kiện in vivo trờn chuột
Mụ hỡnh thớ nghiệm nghiờn cứu khả năng bảo vệ gan và cơ thể chuột bị gõy độc bởi CCl4 đó đƣợc rất nhiều cụng trỡnh cụng bố với rất nhiều hoạt chất khỏc nhau [21,50,106], tuy nhiờn đõy là lần đầu tiờn ở Việt Nam chỳng tụi xỏc định tỏc dụng của carotenoid lờn chỳng. Sau 14 ngày thớ nghiệm, chỳng tụi tiến hành cõn chuột,
59
rồi thu mỏu và gan để xỏc định cỏc chỉ tiờu nhƣ là hoạt tớnh catalase, peroxidase, hàm lƣợng cytochrome b5, và chỉ số GOT và GPT.
3.2.2.1. Sự thay đổi trọng lượng trung bỡnh chuột trước và sau thớ nghiệm
Từ kết quả trờn hỡnh 3.7, chỳng tụi nhận thấy rằng ở lụ gõy độc (lụ 2) trọng lƣợng chuột tăng ớt nhất, tiếp đến ở cỏc lụ gõy độc đồng thời sử dụng chế phẩm (lụ 3, 4, 5, 6). Ở lụ đối chứng (lụ 1) và cỏc lụ sử dụng chế phẩm (lụ 7, 8, 9,10) trọng lƣợng chuột tăng nhiều nhất và tƣơng đƣơng nhau, (P<0,05).
Hỡnh 3.7. Sự tăng trọng lƣợng chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCNOcpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCNOcpola)
Từ đú cho thấy rằng việc sử dụng cỏc chế phẩm carotenoid làm phục hồi thể trọng chuột ở nhúm gõy độc, thể hiện ở chỗ trọng lƣợng chuột ở cỏc lụ cho uống CCl4 kốm với cỏc hoạt chất (lụ 3, 4, 5, 6) cao hơn lụ chuột chỉ uống chất độc (lụ 2. Bờn cạnh đú, việc sử dụng chế phẩm carotenoid làm tăng trọng lƣợng chuột khụng đỏng kể, bởi vỡ ở lụ đối chứng (lụ 1) và cỏc lụ chỉ sử dụng hoạt chất (lụ 7, 8, 9, 10) trọng lƣợng chuột tăng lệch nhau chỉ 1g, (P<0,05). Cú thể giải thớch rằng, cỏc chất
60
của chỳng tụi khụng cú khả năng làm tăng cõn chuột. Theo nhiều tài liệu tham khảo về carotenoid thỡ chỳng chỉ cú khả năng bảo vệ cơ thể, chứ khụng cú khả năng gõy tăng cõn.
3.2.2.2 Hoạt tớnh của catalase trong mỏu và gan chuột
a. Hoạt tớnh của catalase trong mỏu chuột thớ nghiệm
Hỡnh 3.8. Sự thay đổi hoạt độ catalase trong mỏu chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
Qua hỡnh 3.8, ta giả thiết ở ống đối chứng, khụng cú mẫu mỏu, hoạt độ của catalase đƣợc coi là 100%. Ở lụ 1, chuột chỉ uống muối sinh lớ, hoạt độ này cú tăng nhẹ so với lụ 2. Lụ 2 là chuột uống CCl4, Ở đõy hoạt độ catalase đó tăng lờn 600 lần, (P<0,05), điều này chứng tỏ của chỳng bị tổn thƣơng rất nhiều. Cũn đối với cỏc lụ chuột từ 3 đến 6, chỳng ngoài uống CCl4, cũn đƣợc bổ sung thờm cỏc chế phẩm tinh sạch beta-carotene, lycopene, lutein và TPCN Ocpola; ở đõy, hoạt độ catalase cú tăng so với lụ đối chứng, nhƣng rừ ràng là nhỏ hơn hoạt độ ở lụ 2, chỉ uống CCl4
một cỏch đỏng kể. Cũn đối với cỏc lụ chuột cũn lại từ 7 đến 10 là cỏc lụ chuột chỉ uống chế phẩm tinh sạch beta-carotene, lycopene, lutein và TPCN Ocpola; hoạt độ
61
của enyme catalase xoay quanh giỏ trị 100%. Từ đõy, ta cú thể thấy rằng khi gan bị tổn thƣơng bởi CCl4, cỏc chế phẩm carotenoid của chỳng tụi đó cú tỏc dụng bảo vệ, hoạt độ của catalase giảm đi đỏng kể.
b. Hoạt tớnh của catalase trong gan
Hỡnh 3.9. Sự thay đổi hoạt độ catalase gan chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
Từ kết quả hỡnh 3.9 ta cú thể nhận thấy rằng, hoạt độ của enzyme catalase trong gan chuột cũng tƣơng tự nhƣ trong mỏu chuột. Điều này khẳng định lại việc gan bị tổn thƣơng bởi CCl4, và cỏc chế phẩm carotenoid của chỳng tụi cú tỏc dụng làm giảm cỏc tổn thƣơng này.
3.2.2.3 Hoạt tớnh của peroxidase trong mỏu và gan chuột
62
Hỡnh 3.10. Sự thay đổi hoạt độ peroxidase mỏu chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
Peroxidase là một enzyme chống oxi húa quan trọng trong cú thể sinh vật, chỳng cú mặt trong tế bào chất và màng ti thể của hầu hết cỏc tế bào, đặc biệt là ở mỏu (hồng cầu) và gan là những cơ quan cú vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh giải độc và vận chuyển oxi. Sự biến đổi về hàm lƣợng và hoạt tớnh của nú là biểu hiện bất thƣờng của trạng thỏi sinh lý của cơ thể. Khi cơ thể sinh vật sẽ cú cơ chế bảo vệ, đỏp ứng với cỏc chất ngoại sinh để cõn bằng nội bào. Tuy nhiờn, trong đề tài này, chỳng tụi chỉ xỏc định hoạt tớnh của peroxidase ở mỏu và gan, mà khụng xỏc định hàm lƣợng, bởi vỡ trong cơ thể cũn cú một số enzyme giả peroxidase nhƣ hemoglobin, myoglobin, và catalase cũng là một enzyme cú cơ chế hoạt động tƣơng tự, chớnh vỡ thế việc xỏc định hàm lƣợng peroxidase hay catalase đều khụng chớnh xỏc.
Qua đõy cú thể thấy đƣợc sự thay đổi hoạt độ enzyme peroxidase trong 10 lụ chuột nghiờn cứu. Ở lụ 2, nuụi chuột chỉ uống CCl4, hoạt độ peroxidase tăng lờn rất
63
mạnh, hơn 600%, (P<0,05). Cũn ở lụ chuột từ 3 đến 6, chỳng đó giảm đƣợc xuống
cũn xấp xỉ 100%, (P<0,05). Cỏc lụ chuột khụng uống chất độc, mà chỉ uống chế
phẩm carotenoid của chỳng tụi, hoạt độ peroxidase cũng xoay quanh 100%,
(P<0,05).
b. Hoạt tớnh của peroxidase trong gan
Hỡnh 3.11. Sự thay đổi hoạt độ peroxidase gan chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
Nhỡn chung, ở lụ chuột số 2 chỉ uống chất độc CCl4, cơ thể chỳng sẽ đỏp ứng lại chất ngoại sinh bằng cỏch tăng cƣờng cỏc enzyme giải độc gan, chống oxy húa, chớnh vỡ thế mà hoạt tớnh của enzyme này tăng mạnh, thể hiện ở đõy là tăng đến 4-6 lần so với lụ đối chứng chỉ uống nƣớc muối sinh lý bỡnh thƣờng. Ở cỏc lụ chuột chỉ bổ sung cỏc hoạt chất carotenoid thỡ chỳng tụi thấy rằng hoạt độ của enzyme này hầu nhƣ khụng thay đổi so với lụ đối chứng 1, chứng tỏ cỏc hoạt chất của chỳng tụi khi đi vào cơ thể khụng gõy hại, hay gõy độc cho cơ thể, khụng gõy cảm ứng bảo vệ chống oxy húa. Cũn hoạt tớnh peroxidase ở cỏc lụ chuột uống độc kốm với cỏc hoạt chất (lụ 3,4,5,6) cho thấy chỳng đó cõn bằng về trạng thỏi gần nhƣ bỡnh thƣờng,
64
tƣơng đƣơng với lụ đối chứng, (P<0,05), kết quả này khẳng định khả năng bảo vệ cơ thể khi bị gõy độc.
3.2.2.4 Hàm lượng enzyme cytochrome b5 trong mỏu và gan chuột
Hỡnh 3.12. Hàm lƣợng cytochrome b5 trong mỏu và gan chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
Qua kết quả hỡnh 3.12, chỳng ta cú thể thấy hàm lƣợng cytochrome b5 cú sự thay đổi đỏng kể. Ở lụ chuột đối chứng chỉ uống dung dịch muối sinh lớ, hàm lƣợng cytochrome b5 là 0,085 và 0,089 μg/ml lần lƣợt ở mỏu và ở gan, (P<0,05), nhƣng ở lụ chuột uống CCl4, hàm lƣợng này chỉ cũn 0,04 μg/ml và 0,037 μg/ml, (P<0,05). Cỏc lụ chuột cú uống CCl4, hàm lƣợng cytochrome b5 ổn định hơn, trở về cỏc giỏ trị 0,09 μg/ml và 0,1 μg/ml, (P<0,05). Điều này chứng tỏ, cỏc chế phẩm tinh sạch carotenoid và TPCN Ocpola của chỳng tụi cú khả năng cõn bằng lƣợng cytochrome b5 ở chuột cú uống CCl4.
65
Sau khi lấy mẫu mỏu, chỳng tụi tiến hành xột nghiệm cỏc chỉ số GOT và GPT là hai enzyme chuyển húa nhúm amin của một acid amin sang một keto acid, liờn quan mật thiết đến sự phỏ hủy gan. CCl4 phỏ huỷ cỏc tế bào gan, gõy nờn những rối loạn thẩm thấu màng tế bào gan, từ đú dẫn tới sự giải phúng vào huyết thanh cỏc ion kim loại đặc biệt là hoạt độ và nồng độ enzyme GOT, GPT tăng mạnh.
a. Chỉ số GOT, GPT trong mỏu chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
Hỡnh 3.13. Cỏc giỏ trị GOT, GPT trong mỏu ở cỏc lụ chuột thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
b. Chỉ số GOT, GPT gan chuột ở cỏc lụ thớ nghiệm
Khi tế bào gan bị phỏ huỷ sẽ gõy tăng cao, nhanh hoạt độ của GOT, GPT trong mỏu. Ở lụ chuột bị gõy độc, chỉ số GOT và GPT tăng cao nhất, lần lƣợt là từ 135 U/L tăng lờn 685U/L và từ 49U/L tăng lờn 130U/L, (P<0,1), ở cỏc lụ gõy độc đồng thời sử dụng từng chế phẩm carotenoid, hoạt độ GOT và GPT đó giảm đi nhƣng vẫn cao hơn so với lụ đối chứng. Cỏc lụ gõy độc đồng thời cho uống TPCN Ocpola, giỏ
66
trị GOT và GPT lại giảm mạnh nhất. Điều này chứng tỏ việc sử dụng carotenoid, đặc biệt là TPCN Ocpola đó giỳp GOT và GPT dần phục hồi lại nhƣng rất chậm.
Hỡnh 3.14. Cỏc giỏ trị GOT, GPT trong gan ở cỏc lụ chuột thớ nghiệm
(Lụ 1: uống NaCl 0,9%, lụ 2: uống CCl4, lụ 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lụ 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lụ 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lụ 6: uống CCl4 + uống TPCN Ocpola, lụ 7: uống chế phẩm -carotene, lụ 8: chế phẩm lutein, lụ 9: uống chế phẩm lycopene, lụ 10: uống TPCN Ocpola)
Nhƣ vậy, ở những lụ chuột bỡnh thƣờng sau khi cho sử dụng chế phẩm cỏc chỉ số GOT và GPT gần tƣơng đƣơng với lụ đối chứng, chứng tỏ chế phẩm carotenoid đó thể hiện tỏc dụng ở những lụ chuột đó gõy độc. Điều này đó đƣợc một số tỏc giả cụng bố gần đõy khi nghiờn cứu hoạt tớnh sinh học của carotenoid này trong điều kiện in vivo, mà đặc biệt là khả năng chống oxy hoỏ, giỳp bảo vệ cơ thể chống lại cỏc tỏc nhõn oxy hoạt động gõy phỏ huỷ cỏc đại phõn tử sinh học nhƣ DNA, protein và lipid [38,118]…
CCl4 là một chất ngoại sinh, khi đi vào cơ thể sẽ gõy độc lờn cơ thể, đặc biệt là gan, lỳc này cơ thể sẽ phản ứng lại bằng cỏch tăng cƣờng cỏc enzyme giải độc cụ
67
thể ở đõy là hoạt độ của catalase, peroxidase tăng gấp nhiều lần, chỉ số men gan GOT, GPT tăng cao và hàm lƣợng cytochrome b5 lại giảm.
Theo Chidambara Murthy [38] khi nghiờn cứu khả năng bảo vệ chuột bị gõy độc CCl4 bởi β-carotene từ tảo Dunaliella salina thỡ hoạt độ của catalase và peroxidase ở chuột bị gõy độc tăng gấp 2 lần so với chuột bỡnh thƣờng ở lụ đối chứng, và khi đƣợc bổ sung thờm β-carotene thỡ hoạt độ cỏc enzyme này cũng giảm xuống xấp xỉ đối chứng. Ở đõy, hoạt tớnh của cỏc hoạt chất của chỳng tụi cú phần tỏc động tốt hơn lờn cơ thể chuột ở cỏc lụ nghiờn cứu. Với cỏc nguồn khỏc nhau thỡ bản chất cỏc carotenoid cũng khỏc nhau, hoạt tớnh sinh học của chỳng cũng khỏc nhau, hơn nữa quỏ trỡnh tỏch chiết bởi cỏc dung mụi, nhiệt độ… cũng ảnh hƣởng đến hoạt tớnh sinh học, chớnh vỡ thế mà chỳng tụi đó kết hợp nghiờn cứu hoạt tớnh của cao viờn nang TPCN Ocpola, là một sản phẩm thực phẩm chức năng chỳng tụi đƣa ra với thành phần chớnh là lutein để bổ sung dinh dƣỡng cho mắt. Kết quả cho thấy, hoạt tớnh của TPCN Ocpola cũng tƣơng đƣơng với hoạt tớnh của cỏc chế phẩm carotenoid, và tƣơng đƣơng với một số cụng trỡnh đó cụng bố của cỏc tỏc giả khỏc.
3.2.2.6. Quan sỏt tiờu bản đỳc cắt tế bào gan chuột
Sau quỏ trỡnh nuụi chuột, chỳng tụi dung mẫu gan của 10 lụ thớ nghiệm để làm tiờu bản đỳc cắt. Đõy là một phƣơng phỏp mụ học rất phổ biến và chuyờn dụng để quan sỏt cỏc cấu trỳc tế bào học của cỏc mẫu nghiờn cứu, từ đú cú thể phỏt hiện đƣợc cỏc tổn thƣơng trong cấu trỳc mụ.
Từ kết quả quan sỏt hỡnh 3.15, ta cú thể thấy rằng, ở lụ số 2, chuột chỉ uống CCl4, tế bào gan bị tổn thƣơng rất mạnh. Giữa cỏc tế bào cú khoảng trống rộng hơn những mẫu gan của chuột đối chứng, điều này chứng tỏ, độ liờn kết, cỏc mụ liờn kết giữa cỏc tế bào gan của chỳng bị phỏ hủy rừ rệt. Bờn cạnh đú, ta thấy xuất hiện rất nhiều đại thực bào cú mặt quanh cỏc mạch mỏu, đồng thời xuất hiện cỏc tế bào đó bị chết, nhõn của chỳng đó bị teo đi, cú kớch thƣớc bộ hơn hẳn so với nhõn những tế bào gan bờn cạnh.
68
Lụ 1 Lụ 2
Lụ 3 Lụ 4
Lụ 5 Lụ 6
Lụ 7 Lụ 8
Lụ 9 Lụ 10
69
Mặt khỏc, ở cỏc lụ chuột từ 3 đến 6 là cỏc lụ chuột uống CCl4 kốm với cỏc chế phẩm carotenoid tinh sạch và TPCN Ocpola thỡ sự phỏ hủy ở gan gần nhƣ khụng nghiờm trọng nhƣ so với gan ở lụ chuột số 2, mà cú xu hƣớng đƣợc hồi phục, trở về với trạng thỏi tƣơng tự nhƣ mẫu gan chuột ở lụ đối chứng, điều này một lần nữa khẳng định khả năng bảo vệ gan của cỏc carotenoid và TPCN Ocpola.. Hơn nữa, ở cỏc mẫu gan ở lụ 7-10, chỉ bổ sung thờm dinh dƣỡng carotenoid và TPCN Ocpola, cỏc tế bào gan cú hỡnh thỏi tƣơng tự với mẫu gan ở lụ chuột đối chứng 1, chỉ uống nƣớc muối sinh lý.
Vanitha A. và cộng sự đó nghiờn cứu khả năng bảo vệ của β-carotene từ tảo
Dunaliella bardawil cũng cho kết quả tƣơng tự nhƣ nghiờn cứu của chỳng tụi [118]. Theo kết quả nghiờn cứu này, tế bào gan chuột trờn tiờu bản đỳc cắt ở lụ bị gõy độc uống kốm β-carotene đó đƣợc bảo vệ khỏi tỏc hại của CCl4 thể hiện ở sự gắn kết giữa cỏc tế bào, khụng cú nhiều đại thực bào hay cỏc tế bào chết. Qua đõy, ta cú thể một lần nữa khẳng định rằng, cỏc chế phẩm carotenoid cú khả năng bảo vệ gan. Hơn nữa, TPCN Ocpola cũng là sản phẩm thể hiện hoạt tớnh này rất tốt.
3.2.3. Hoạt tớnh của β-carotene, lycopene và lutein lờn cỏc dũng tế bào ung thƣ
Từ những khả năng chống oxy húa của cỏc chế phẩm β-carotene, lycopene và lutein, chỳng tụi đó tiến hành thử tỏc dụng của chỳng trong việc kỡm hóm, ức chế sự sinh sản hay diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro trong phộp thử độ độc tế bào. Đõy là một cơ sở để đỏnh giỏ khả năng sử dụng cỏc carotenoid này trong phũng
