Cỏc chỉ số GOT và GPT mỏu và gan chuột

Sau khi lấy mẫu mỏu, chỳng tụi tiến hành xột nghiệm cỏc chỉ số GOT và GPT là hai enzyme chuyển húa nhúm amin của một acid amin sang một keto acid, liờn quan mật thiết đến sự phỏ hủy gan. CCl4 phỏ huỷ cỏc tế bào gan, gõy nờn những rối loạn thẩm thấu màng tế bào gan, từ đú dẫn tới sự giải phúng vào huyết thanh cỏc ion kim loại đặc biệt là hoạt độ và nồng độ enzyme GOT, GPT tăng mạnh.

a. Chỉ số GOT, GPT trong mỏu chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm

Hỡnh 3.13. Cỏc giỏ trị GOT, GPT trong mỏu ở cỏc lụ chuột thớ nghiệm

(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)

b. Chỉ số GOT, GPT gan chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm

Khi tế bào gan bị phỏ huỷ sẽ gõy tăng cao, nhanh hoạt độ của GOT, GPT trong mỏu. Ở lụ chuột bị gõy độc, chỉ số GOT và GPT tăng cao nhất, lần lƣợt là từ 135 U/L tăng lờn 685U/L và từ 49U/L tăng lờn 130U/L, (P<0,1), ở cỏc lụ gõy độc đồng thời sử dụng từng chế phẩm carotenoid, hoạt độ GOT và GPT đó giảm đi nhƣng vẫn cao hơn so với lụ đối chứng. Cỏc lụ gõy độc đồng thời cho uống TPCN Ocpola, giỏ

trị GOT và GPT lại giảm mạnh nhất. Điều này chứng tỏ việc sử dụng carotenoid, đặc biệt là TPCN Ocpola đó giỳp GOT và GPT dần phục hồi lại nhƣng rất chậm.

Hỡnh 3.14. Cỏc giỏ trị GOT, GPT trong gan ở cỏc lụ chuột thớ nghiệm

Nhƣ vậy, ở những lụ chuột bỡnh thƣờng sau khi cho sử dụng chế phẩm cỏc chỉ số GOT và GPT gần tƣơng đƣơng với lụ đối chứng, chứng tỏ chế phẩm carotenoid đó thể hiện tỏc dụng ở những lụ chuột đó gõy độc. Điều này đó đƣợc một số tỏc giả cụng bố gần đõy khi nghiờn cứu hoạt tớnh sinh học của carotenoid này trong điều kiện in vivo, mà đặc biệt là khả năng chống oxy hoỏ, giỳp bảo vệ cơ thể chống lại cỏc tỏc nhõn oxy hoạt động gõy phỏ huỷ cỏc đại phõn tử sinh học nhƣ DNA, protein và lipid [38,118]…

CCl4 là một chất ngoại sinh, khi đi vào cơ thể sẽ gõy độc lờn cơ thể, đặc biệt là gan, lỳc này cơ thể sẽ phản ứng lại bằng cỏch tăng cƣờng cỏc enzyme giải độc cụ

thể ở đõy là hoạt độ của catalase, peroxidase tăng gấp nhiều lần, chỉ số men gan GOT, GPT tăng cao và hàm lƣợng cytochrome b5 lại giảm.

Theo Chidambara Murthy [38] khi nghiờn cứu khả năng bảo vệ chuột bị gõy độc CCl4 bởi β-carotene từ tảo Dunaliella salina thỡ hoạt độ của catalase và peroxidase ở chuột bị gõy độc tăng gấp 2 lần so với chuột bỡnh thƣờng ở lụ đối chứng, và khi đƣợc bổ sung thờm β-carotene thỡ hoạt độ cỏc enzyme này cũng giảm xuống xấp xỉ đối chứng. Ở đõy, hoạt tớnh của cỏc hoạt chất của chỳng tụi cú phần tỏc động tốt hơn lờn cơ thể chuột ở cỏc lụ nghiờn cứu. Với cỏc nguồn khỏc nhau thỡ bản chất cỏc carotenoid cũng khỏc nhau, hoạt tớnh sinh học của chỳng cũng khỏc nhau, hơn nữa quỏ trỡnh tỏch chiết bởi cỏc dung mụi, nhiệt độ… cũng ảnh hƣởng đến hoạt tớnh sinh học, chớnh vỡ thế mà chỳng tụi đó kết hợp nghiờn cứu hoạt tớnh của cao viờn nang TPCN Ocpola, là một sản phẩm thực phẩm chức năng chỳng tụi đƣa ra với thành phần chớnh là lutein để bổ sung dinh dƣỡng cho mắt. Kết quả cho thấy, hoạt tớnh của TPCN Ocpola cũng tƣơng đƣơng với hoạt tớnh của cỏc chế phẩm carotenoid, và tƣơng đƣơng với một số cụng trỡnh đó cụng bố của cỏc tỏc giả khỏc.

3.2.2.6. Quan sỏt tiờu bản đỳc cắt tế bào gan chuột

Sau quỏ trỡnh nuụi chuột, chỳng tụi dung mẫu gan của 10 lụ thớ nghiệm để làm tiờu bản đỳc cắt. Đõy là một phƣơng phỏp mụ học rất phổ biến và chuyờn dụng để quan sỏt cỏc cấu trỳc tế bào học của cỏc mẫu nghiờn cứu, từ đú cú thể phỏt hiện đƣợc cỏc tổn thƣơng trong cấu trỳc mụ.

Từ kết quả quan sỏt hỡnh 3.15, ta cú thể thấy rằng, ở lụ số 2, chuột chỉ uống CCl4, tế bào gan bị tổn thƣơng rất mạnh. Giữa cỏc tế bào cú khoảng trống rộng hơn những mẫu gan của chuột đối chứng, điều này chứng tỏ, độ liờn kết, cỏc mụ liờn kết giữa cỏc tế bào gan của chỳng bị phỏ hủy rừ rệt. Bờn cạnh đú, ta thấy xuất hiện rất nhiều đại thực bào cú mặt quanh cỏc mạch mỏu, đồng thời xuất hiện cỏc tế bào đó bị chết, nhõn của chỳng đó bị teo đi, cú kớch thƣớc bộ hơn hẳn so với nhõn những tế bào gan bờn cạnh.

68 Lụ 1 Lụ 2 Lụ 3 Lụ 4 Lụ 5 Lụ 6 Lụ 7 Lụ 8 Lụ 9 Lụ 10

Mặt khỏc, ở cỏc lụ chuột từ 3 đến 6 là cỏc lụ chuột uống CCl4 kốm với cỏc chế phẩm carotenoid tinh sạch và TPCN Ocpola thỡ sự phỏ hủy ở gan gần nhƣ khụng nghiờm trọng nhƣ so với gan ở lụ chuột số 2, mà cú xu hƣớng đƣợc hồi phục, trở về với trạng thỏi tƣơng tự nhƣ mẫu gan chuột ở lụ đối chứng, điều này một lần nữa khẳng định khả năng bảo vệ gan của cỏc carotenoid và TPCN Ocpola.. Hơn nữa, ở cỏc mẫu gan ở lụ 7-10, chỉ bổ sung thờm dinh dƣỡng carotenoid và TPCN Ocpola, cỏc tế bào gan cú hỡnh thỏi tƣơng tự với mẫu gan ở lụ chuột đối chứng 1, chỉ uống nƣớc muối sinh lý.

Vanitha A. và cộng sự đó nghiờn cứu khả năng bảo vệ của β-carotene từ tảo

Dunaliella bardawil cũng cho kết quả tƣơng tự nhƣ nghiờn cứu của chỳng tụi [118]. Theo kết quả nghiờn cứu này, tế bào gan chuột trờn tiờu bản đỳc cắt ở lụ bị gõy độc uống kốm β-carotene đó đƣợc bảo vệ khỏi tỏc hại của CCl4 thể hiện ở sự gắn kết giữa cỏc tế bào, khụng cú nhiều đại thực bào hay cỏc tế bào chết. Qua đõy, ta cú thể một lần nữa khẳng định rằng, cỏc chế phẩm carotenoid cú khả năng bảo vệ gan. Hơn nữa, TPCN Ocpola cũng là sản phẩm thể hiện hoạt tớnh này rất tốt.

3.2.3. Hoạt tớnh của β-carotene, lycopene và lutein lờn cỏc dũng tế bào ung thƣ

Từ những khả năng chống oxy húa của cỏc chế phẩm β-carotene, lycopene và lutein, chỳng tụi đó tiến hành thử tỏc dụng của chỳng trong việc kỡm hóm, ức chế sự sinh sản hay diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro trong phộp thử độ độc tế bào. Đõy là một cơ sở để đỏnh giỏ khả năng sử dụng cỏc carotenoid này trong phũng chống ung thƣ. Chỳng tụi đó tiến hành thăm dũ ảnh hƣởng của β-carotene, lycopene và lutein lờn sự phỏt triển của cỏc dũng tế bào ung thƣ biểu mụ miệng KB và dũng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt LNCap. Bờn cạnh đú, chỳng tụi cũn thử kiểm tra sự cảm ứng enzyme caspase-3 trong 2 dũng tế bào ung thƣ phổi LU-1 và ung thƣ vỳ MCF-7.

3.2.3.1.Kết quả thử độ độc cỏc carotenoid và TPCN Ocpola lờn tế bào ung thư

Sau khi tiến hành thăm dũ cỏc chế phẩm ở cỏc nồng độ khỏc nhau, lần 1 ở cỏc nồng độ: 100, 80, 60, 40 g/ml; lần 2 ở cỏc nồng độ: 60, 50, 40, 30, 20, 10 g/ml đối cỏc dũng tế bào ung thƣ, và sau khi tiến hành thăm dũ ở cỏc nồng độ khỏc

nhau, chỳng tụi đó xỏc định đƣợc nồng độ chất chất thử phự hợp đƣa vào cỏc giếng là: 45, 40, 35, 30, 25 g/ml.

IC50 là giỏ trị nồng độ cỏc chất thử mà ở đú chỳng gõy chết 50% lƣợng tế bào nghiờn cứu. Khi thử ở cỏc nồng độ thớch hợp, chỳng tụi đó xỏc định đƣợc IC50 của dũng tế bào KB và LNCap đối với lycopene, lutein, β-carotene, TPCN Ocpola và chất chuẩn ellipticine nhƣ sau:

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

β –carotene Lycopene Lutein Ocpola Chất chuẩn ellipticine hoạt chất (u g /m l) IC50, KB IC50, LNCap

Hỡnh 3.16. Giỏ trị IC50 cỏc chế phẩm carotenoid và TPCN Ocpola trờn dũng tế bào KB và LNCap 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2

Dũng tế bào ung thư

u g /m l β –carotene Lycopene Lutein Ocpola Chất chuẩn ellipticine

Hỡnh 3.17. Nồng độ chế phẩm carotenoid và TPCN Ocpola tại giỏ trị IC50 của tế bào ung thƣ KB và LNCap

Từ cỏc kết quả trờn, chỳng tụi đi đến kết luận:

- Cỏc giỏ trị phỏt triển X0, C của 2 dũng tế và giỏ trị IC50 của chất chuẩn ellipticine đều nằm trong giới hạn cho phộp chứng minh độ tin cậy của phộp thử.

- Cỏc chế phẩm β-carotene, lycopene và lutein thể hiện độc tớnh trờn cả hai dũng tế bào ung thƣ KB và LNCap, khả năng này tăng dần theo thứ tự: lutein < β- carotene > lycopene.

- Cỏc chế phẩm β-carotene, lycopene và lutein và TPCN Ocpola thể hiện độc tớnh trờn dũng tế bào ung thƣ KB với chỉ số IC50 lần lƣợt là 38,72g/ml, 36,06g/ml, 39,21g/ml, 40,23g/ml,(P<0,1); đều lớn hơn chỉ số IC50 đối với dũng LNCap, lần lƣợt là 31,83g/ml, 31,01g/ml, 32,37g/ml, 33,36g/ml, (P<0,1). Điều này cú nghĩa là cỏc chế phẩm carotenoid thể hiện độc tớnh trờn dũng tế bào ung thƣ LNCap mạnh hơn đối với dũng tế bào ung thƣ KB.

Hỡnh 3.18 là hỡnh ảnh 2 dũng tế bào ung thƣ biểu mụ và ung thƣ tuyến tiền liệt dƣới tỏc dụng của chế phẩm lycopene tinh sạch.

Dũng tế bào KB ở nồng độ lycopene gần IC50, cỏc tế bào chết khoảng 50%

Dũng tế bào LNCap ở nồng độ gần IC50, cỏc tế bào chết khoảng 50%

Dũng tế bào KB ở nồng độ lycopene cao, cỏc tế bào chết gần 100%

Dũng tế bào LNCap ở nồng độ lycopene cao, cỏc tế bào chết gần 100%

Hỡnh 3.18. Hỡnh ảnh tế bào KB, LNCap dƣới tỏc dụng của lycopene ở nồng độ khỏc nhau.

Nhƣ vậy, qua việc tiến hành thớ nghiệm in vitro này với mục đớch nghiờn cứu khả năng phũng ngừa ung thƣ của carotenoid (β-carotene, lycopene và lutein) cũng nhƣ TPCN Ocpola, chỳng tụi cú thể núi rằng cỏc chế phẩm carotenoid tinh sạch đƣợc từ lỏ gấc, cà chua, cỏnh hoa cỳc vạn thọ và TPCN Ocpola đó thể hiện tớnh độc hay núi cỏch khỏc là thể hiện khả năng ức chế sự phỏt triển của cỏc dũng tế bào ung thƣ KB và LNCap. Tuy nhiờn nồng độ ức chế vẫn cũn ở mức khỏ cao, trong khi đú theo tiờu chuẩn quốc tế về một chất cú khả năng ức chế ung thƣ, nồng độ gõy chết

50% tế bào là dƣới 5g/ml đối với chất hoàn toàn tinh khiết là dƣới 20g/ml đối với dịch chiết thụ. Cỏc nghiờn cứu của Đỗ Thị Thảo về tỏc dụng của cỏc chất tỏch chiết từ cõy Bỏn chi liờn, Dừa cạn cho thấy nồng độ ức chế chỉ nằm trong khoảng từ 2- 10g/ml [22], trong khi đú nồng độ ức chế của cỏc carotenoid ở thớ nghiệm này là khoảng 30g/ml. Chớnh vỡ thế, ta khụng thể núi rằng caroitenoid cú khả năng ức chế ung thƣ, mà chỳng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ chất bổ sung dinh dƣỡng, cú khả năng hỗ trợ điều trị và phũng ung thƣ.

3.2.3.2. Kết quả thớ nghiệm cảm ứng enzyme Caspase-3 của của β-carotene, lycopene, lutein và TPCN Ocpola lờn LU-1 và MCF-7

Khụng chỉ dừng ở thớ nghiệm thử độc tớnh lờn sự sống sút của cỏc tế bào ung thƣ, chỳng tụi cũn tiến hành nghiờn cứu khả năng cảm ứng lờn enzyme caspase-3 trờn cỏc dũng tế bào ung thƣ. Đõy là một phƣơng phỏp hiện đại, dựa trờn cơ chế tỏc động của họ enzyme caspase lờn quỏ trỡnh tự chết theo chƣơng trỡnh của tế bào. Cỏc nghiờn cứu gần đõy cho thấy [80, 102,], sự chết của cỏc tế bào cú liờn quan đến rất nhiều caspase, trong đú caspase-2, caspase-3 cú vai trũ chủ đạo. Khi chỳng tăng thỡ quỏ trỡnh apoptosis đƣợc thỳc đẩy, do đú cú thể đẩy nhanh quỏ trỡnh ức chế khối u phỏt triển. Chỳng tụi là nhúm đầu tiờn ở Việt Nam tiến hành thớ nghiệm khả năng cảm ứng caspase-3 lờn dũng tế bào ung thƣ dƣới tỏc động của β-carotene, lycopene, lutein và TPCN Ocpola.

Hỡnh 3.19. Hoạt độ caspase-3 ở dũng tế bào ung thƣ phổi dƣới tỏc động của cỏc carotenoid

tinh sạch và TPCN Ocpola

Từ những kết quả trờn hỡnh 3.19, (bảng số liệu ở bảng 3.16, phụ lục 5), ta cú thể thấy rằng, đối với dũng tế bào ung thƣ phổi khi nồng độ cỏc chế phẩm tinh sạch -carotene, lycopene, lutein và TPCN Ocpola ở nồng độ 6,25 μg/ml, hoạt độ caspase-3 là 29,93 (ng/100 μl) với beta-carotene; 16,5 (ng/100 μl) với lycopene; 14,05 (ng/100 μl) với lutein, và 33,25 (ng/100 μl) với TPCN Ocpola, (P<0,05), ở nồng độ này, tế bào ung thƣ sống sút 100%, trong khi đú, curcumin là chất đối chứng dƣơng chỉ cảm ứng với caspase-3 lờn 34,88 (ng/100 μl). Do khả năng cảm ứng với caspase-3 tăng khi cho cỏc hoạt chất vào, nờn bƣớc đầu ta cú thể kết luận chỳng cú khả năng kiểm soỏt cỏc tế bào ung thƣ, hay sự phỏt triển của khối u. Ở tỉ lệ tế bào sống 100% (khi nồng độ cỏc hoạt chất là 6,25 μg/ml) thỡ TPCN Ocpola cú hoạt tớnh tốt nhất so với cỏc hoạt chất cũn lại và mạnh hơn so với chất đối chứng dƣơng curcumin.

Cũn tại cỏc nồng độ cỏc chế phẩm -carotene, lutein, lycopene và TPCN Ocpola tăng dần từ 6,25 μg/ml lờn 12,5 μg/ml, 25 μg/ml và 50 μg/ml thỡ kết quả lại cho thấy hoạt độ caspase-3 lại giảm đi. Nghịch lớ này xảy ra khụng phải vỡ cỏc hoạt chất bị giảm hoạt tớnh cảm ứng lờn caspase-3, mà tại vỡ lỳc này chỳng tỏc động lờn quỏ trỡnh chết theo chƣơng trỡnh của cỏc tế bào ung thƣ nờn tỉ lệ sống sút cỏc tế bào giảm mạnh, do đú caspase-3 cũng giảm theo.

Hỡnh 3.20. Hoạt độ caspase-3 ở dũng tế bào ung thƣ vỳ dƣới tỏc động của cỏc carotenoid

tinh sạch và TPCN Ocpola

Từ kết quả hỡnh 3.20, trờn dũng tế bào ung thƣ vỳ, khi nồng độ chế phẩm beta-carotene, lycopene, lutein, TPCN Ocpola, và curcumin ở 6,25 μg/ml, hoạt độ caspase-3 lần lƣợt ở cỏc giếng lần lựợt là 52,3 (ng/100 μl); 42,9 (ng/100 μl); 72,9 (ng/100 μl); 53,5(ng/100 μl), (P<0,05). Rừ ràng hoạt độ caspase-3 tăng, và lutein là mẫu cú hoạt tớnh mạnh nhất, lờn tới 72,9 (ng/100 μl), cao hơn hẳn curcumin 53,5 (ng/100 μl). Ta thấy rằng, hàm lƣợng caspase-3 cảm ứng trờn dũng tế bào ung thƣ vỳ tăng cao hơn so với tế bào ung thƣ phổi, điều này cũng tƣơng tự với cỏc cụng bố của một số tỏc giả nghiờn cứu trƣớc đõy, cỏc hoạt chất carotenoid cú tỏc dụng lờn cỏc tế bào vỳ, tuyến tiền liệt tốt hơn so với tế bào phổi. Một nghiờn cứu mới đƣợc cụng bố năm 2010 của Shiau J. [105] đó cho rằng β-carotene cú khả năng tăng cƣờng hoạt động của enzyme caspase-3 trờn dũng tế bào ung thƣ phổi ngƣời. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cũng cho thấy beta-carotene, lycopene, và lutein cú khả năng hỗ trợ chứ chỳng khụng hoàn toàn cú thể là chất chữa trị ung thƣ.

3.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ

Ngoài nguồn carotenoid từ những thực phẩm, hoa quả nhƣ kết quả ở phần 3.1, ngày nay cỏc chất bổ sung dinh dƣỡng cũn đƣợc cỏc nhà khoa học, dƣợc sĩ khuyờn dựng trong một số trƣờng hợp bị thiếu hụt. Từ những kết quả khả quan về

khả năng chống oxy húa của lutein cũng nhƣ -carotene, lycopene, chỳng tụi đó kết hợp thành phần cao từ cỏnh hoa cỳc và một số thành phần cao từ thịt quả mƣớp đắng, lỏ gấc hay piperine tạo nờn một số sản phẩm thực phẩm chức năng với mục

Cỏc chỉ số GOT và GPT mỏu và gan chuột

Húa chất và cỏc thiết bị thớ nghiệm

PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU