 500MHz AVANCE

VARIAN

Bruker (Đức)

5 Máy đo phổ khối MS-Engine-5989-HP HP(Mỹ)

Thiết bị cho các thí nghiệm hoạt tính sinh học

12 Máy phân tích hóa sinh máu Olympus (Nhật)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết xuất và tinh chế các carotenoid

- Sấy khô:

Trước tiên, các mẫu thực vật được thu hái ở Thành phố Hà Nội, được định loại bởi PGS.TS Trần Ninh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN); được rửa sạch, đem sấy ở 600C đến khối lượng không đổi, tán thành bột mịn

- Ngâm chiết:

Lượng 10gr bột khô mẫu thực vật được trộn đều với 100ml dung môi ether dầu hỏa (acetone), ngâm trong bình kín, tối màu, qua đêm (24-48h) Dung dịch ngâm được lọc qua phễu có giấy lọc để thu dịch trong, đem cô bằng hệ thống cô quay thu hồi dung môi để thu cao chiết

Lutein, là một carotenoid có oxi, nó lại không tồn tại trong thực vật ở dạng tự

do mà là dạng ester với palmitic acid Vì thế, quá trình tách chiết của chúng tôi phức tạp hơn đối với beta-carotene và lycopene, có thêm bước thủy phân lutein ester bằng KOH rồi trung hòa lại bằng HCl

- Sắc ký bản mỏng:

Sau khi thu được cao chiết, chúng tôi tiến hành làm sắc kí bản mỏng trên silicagel để xác định xem những mẫu nào chứa nhiều những chất chúng tôi tìm kiếm Đây là một bước sàng lọc rất hiệu quả để chọn các đối tượng chứa nhiều carotenoid

Lượng 0,1gr cao khô các mẫu thực vật được hòa tan lại với 1ml hệ dung môi sắc ký bản mỏng (hệ 1,2,3 như trên bảng 2.2) rồi đem ly tâm ở 4 0C để loại bỏ cặn không tan, thu lại cao bằng bốc hơi cách thủy Cao được hòa tan lại với 1ml dung môi sắc ký để chấm lên bản sắc ký silicagel tráng sẵn

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Từ những đánh giá ban đầu về hàm lượng carotenoid bằng sắc ký bản mỏng, các mẫu có nhiều carotenoid sẽ được tiếp tục nghiên cứu bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao, đây là một phương pháp hiện đại để phát hiện đồng thời nhiều chất và xác định thành phần, hàm lượng các chất có trong mẫu

Pha động: acetonitrine:methanol:chloroform = 55:23:22 (v/v/v) Tốc độ dòng 0,85 ml/phút, thời gian chạy 20 phút, pH 2-8, nhiệt độ 300C

Trong điều kiện phân tích sắc ký với pha động, tốc độ dòng, pha tĩnh, nhiệt độ cố định đã được chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu Rt của chất đó trên cột tách Vì thế, ta có thể phân tích định tính các chất trong mẫu bằng HPLC thông qua thời gian lưu mẫu chuẩn của chất đó

Để phân tích định lượng các chất, chúng ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao hoặc diện tích píc, ở đây, chúng tôi sử dụng số liệu diện tích píc

Trước tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát lập đường chuẩn của các carotenoid (beta-carotene, lycopene và lutein) trong cùng nồng độ từ 0,1 – 3,0 ppm Chất chuẩn được kiểm tra lại bằng HPLC và lập đường chuẩn cho mỗi đợt phân tích, tránh trường hợp carotenoid bị phân giải khi cất giữ Dựa vào số liệu diện tích các píc, chúng tôi sử dụng phần mềm LC Solution Version 10.1 để xây dựng đường chuẩn Từ đó, chúng tôi tính được hàm lượng của các carotenoid trong các mẫu nghiên cứu Sau đây là đường chuẩn của β-carotene, lycopene và lutein

Phương trình y=ax+b: Thông

số Giá trị Sai số