Tỡm ra đƣợc nguồn nguyờn liệu chứa nhiều carotenoid là một hƣớng của chỳng tụi khi thực hiện đề tài này. Tuy nhiờn, nghiờn cứu cỏc hoạt tớnh sinh học của chỳng là phần quan trọng nhất của đề tài này. Qua đú ta thể cú thể đƣợc tỏc dụng cú lợi của cỏc carotenoid để ứng dụng vào cuộc sống.
Trƣớc tiờn, chỳng tụi tỡm hiểu khả năng chống oxy hoỏ thụng qua ảnh hƣởng của chế phẩm lờn hoạt tớnh của cỏc enzyme peroxidase và catalase huyết thanh mỏu ngƣời trong điều kiện in vitro.
- Xỏc định ảnh hưởng của chế phẩm đến hoạt độ enzyme peroxidase theo phương phỏp E.C Xavran [19]
37
Dựa trờn cơ sở xỏc định tốc độ phản ứng oxy hoỏ cơ chất indigocarmine bằng hydroperoxide trong mụi trƣờng acid yếu khi cú sự tham gia của peroxydase trong mỏu ngƣời. Peroxidase là enzyme oxy hoỏ cỏc chất hữu cơ khi cú mặt H2O2 ở nồng độ thấp.
Indigocarmine + H2O2 Indigocarmine + H2O + O2
(dạng khử màu xanh) (dạng oxy hoỏ màu vàng)
Hoạt độ của enzyme đƣợc xỏc định bằng thời gian oxy hoỏ hết indigocarmine, dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng.
Phản ứng đƣợc tiến hành trờn cả 4 nhúm mỏu A, B, AB, O của ngƣời.
Tiến hành: 2 ml dung dịch đệm acetate 0,2N, pH 4,7 2 ml chế phẩm với cỏc nồng độ khỏc nhau 3 ml mỏu ngƣời pha loóng 500 lần
1 ml indigocarmine 0,001N 2 ml H2O2 0,2%
Lắc đều và đỏnh dấu thời gian phản ứng bằng đồng hồ bấm giõy kể từ khi bắt đầu cho H2O2 vào bỡnh phản ứng đến khi chuyển hết màu xanh sang màu vàng thỡ phản ứng kết thỳc.
- Xỏc định ảnh hưởng của chế phẩm đến hoạt độ enzyme catalase theo phương phỏp Bach và Zubkova [19]
Catalase phõn giải H2O2 thành H2O và O2. Lƣợng H2O2 thừa đƣợc chuẩn độ bằng KMnO4 trong mụi trƣờng acid. Phản ứng tiến hành theo phƣơng trỡnh:
2H2O2 2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 5O2
Chế phẩm cú khả năng phản ứng với H2O2 tạo thành sản phẩm oxy húa, do đú đó cạnh tranh cơ chất H2O2 với enzyme catalase. Phản ứng đƣợc tiến hành trờn cả 4 nhúm mỏu A, B, AB, O của ngƣời.
Tiến hành: 8 ml chế phẩm với cỏc nồng độ khỏc nhau 6,4 ml mỏu ngƣời pha loóng 200 lần
catalase peroxidase
38
4 ml H2O2 0,05% 1,6 ml H2SO4 10%
Tổng thể tớch 20 ml, đem lắc đều sau 30 phỳt chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N. Hoạt độ catalase đƣợc tớnh bằng lƣợng KMnO4 tỏc dụng với lƣợng H2O2 cũn lại sau phản ứng.
Ngoài ra, chỳng tụi cũn nghiờn cứu sự thay đổi hoạt tớnh của 2 enzyme này ở mỏu và gan khi cho chuột uống CCl4, là một chất độc gõy tỏc hại lờn gan. Khi chuột bị gõy độc gan bằng CCl4, chỳng tụi cũng nghiờn cứu sự thay đổi của 2 enzyme gan là GOT, GPT và định lƣợng cytochrome b5.
- Xỏc định chỉ số GOT và GPT [22,128]
GOT hay cũn gọi AST, là một loại transaminase aspartate aminotransferase cũn GPT là ALT, alanine aminotransferase. Chỳng xỳc tỏc cho hai phản ứng
aspartate + alpha-ketoglutarate glutamate + oxaloacetate alanine + alpha-ketoglutarate glutamate + pyruvate
Chỳng là 2 enzyme đƣợc coi cú liờn quan chặt chẽ đến sự tổn thƣơng hoặc viờm nhiễm ở gan, mặc dự ngƣời ta khụng chỉ phỏt hiện nú ở trong gan mà cũn ở nhiều cơ quan khỏc nhƣ thận, tim. Khi gan bị tổn thƣơng, nồng độ cỏc enzyme này thƣờng tăng cao và chỉ khi hết những tổn thƣơng thỡ chỳng mới trở lại bỡnh thƣờng.
Hai enzyme này đƣợc phõn tớch tại phũng Húa sinh của Bệnh viện Medlatec.
- Định lượng hàm lượng cytochrome b5 [21,104]
Cytochrome b5 là một hemoprotein cú mặt trong hầu hết cỏc tế bào sinh vật, tham gia vào quỏ trỡnh oxy húa cho cơ thể. Trong tế bào cytochrome b5 gắn vào màng microsome và cú chức năng vận chuyển điện tử giữa NADH và phõn tử O2 trong màng microsome.
Thớ nghiệm này đƣợc tiến hành theo phƣơng phỏp của Schenkman và cs [104]. Dựa vào sự hấp phụ khỏc nhau giữa trạng thỏi khử và trạng thỏi oxy húa của NADH của cytochrome b5 ở bƣớc súng 427 nm, ở nhiệt độ phũng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành: Cho 0,5ml dịch thử (mỏu chuột pha loóng 10 lần) vào 5,5 ml đệm 100 mM sodium phosphate, pH 7,4. Chia hỗn hợp thành 2 ống, ống thử cho thờm
39
100 μl NADH 1 mg/ml. Chờ 10 phỳt và đo quang phổ ở bƣớc súng 427 nm và 500 nm. Cỏch tớnh: đụphaloang E E ml mM Ccytb ( 427 500) ) / ( 5
Trong đú, ∆E427, ∆E500 là chờnh lệch giữa độ hấp phụ của mẫu thử và mẫu đối chứng ở bƣớc súng 427nm, 500nm.
ε: ε427nm/ ε500nm = 112 mM-1
cm-1
- Thớ nghiệm chống oxy hoỏ của chế phẩm carotenoid lờn tế bào gan chuột
H2O2 khụng những là một gốc tự do phổ biến mà cũn là một chất chuyển hoỏ thƣờng xuyờn xuất hiện ở trong cỏc tế bào động vật, đƣợc tạo ra do cỏc phản ứng khử oxy sinh học. Tuy nhiờn, H2O2 cũng là nguyờn nhõn gõy ra sự hỡnh thành cỏc gốc tự do nội sinh khỏc (vớ dụ nhƣ HO.) thụng qua cỏc phản ứng oxy hoỏ khử khỏc nhau trong tế bào và điều đú ảnh hƣởng nghiờm trọng tới sự sống cũn của tế bào. Do đú, để kiểm chứng khả năng bảo vệ tế bào trƣớc cỏc tỏc nhõn oxy hoỏ và cỏc gốc tự do của cỏc hoạt chất tiềm năng, cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng tế bào gan làm mụ hỡnh nghiờn cứu. Trong đú, tế bào gan với cỏc hệ enzyme khử độc nhƣ cỏc glutathione S-transferase (GSTs), NAD(P)H: (quinone-acceptor) oxidoreductase (QR), và UDP-glucuronsyltransferase ... luụn là cơ quan thải độc cho cơ thể, sẽ bị H2O2 tỏc động trực tiếp và hoạt chất cần kiểm tra sẽ đƣợc đƣa vào nhƣ chất bảo vệ. Nếu hoạt chất cú thể bảo vệ tế bào gan khỏi tỏc động của H2O2 sẽ đƣợc xem là cú hoạt tớnh chống oxy húa.
Tiến hành:
Tế bào gan chuột sẽ đƣợc phõn lập bằng Trypsin 1%. Sau khi đƣợc phõn lập, chỳng sẽ đƣợc đƣa vào đĩa thớ nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104 tb/giếng để nuụi qua đờm trong tủ ấm 5% CO2, ở 37oC. Tế bào sau đú sẽ đƣợc ủ với cỏc hoạt chất ở cỏc nồng độ khỏc nhau trong 2h. Tiếp theo, 100 M H2O2 sẽ đƣợc đƣa vào mỗi giếng và để tỏc động trong 2h. Để xỏc định số tế bào gan sống sút sau tỏc động của H2O2 cũng nhƣ tỏc động bảo vệ của hoạt chất nghiờn cứu, MTT nồng độ 1 mg/ml (50 l/giếng) sẽ đƣợc đƣa vào cỏc giếng và ủ tiếp trong 4h ở 37oC. Loại bỏ toàn bộ
40
dịch nổi và đƣa vào mỗi giếng 100 l/giếng DMSO 100% và đo mật độ quang học của chất formazan tạo thành bằng mỏy Microplate Reader ở 492 nm. Tất cả thớ nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để trỏnh sai số. Cỏc số liệu đƣợc xử lớ bằng phần mềm TableCurve 2D phiờn bản 4.0 để tớnh giỏ trị ED50.
2.2.3. Nghiờn cứu hoạt tớnh sinh học cỏc carotenoid lờn cỏc dũng tế bào ung thƣ
in vitro
- Phương phỏp thử độ độc tế bào lờn cỏc dũng tế bào ung thư (Cytotoxic assay) [110]
Phƣơng phỏp thử độ độc tế bào in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute) xỏc nhận là phộp thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phỏt hiện cỏc chất cú khả năng kỡm hóm sự phỏt triển hoặc diệt cỏc tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro [22]. Đõy là một phƣơng phỏp khỏ mới ở Việt Nam. Thớ nghiệm tiến hành xỏc định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giỏ trị OD tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phõn tử protein, do đú lƣợng tế bào càng nhiều thỡ lƣợng protein càng nhiều, tƣơng dƣơng với OD càng cao. Thớ nghiệm đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ sau:
- Trƣớc tiờn cỏc dũng tế bào ung thƣ đƣợc nuụi trong mụi trƣờng phự hợp cú bổ sung 10% huyết thanh phụi bũ FBS và cỏc thành phần cần thiết khỏc ở điều kiện 5% CO2, 370C. Tựy vào từng dũng tế bào nghiờn cứu cụ thể mà thời gian cú thể khỏc nhau.
- Cỏc chế phẩm carotenoid và chất đối chứng (10 μl) đƣợc pha trong DMSO 10%, đƣa vào cỏc giếng của khay 96 giếng.
- Trypsin húa tế bào thớ nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để đƣa về mật độ phự hợp.
- Thờm vào cỏc giếng thớ nghiệm lƣợng tế bào thớch hợp trong 190 μl mụi trƣờng, phỏt triển trong 3 - 5 ngày.
41
- Một khay 96 giếng khỏc khụng cú chất thử nhƣng cú tế bào ung thƣ sẽ đƣợc sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau một giờ, mẫu ở đĩa đối chứng ngày 0 sẽ đƣợc cố định bằng TCA 20% (Tricloacetic Acid).
- Sau giai đoạn phỏt triển, tế bào đƣợc cố định vào đỏy giếng bằng TCA 20% trong 30 phỳt ở 37 0C, nhuộm bằng SRB 0,4% trong 1 giờ ở 370C. Loại SRB, cỏc giếng đƣợc rửa lại 3 lần với acetic acid 1% rồi để khụ ở nhiệt độ phũng.
- Cuối cựng sử dụng Tris-base 10 mM để hũa tan lƣợng SRB đó bỏm và nhuộm cỏc phõn tử protein, đƣa lờn mỏy lắc nhẹ trong 10 phỳt, sử dụng mỏy ELISA Plate Reader để đọc kết quả hàm lƣợng ở bƣớc súng 515 nm.
- Phộp thử lặp lại 3 lần. Ellipticine (Sigma) luụn đƣợc sử dụng nhƣ một chất đối chứng dƣơng, là một chất cú khả năng diệt cỏc tế bào ung thƣ đó đƣợc thế giới cụng nhận [22], DMSO 10% đƣợc sử dụng nhƣ một đối chứng õm. Giỏ trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phỏt triển) sẽ đƣợc xỏc định nhờ phần mềm mỏy tớnh Table Curve 4.0.
Mục đớch của thớ nghiệm này là xỏc định khả năng ức chế (tớnh độc) của cỏc chế phẩm carotenoid lờn sự phỏt triển cỏc dũng tế bào ung thƣ biểu mụ miờng KB và ung thƣ tuyến tiệt liệt LNCap. Thớ nghiệm đƣợc tiến hành tại phũng Cụng nghệ Tế bào Động vật, Viện Cụng nghệ Sinh học.
- Cỏc chế phẩm đƣợc pha trong mụi trƣờng DMSO ở cỏc nồng độ khỏc nhau: 100, 80, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 10 g/ml.
- Chất chuẩn ellipticine (chất đối chứng dƣơng) đƣợc pha ở cỏc nồng độ từ 0,1 đến 1 g/ml.
- Cỏc dũng tế bào đƣợc nuụi cấy trong trong khay 96 giếng, ủ ở 370C và 5% CO2. - Cỏc chế phẩm và chất chuẩn ellipticine ở cỏc nồng độ khỏc nhau đƣợc tra vào cỏc giếng sau 24 giờ nuụi cấy (mỗi nồng độ 8 giếng).
- Sau 48h, tế bào đƣợc cố định bằng TCA. Sau đú tế bào đƣợc nhuộm bằng SRB và xỏc định OD ở bƣớc súng 515 nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
42
Cỏc chế phẩm đƣợc thăm dũ lần 1 ở cỏc nồng độ: 100, 80, 60, 40, 20 g/ml và thăm dũ lần 2 ở cỏc nồng độ: 60, 50, 40, 30, 20, 10 g/ml. Sau đú dựa vào kết quả thăm dũ, sẽ quyết định nồng độ chất thử phự hợp để đƣa vào cỏc giếng.
- Nghiờn cứu khả năng cảm ứng lờn enzyme Caspase 3 của cỏc caroteoid
trờn dũng tế bào ung thư phổi LU-1 và ung thư vỳ MCF-7 [80]
Ngoài khả năng gõy độc lờn tế bào ung thƣ, chỳng tụi cũn làm thớ nghiệm với enzyme caspase 3 ở hai dũng tế bào ung thƣ phổi LU-1và ung thƣ vỳ MCF-7, đõy là một phƣơng phỏp mới ở Việt Nam [80,102]. Caspase 3 là một trong họ cỏc caspase, chỳng cú liờn quan đến sự chết theo chƣơng trỡnh của cỏc tế bào (apoptosis). Caspase 3 đƣợc coi là một enzyme chỡa khúa dẫn đến một loạt phản ứng dẫn đến sự chết tế bào, nờn cú thể hạn chế đƣợc cỏc tế bào phỏt triển nhanh trong cỏc khối u. Do vậy, ở thớ nghiệm này, khi cho cỏc chế phẩm carotenoid vào mụi trƣờng nuụi cấy cỏc dũng tế bào ung thƣ, nếu chỳng cú thể cảm ứng làm tăng lƣợng enzyme caspase 3 thỡ chứng tỏ chỳng cú khả năng dẫn đến sự chết tế bào, nờn chỳng cú thể đƣợc dựng để ức chế sự phỏt triển của cỏc tế bào ung thƣ.
Tiến hành:
- Tế bào ung thƣ phổi ngƣời LU-1 và ung thƣ vỳ MCF-7 đƣợc nuụi cấy dƣới dạng đơn lớp trong mụi trƣờng nuụi cấy DMEM với thành phần kốm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% huyết thanh phụi bũ (FBS).
- Tế bào đƣợc cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuụi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
- Tế bào thớ nghiệm đƣợc đƣa vào chai nuụi với nồng độ 106 tế bào/chai, ở 370C, 5% CO2. Sau 24 giờ, chất thử đƣợc đƣa vào ở nồng độ 50 g/ml, 25 g/ml và 12,5 g/ml. Curcumin đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng dƣơng và DMSO đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng õm.
- Tiếp theo, tế bào đƣợc thu hoạch sau 72 giờ bằng cỏch dựng trypsin làm rời tế bào. Li tõm thu cặn tế bào ở 600 g trong 5 phỳt ở 40C. Cặn tế bào thu đƣợc rửa lại một lần với PBS và đƣợc ly tõm thu cặn tế bào. Cặn này đƣợc hoà lại với 100 ml
43
đệm phõn hủy 1X và ủ trong đỏ 20 phỳt để phỏ vỡ màng tế bào. Sau đú, dịch phõn hủy này đƣợc ly tõm ở tốc độ 16000ữ20000 g trong 15 phỳt ở 40C. Thu dịch nổi sang ống mới. Dịch tế bào thu đƣợc đƣa sang đĩa 96 giếng để đỏnh giỏ hoạt tớnh caspase 3 theo sơ đồ nhƣ sau:
Dịch tế bào Caspase 3 6mg/ml Đệm nghiờn cứu Ức chế Caspase Cơ chất Caspase 3 Giếng trắng - - 90 àl - 10 àl T.bào khụng cú hoạt chất thử - - 85 àl - 10 àl Tế bào xử lý hoạt chất 5 àl - 85 àl - 10 àl Caspase 3 dƣơng tớnh - 90 àl 85 àl - 10 àl
Tiếp theo, cho 5 àl dịch tế bào hoặc caspase 3 dƣơng tớnh vào cỏc giếng đó định. Cho đệm phõn hủy 1X vào cỏc giếng nhƣ bảng trờn. Sau đú, cho chất ức chế caspase 3 vào cỏc giếng đú. Bắt đầu phản ứng bằng cỏch cho 10àl cơ chất acethyl- Asp-Glu-Val-Adp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA) của enzyme caspase 3 vào cỏc giếng và trộn đều, ủ 370C trong vũng 90 phỳt. Tiến hành đo kết quả hấp thụ ở bƣớc súng 405 nm.
2.2.4. Nghiờn cứu tỏc dụng sinh học của cỏc carotenoid lờn chuột thực nghiệm theo phƣơng phỏp của Favari [50]
- Mụ hỡnh nghiờn cứu:
Động vật thớ nghiệm là chuột nhắt đực dũng Swiss, đƣợc cõn từng con, đỏnh dấu, phõn nhúm ngẫu nhiờn trƣớc khi làm thớ nghiệm. Chỳng đƣợc chia thành 10 nhúm, mỗi nhúm cú 10 con, gồm:
- Nhúm 1: uống NaCl 0,9% x 2ml/kg thể trọng chuột - Nhúm 2: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột
44
- Nhúm 3: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kốm theo -carotene tinh sạch x 2,5g/kgthể trọng chuột
- Nhúm 4: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kốm theo lutein tinh sạch x 2,5g/kg thể trọng chuột
- Nhúm 5: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kốm theo lycopene tinh sạch x 2,5g/kgthể trọng chuột
- Nhúm 6: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kốm theo TPCN Ocpola x 2,5g/kg thể trọng chuột
- Nhúm 7: uống -carotene tinh sạch x 2,5g/kgthể trọng chuột - Nhúm 8: uống lutein tinh sạch x 2,5g/kgthể trọng chuột - Nhúm 9: uống lycopene tinh sạch x 2,5g/kgthể trọng chuột - Nhúm 10: uống TPCN Ocpola x 2,5g/kgthể trọng chuột
Trong quỏ trỡnh thớ nghiệm, cỏc nhúm chuột đều đƣợc nuụi dƣỡng trong điều kiện phũng thớ nghiệm chuột của Bộ mụn Lý sinh-Mụ phụi, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiờn, ĐHQGHN. Chuột đƣợc cho ăn thức ăn tổng hợp đó đúng thành bỏnh và sấy khụ cú hàm lƣợng protein từ 12 - 18% theo tiờu chuẩn thức ăn cho chuột nhắt trắng thớ nghiệm, uống nƣớc đun sụi để nguội. Cỏc nhúm chuột đƣợc nuụi ở cỏc chuồng riờng để trỏnh lõy chộo cú thể xảy ra theo đƣờng hụ hấp và tiếp xỳc. Hàng ngày theo dừi, ghi chộp diễn biến, kết quả thớ nghiệm.
Chuột thớ nghiệm đều đƣợc cho uống cỏc chất thử vào buổi sỏng, giờ cố định. Chuột đƣợc nuụi trong 3 tuần, dựng chế phẩm trong 2 tuần.