Mục tiêu nghiên cứu của luận án nhằm đề xuất một số kiến nghị sử dụng nguồn cây cỏ giàu Carotenoid của Việt Nam để góp phần sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo luận án.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN W X Trần Thị Huyền Nga NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT VÀI CAROTENOID TỪ CÂY CỎ VIỆT NAM DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 30 15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội 2010 Cơng trình hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Mùi TS Phan Quốc Kinh Phản biện 1: PGS.TS Phạm Hoàng Ngọc Phản biện 2: GS.TS Đỗ Ngọc Liên Phản biện 3: GS.TS Nguyễn Xuân Thắng Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp tại: Vào hồi: ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Thi Huyen Nga, Luu Van Quynh, Ha Thi Bich Ngoc, Nguyen Van Mui (2006) Study of β- carotene from some vegetation in Vietnam VNU, J Nat., Sci., & Tech., 22(3): 239 -244 Lưu Vân Quỳnh, Trần Thị Huyền Nga, Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Mùi (2006) Nghiên cứu β-carotene từ gấc Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng mướp đắng Momordica charantia L Báo cáo khoa học, Hội thảo ‘Khoa học Cơng nghệ quản lí nơng học phát triển nông nghiệp bền vững VN’ Đại học Nông nghiệp Hà nội, 10/10/2006; pp 295-301 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn văn Mùi, Trần Thị Huyền Nga, Hà Thị Bích Ngọc (2006) Điều tra, tách chiết đánh giá hoạt tính sinh học lutein cúc vạn thọ Tagetes erecta L Báo cáo khoa học, Hội thảo ‘Khoa học Cơng nghệ quản lí nơng học phát triển nông nghiệp bền vững VN’ Đại học Nông nghiệp Hà nội, 10/10/2006; pp 344-349 Nguyễn Thị Hải Thanh, Nguyễn Văn Mùi, Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga (2006) Điều tra, tách chiết đánh giá hoạt tính sinh học lycopen từ số thực vật Việt Nam, Báo cáo khoa học, Hội thảo “Khoa học Cơng nghệ quản lí nơng học phát triển nông nghiệp bền vững VN”, Đại học Nông nghiệp Hà nội, 10/10/2006; pp317 - 323 Do Xuan Hoan, Tran Thi Quynh Trang, Tran Thi Huyen Nga, Nguyen Van Mùi (2007) Examine some biological effects of carotenoids and flavonoids from leaves of certain yellow Camellia species VNU, J Nat., Sci., & Tech., 23(1): 124 – 130 Nguyễn Thu Huyền, Nguyễn Văn Mùi, Trần Thị Huyền Nga, Trần Thị Quỳnh Trang (2007) Điều tra, phân tích từ số họ bầu bí Cucurbitaceae Báo cáo hội nghị khoa học “Hoá sinh y dược, Hạ Long, Quảng Ninh, năm 2007”, pp196 – 200 7 10 11 12 13 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Mùi, Trần Thị Huyền Nga (2007) Điều tra carotenoit số loài rau Việt Nam Báo cáo hội nghị khoa học “Hoá sinh y dược, Hạ Long, Quảng Ninh, năm 2007”, pp201 - 205 Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) Điều tra hợp chất carotenoit số thực vật Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, KHTN & CN, 23(2) : 59 – 63 Hà Quốc Dương, Trần Thị Huyền Nga, Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn văn Mùi (2008) Nghiên cứu hoạt tính sinh học beta-caroten, lycopen lutein số thực vật Việt Nam, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần IV “Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm” Trung tâm Hội nghị Quốc gia Hà Nội, 15-17/10 năm 2008, pp587-590 Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Thị Huyền Nga (2008) Điều tra thử hoạt tính số carotenoit hoa màu vàng Việt Nam Hội nghị Khoa học tồn quốc lần IV “Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm” Trung tâm Hội nghị Quốc gia Hà Nội, 15-17/10 năm 2008, pp 636-638 Phùng Xuân Lê, Trần Thị Huyền Nga (2008) Nghiên cứu ảnh hưởng lutein lên sinh trưởng vi sinh vật bị chiếu UV tia tử ngoại Hội nghị Khoa học tồn quốc lần IV “Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm” Trung tâm Hội nghị Quốc gia Hà Nội, 15-17/10 năm 2008, pp 67-70 Nguyễn Văn Phòng, Trần Thị Huyền Nga (2008) Điều tra thử hoạt tính hợp chất carotenoit hoa số loài thực vật Việt Nam Hội nghị Khoa học toàn quốc lần IV “Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm” Trung tâm Hội nghị Quốc gia Hà Nội, 15-17/10 năm 2008, pp 636-638 Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi, Lê Huy Hoàng, Phan Quốc Kinh (2010) Nghiên cứu số hoạt tính sinh học thực phẩm chức TPCN Ocpola Tạp chí Dược học, 411(2): 23-28 14 Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2010) Nghiên cứu khả cảm ứng hoạt động enzyme caspase-3 β-carotene, lutein lycopene Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(2): 201-205 15 Trần Ngọc Thái, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Văn Mùi, (2010) Tinh xác định cấu trúc hóa của βcaroten từ Gấc Momordica cochinchinesis (Lour.) Sprengs lutein từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L Tạp chí Y học, 372(2):159-162 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong y học đại, carotenoid sử dụng làm thuốc β – carotene, lutein, lycopene, zeaxanthin…; bên cạnh carotenoid dùng làm mỹ phẩm, bảo vệ da, làm đẹp da lycopene…Ngồi ra, chúng dùng rộng rãi để làm phẩm màu thực phẩm; hay ngành sản xuất thức ăn cho chăn nuôi gà, nuôi trồng thủy sản tôm, cá hồi…Chúng thuốc đặc trị lại nguồn bổ sung dinh dưỡng tốt cho thể, mang lại sức khỏe vẻ đẹp cho người Gần đây, thị phần sản phẩm thực phẩm chức thuốc chứa carotenoid chiếm lượng không nhỏ thị trường dược giới Báo cáo BCC, cơng ty chun phân tích thơng tin thị trường Mỹ, thị phần carotenoid toàn giới năm 2005 cho thấy chúng chiếm khoảng 887 triệu đô la Mỹ riêng năm 2004, dự kiến lên tới tỉ la Mỹ vào năm 2009, β – carotene chiếm thị phần lớn nhất, với khoảng 242 triệu đô la Mỹ, lutein khoảng 139 triệu la Mỹ, asthaxanthin, canthaxanthin… Qua đó, ta thấy nhu cầu carotenoid tăng giới, nước ta vậy, nhu cầu ngày gia tăng Hiện nay, thị trường dược nước ta nhu cầu carotenoid nóng dần lên, nhiên hầu hết sản phẩm phải nhập Ở Việt Nam, gấc biết đến nguồn β – carotene dồi dào, công ty dược phẩm nước dừng lại chỗ thu mua gấc từ bà thu sản phẩm dầu gấc, chứa hỗn hợp carotene Những sản phẩm carotene tinh đưa vào sản phẩm thuốc hay thực phẩm chức nhập từ nước tiên tiến, có nguồn gốc chủ yếu từ vi tảo Dunaliella salina hay bán tổng hợp… Đất nước ta với nhiều loại thực vật phong phú miền nhiệt đới nguồn tài nguyên đa dạng phong phú để tìm kiếm thêm loại carotenoid mới, làm nguyên liệu để sản xuất carotenoid cung cấp cho nhu cầu sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, phẩm màu, phụ gia thức ăn gia cầm, cá tôm… hay để xuất Từ đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế xác định hoạt tính sinh học vài carotenoid từ cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng” Đề tài khơng có ý nghĩa khoa học mà có ý nghĩa thực tiễn cho công bảo vệ nâng cao sức khỏe cộng đồng Mục đích nghiên cứu - Chiết xuất, tinh chế số carotenoid có cỏ Việt Nam xác định chất hóa học số carotenoid phương pháp đại sắc ký mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao, khối phổ cộng hưởng từ Qua sàng lọc, để tìm thực vật có chứa hàm lượng cao β - carotene, lycopene lutein - Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa β - carotene, lycopene, lutein, sản phẩm thực phẩm chức TPCN Ocpola điều kiện in vitro qua số enzyme oxy hóa catalase, peroxidase, cytochrome b5, GOT, GPT, lên tế bào gan chuột Nghiên cứu khả gây độc lên dòng tế bào ung thư biểu mô miệng KB, ung thư tuyến tiền liệt LNCap, khảo sát khả cảm ứng caspase-3 lên dòng tế bào ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7, Nghiên cứu ảnh hưởng hoạt chất carotenoid TPCN Ocpola điều kiện in vivo lên chuột bị gây độc CCl4 Dựa vào kết nghiên cứu hóa học số hoạt tính sinh học số carotenoid có cỏ Việt Nam, luận án đề xuất số kiến nghị sử dụng nguồn cỏ giàu carotenoid Việt Nam để góp phần sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức Nội dung nghiên cứu • Thu thập thực vật Việt Nam, có chứa carotenoid β - carotene, lycopene lutein • Tách chiết, tinh hợp chất carotenoid phương pháp khác • Xác định chất hóa học carotenoid thu từ kết phương pháp đại HPLC, ghi phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân • Nghiên cứu hoạt tính sinh học chúng lên thể sinh vật qua số mơ hình thực nghiệm để kiểm tra khả chống oxy hóa, phòng chống ung thư carotenoid KIẾN NGHỊ Từ đó, tơi xin đưa số kiến nghị sau: (1) Ứng dụng nguồn cỏ giàu carotenoid Việt Nam để góp phần sản xuất thuốc, dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm phục vụ cho công bảo vệ nâng cao sức khỏe cộng đồng (2) Tiếp tục nghiên cứu khả ức chế tế bào ung thư khác theo phương pháp cytotoxic assay, nghiên cứu khả ức chế phát triển khối u mơ hình chuột, thỏ bị gây ung thư tác nhân gây ung thư thực nghiệm carotenoid có nhiều thực vật nước ta Những đóng góp luận án • Đã có đóng góp nghiên cứu hàm lượng β-carotene gấc cùi vàng thịt gấc, trước ý đến màng 23 KẾT LUẬN Từ kết trên, đến số kết luận sau: Kết tách chiết tinh carotenoid: - Đã thu thập phân tích sàng lọc 128 mẫu thực vật nhằm tìm kiếm nguồn carotenoid (β-carotene, lycopene, lutein) - Xác định hàm lượng carotenoid 68 mẫu thực vật, β-carotene có nhiều gấc, màng hạt gấc (22 mg/100g), (cùi thịt 11,4 mg/100g) đặc biệt mẫu gấc bánh tẻ (15 mg/100g) - phát mới, chứa hàm lượng cao β-carotene lycopene Hàm lượng lycopene có nhiều thịt cà chua (45 mg/100g), lutein cao cánh hoa cúc vạn thọ (714 mg/100g) - Đã xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế βcarotene, lycopene, lutein tinh đáp ứng độ tinh khiết, đủ số lượng cho nghiên cứu sinh học Kết thử hoạt tính sinh học chế phẩm carotenoid thực phẩm chức TPCN Ocpola - Các chế phẩm tinh β-carotene, lutein, lycopene TPCN Ocpola có ảnh hưởng lên hoạt độ enzyme catalase, peroxidase máu người, làm giảm hoạt độ enzyme tăng nồng độ hoạt chất từ thấp đến cao - Các chế phẩm β-carotene, lutein, lycopene tinh TPCN Ocpola có khả bảo vệ tế bào gan chuột khỏi tác hại H2O2 - Hoạt tính catalase, peroxidase, GOT GPT máu gan chuột lô uống hoạt chất kèm CCl4 giảm rõ rệt so với lô chuột bị gây độc CCl4 Ở lô chuột uống thêm carotenoid, hàm lượng cytochrome b5 máu gan tăng lên so với lô chuột bị gây độc CCl4 - Các chế phẩm carotenoid tinh thực phẩm chức TPCN Ocpola thể độc tính hai dòng tế bào ung thư biểu mơ miệng KB ung thư tuyến tiền liệt LNCap - Các chế phẩm carotenoid tinh thực phẩm chức TPCN Ocpola có khả cảm ứng với enzyme caspase-3 hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 ung thư vú MCF-7 Kết ứng dụng: Sản phẩm thực phẩm chức TPCN Ocpola Kingpharocula cấp giấy phép để sản xuất đưa thị trường hạt gấc Từ tận dụng nguồn nguyên liệu sản xuất sản phẩm có chứa β-carotene • Phát khả cảm ứng enzyme caspase-3, enzyme chìa khóa dẫn đến q trình chết theo chương trình tế bào ung thư phổi ung thư vú, đưa thêm chứng khả ức chế ung thư carotenoid • Góp phần đưa sản phẩm Thực phẩm chức có tên Ocpola, Kingpharocula với thành phần cao thu từ cánh hoa cúc vạn thọ, gấc, bổ sung dinh dưỡng cho mắt, bảo vệ mắt, tăng cường thị lực, tăng cường hoạt động điểm vàng, làm đẹp da Bố cục luận án Luận án gồm 98 trang, có bảng 38 hình Mở đầu: trang Chương Tổng quan tài liệu: 21 trang Chương Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu: 22 trang Chương Kết thảo luận: 34 trang Kết luận kiến nghị: trang Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (15 công trình) : trang Tài liệu tham khảo: 15 trang, có 22 tài liệu tiếng Việt, 102 tài liệu tiếng Anh, tài liệu trang web PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký mỏng mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký mỏng carotenoid mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký lỏng hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Các bảng số liệu nghiên cứu luận án PHỤ LỤC Khối phổ carotenoid PHỤ LỤC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carotenoid PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm TPCN Ocpola PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm Kingpharocula Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CAROTENOID 1.1.1 Carotenoid 1.1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.1.2 Cấu trúc hóa học phân loại carotenoid 22 1.1.1.3 Tính chất vật lý 1.1.1.4 Tính chất hóa học 1.1.2 Vai trò carotenoid 1.1.2.1 Vai trò carotenoid thực vật 1.1.2.2 Chức carotenoid đời sống động vật sức khỏe người 1.1.3 Một số carotenoid điển hình 1.1.3.1 Beta-carotene 1.1.3.2 Lycopene 1.1.3.3 Lutein 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG, DƯỢC PHẨM PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG 1.2.1 Khái niệm thực phẩm chức 1.2.2 Vai trò thực phẩm chức sống đại Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nguyên liệu đối tượng - Chúng sử dụng 128 mẫu thực vật, thu thập Thành phố Hà Nội, định loại PGS.TS Trần Ninh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) - Máu người, cung cấp Viện Huyết học Truyền máu Trung Ương - Chuột nhắt trắng đực, dòng Swiss, cung cấp Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương - Các dòng tế bào ung thư biểu mô miệng KB, ung thư tuyến tiền liệt LNCap, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi LU-1, GS J M Pezzuto (đại học Hawaii Hoa Kỳ cung cấp) 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm - Hố chất: hố chất có độ tinh khiết cao, hãng Sigma, Merck, Fluka, Prolab, Trung Quốc đảm bảo độ tin cậy cho thí nghiệm - Thiết bị: máy sắc ký lỏng cao áp HPLC 10Av Shimazu, máy đo quang phổ Bionet, khối phổ MS-Engine-5989-HP, máy cộng hưởng từ hạt nhân 500MHz AVANCE VARIAN, máy cô quay, máy đo pH, bơm nhu động, hệ thống cột sắc ký, máy lắc, máy siêu âm, cân phân tích, tủ sấy 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp chiết xuất tinh chế carotenoid - Sấy khô Bảng 3.2 Thành phần viên nang thực phẩm chức Ocpola Thành phần Hàm lượng cao Hàm lượng carotenoid Cao cánh hoa cúc vạn thọ 150 mgr 6mgr lutein Cao thịt mướp đắng chín 75mgr 0,04mgr β-carotene Cao gấc 75mgr 0,1 mgr β-carotene Sản phẩm đưa Phân viện Công nghệ Bảo vệ Môi trường, Trung tâm Khoa học Kỹ thuật - Công nghệ Quân (Viện KHCN Quân sự) kết hợp với nghiên cứu Liên hiệp Khoa học Sản xuất – Công nghệ Khoa Sinh học, Trường Đại học KHTN, ĐHQG HN, chủ trì Thiếu Tướng Phạm Sơn Dương Đề tài luận án thực nghiên cứu tác dụng sinh học sản phẩm TPCN, đưa đề xuất thành phần sản phẩm 3.3.2 Thực phẩm chức Kingpharocula Sản phẩm trình bày dạng viên nang mềm, có thành phần gồm 200mg lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ 5mg piperine từ hạt hồ tiêu Sở dĩ kết hợp với piperine – alkaloid từ hạt hồ tiêu làm tăng hấp thu tối ưu lutein vào thể Đây sản phẩm bổ sung dinh dưỡng, có tác dụng làm sáng mắt, dưỡng mắt, tăng cường thị lực, hỗ trợ phòng tránh thối hóa điểm vàng, qng gà, giúp làm giảm q trình lão hóa làm đẹp da Sản phẩm cấp chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm theo định số 1476/2010/YT-CNTC Bộ Y tế ngày 10/02/2010, kèm theo tiêu chất lượng sản phẩm công bố Đây sản phẩm Công ty cổ phần dược phẩm Kingphar Việt Nam, sản xuất Công ty cổ phẩn Dược – Vật tư y tế Hải Dương cố vấn khoa học nhà khoa học Liên hiệp Khoa học sản xuất – Công nghệ Khoa Sinh học, Trường Đại học KHTN, ĐHQG HN 21 dụng lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ lúc đưa vào sản phẩm bổ sung dinh dưỡng Ngồi ra, chúng tơi phát triển thêm sản phẩm mới, có thành phần chủ yếu lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ, kết hợp với piperine từ hạt hồ tiêu, có tên Kingpharocula Đây TPCN có tác dụng bảo vệ mắt, tăng cường thị lực 3.3.1 Thực phẩm chức Ocpola Hình 3.13 Sản phẩm TPCN Ocpola Từ kết khả quan khả chống oxy hóa lutein β-carotene, lycopene, kết hợp thành phần cao từ cánh hoa cúc, cao mướp đắng chín gấc tạo nên sản phẩm thực phẩm chức với mục đích đưa sản phẩm có tác dụng bổ sung dinh dưỡng cho mắt, bảo vệ mắt, tăng cường thị lực, đặc biệt tăng cường hoạt động điểm vàng Sản phẩm trình bày dạng viên nang bột tên OCPOLA, theo tiêu chuẩn sở số: 07/2006/HOPHARCO, có thành phần bảng Viên nang cứng, có màu xanh đậm, bột viên nang màu vàng xám, đóng lọ nhựa, 60 viên/lọ SĐK: 559/2007/YTCNTC sản xuất Công ty cổ phần Dược – Trang thiết bị Y tế Hòa Bình Sản phẩm đạt tiêu chuẩn với tiêu vi sinh vật, kim loại nặng hóa chất khơng mong muốn nằm giới hạn cho phép 20 - Ngâm chiết: Lượng 10gr bột khô mẫu thực vật trộn với 100ml dung môi ether dầu hỏa (acetone), ngâm bình kín, tối màu, qua đêm (24-48h) Dung dịch ngâm lọc qua phễu có giấy lọc để thu dịch trong, đem cô hệ thống cô quay thu hồi dung môi để thu cao chiết - Sắc ký mỏng: Lượng 0,1gr cao khô mẫu thực vật hòa tan lại với 1ml hệ dung mơi sắc ký mỏng (hệ 1,2,3 bảng 2.2) đem ly tâm 0C để loại bỏ cặn không tan, thu lại cao bốc cách thủy Cao hòa tan lại với 1ml dung mơi sắc ký để chấm lên sắc ký silicagel tráng sẵn - Sắc ký lỏng hiệu cao: Pha động: acetonitrine:methanol:chloroform = 55:23:22 (v/v/v) Tốc độ dòng 0,85 ml/phút, thời gian chạy 20 phút, pH 2-8, nhiệt độ 300C Pha tĩnh: cột silical gep C18, máy HPLC-10Av, Shimazu - Sắc ký cột lọc gel: Cột lọc gel Pharmacia Biotech chiều dài 40 cm, đường kính 1,5 cm Pha tĩnh hạt silicagel (Merck) có kích thước 0,063 x 0,2 mm Pha động hệ dung môi rửa giải ether dầu hoả : acetone pha theo tỷ lệ tương ứng 90:10 Nhiệt độ: 30 0C Cân 20 g silicagel ngâm hệ dung môi rửa giải 24 giờ, sử dụng để nhồi cột Mẫu đưa lên cột chuẩn bị sau: cân gr mẫu cao thực vật, hoà tan với 10 ml ether dầu hoả : acetone (95/5, v/v), để lắng, sau lọc bỏ cặn thu phần dịch phía khoảng ml Tốc độ dòng chạy bơm nhu động 20 ml/giờ, thu phân đoạn ml chất cột đẩy hết Các phân đoạn đo mật độ quang phổ với bước sóng hấp phụ cực đại tương ứng với chất Các phân đoạn có độ hấp phụ quang học giống nhau, giống với chất chuẩn gộp lại thu dịch chứa carotenoid tinh Dung dịch đem bốc cách thủy để thu carotenoid dạng tinh khiết, khơ, có màu đặc trưng - Ghi phổ khối carotenoid: - Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhật 1H 13C carotenoid 2.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa carotenoid tinh xảy khơng phải hoạt chất bị giảm hoạt tính cảm ứng lên caspase-3, mà lúc chúng tác động lên trình chết theo chương trình tế bào ung thư nên tỉ lệ sống sót tế bào giảm mạnh, caspase-3 giảm theo Trên dòng tế bào ung thư vú, nồng độ beta-carotene, lycopene, lutein thực phẩm chức Ocpola 6,25 μg/ml hoạt độ caspase-3 giếng lần lựợt 52,3 (ng/100 μl), 42,9 (ng/100 μl), 72,9 (ng/100 μl), 53,5(ng/100 μl) Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy beta-carotene, lycopene, lutein có khả hỗ trợ chúng khơng hồn tồn chất chữa trị ung thư 3.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ - Xác định ảnh hưởng chế phẩm đến hoạt độ enzyme peroxidase theo phương pháp E.C Xavran - Xác định ảnh hưởng chế phẩm đến hoạt độ enzyme catalase theo phương pháp Bach Zubkova - Xác định số GOT GPT máy phân tích số máu Bệnh viện Medlatec - Định lượng hàm lượng cytochrome b5 theo phương pháp Schenkman - Thí nghiệm chống oxy hố chế phẩm tinh lên tế bào gan chuột 2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học carotenoid lên dòng tế bào ung thư in vitro - Phương pháp thử độ độc tế bào lên dòng tế bào ung thư (Cytotoxic assay) - Nghiên cứu khả cảm ứng lên enzyme Caspase caroteoid dòng tế bào ung thư phổi LU1 ung thư vú MCF7 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học carotenoid lên chuột thực nghiệm theo phương pháp Favari - Mơ hình nghiên cứu: Động vật thí nghiệm chuột nhắt đực dòng Swiss, cân con, đánh dấu, phân nhóm ngẫu nhiên trước làm thí nghiệm Chúng chia thành 10 nhóm, nhóm có 10 con, gồm: - Nhóm 1: uống NaCl 0,9% x 2ml/kg thể trọng chuột - Nhóm 2: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột - Nhóm 3: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo β-carotene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 4: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo lutein tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 5: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo lycopene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 6: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo TPCN Ocpola x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 7: uống β-carotene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 8: uống lutein tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 9: uống lycopene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 10: uống TPCN Ocpola x 2,5g/kg thể trọng chuột - Các tiêu nghiên cứu chuột: Ngoài nguồn carotenoid từ thực phẩm, hoa kết phần 3.1, ngày chất bổ sung dinh dưỡng nhà khoa học, dược sĩ khuyên dùng số trường hợp bị thiếu hụt Từ kết khả quan khả chống oxy hóa lutein β-carotene, lycopene, kết hợp thành phần cao từ cánh hoa cúc số thành phần cao từ thịt mướp đắng, gấc hay piperine tạo nên số sản phẩm thực phẩm chức với mục đích đưa sản phẩm có tác dụng bổ sung dinh dưỡng cho mắt, bảo vệ mắt đặc biệt khỏi tác hại tia UV ánh sáng mặt trời, tăng cường thị lực, đặc biệt tăng cường hoạt động điểm vàng Đây hướng thu hút nhiều quan tâm nhà nghiên cứu toàn giới, đặc biệt Việt Nam, đất nước phát triển với nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú, dồi 19 Lutein công nhận hoạt chất có khả bảo vệ mắt, tăng cường thị lực [Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)], tập trung vào lutein từ nguồn cánh hoa cúc vạn thọ Ban đầu, kết hợp thành phần cao cánh hoa cúc vạn thọ cao thịt mướp đắng, cao gấc thành sản phẩm TPCN Ocpola Bên cạnh nghiên cứu tác dụng sinh học hoạt chất carotenoid, tiến hành nghiên cứu số hoạt tính sinh học lên chuột lên tế bào ung thư TPCN Ocpola, trình bày phần kết 3.2.2, 3.2.3 Hơn chúng tơi tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa tổng số độc tính sản phẩm lên chuột theo quy trình tiêu chuẩn Bộ Y tế ban hành Đây chứng cụ thể để khẳng định lại tác Như vậy, qua việc tiến hành thí nghiệm in vitro với mục đích nhằm khẳng định khả phòng ngừa ung thư carotenoid (βcarotene, lycopene lutein), với kết thu chúng tơi nói chế phẩm thu từ ba đối tượng thực vật nghiên cứu thể tính độc hay nói cách khác thể khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư 3.2.3.2 Kết cảm ứng enzyme Caspase của β-carotene, lycopene lutein Ocpola lên LU-1 MCF-7 Từ kết trên, ta thấy dòng tế bào ung thư phổi nồng độ chế phẩm tinh β-carotene, lycopene, lutein TPCN Ocpola nồng độ 6,25 μg/ml, hoạt độ caspase-3 29,93 (ng/100 μl) với beta-carotene; 16,5 (ng/100 μl) với lycopene; 14,05 (ng/100 μl) với lutein, 33,25 (ng/100 μl) với TPCN Ocpola, (PO>AB>A Đối với lutein, nồng độ thấp (2 mg%) gây giảm hoạt độ catalase nhanh chóng, đến 10 mg% làm giảm hoạt độ catalase tới gần mức tối thiểu, 27,3% với nhóm máu A, 33,3% với nhóm máu B, 30% với nhóm máu AB, 41,7% với nhóm máu O 3.2.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm tinh carotenoid lên peroxidase Chế phẩm tinh β-carotene có gây ảnh hưởng tới hoạt độ peroxidase máu người mạnh hẳn so với cao gấc Nồng độ βcarotene 25 mg% gây giảm hoạt độ peroxidase 70,7% (nhóm máu A), 67,5% (nhóm máu B), 82,1% (nhóm máu AB), 73,7% (nhóm máu O) Ảnh hưởng chế phẩm tinh lycopene lên hoạt độ peroxidase thể qua giảm hoạt độ enzyme từ 100% xuống 55,1% (nhóm máu A), 51% (nhóm máu B), 59,6% (nhóm máu AB), 45,8% (nhóm máu O) nồng độ lycopene tăng đến 40 mg% Sự giảm hoạt độ diễn mạnh nồng độ lycopene mức từ mg% đến 10 mg%, sau diễn tiến chậm Hiệu lực cạnh tranh lycopene lên peroxidase nhóm máu O lớn nhất, nhóm máu B, A, AB Đối với chế phẩm tinh lutein thu từ cao cánh hoa cúc vạn thọ nhận thấy chúng gây giảm mạnh hoạt độ peroxidase nồng độ thấp Ở mg%, hoạt độ peroxidase nhóm máu A giảm 64,5%, nhóm máu B giảm 52,7%, nhóm máu AB giảm 54,8%, nhóm máu O giảm 55,3% Đến nồng độ 25 mg%, hoạt độ giảm 29,1% (nhóm máu A), 21,4% (nhóm máu B), 25,4% (nhóm máu AB), 20,7% (nhóm máu O) 3.2.1.3 Khả chống oxy hóa chế phẩm lên tế bào gan chuột in vitro Bảng 3.1 Khả chống oxy hóa lên tế bào gan chuột in vitro DMSO 0,5360 H202 0,8567 10 Hình 3.7 Các số GOT GPT máu chuột Hình 3.8 Các số GOT GPT gan chuột (Lô 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm βcarotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm βcarotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Khi tế bào gan bị phá huỷ gây tăng cao, nhanh hoạt độ GOT, GPT máu Ở lô chuột bị gây độc, số GOT GPT tăng cao nhất, lô gây độc đồng thời sử dụng chế phẩm carotenoid, hoạt độ GOT GPT giảm cao so với lô đối chứng Các lô gây độc đồng thời sử dụng hỗn hợp ba chế phẩm carotenoid hoạt độ GOT GPT lại giảm mạnh Điều chứng tỏ việc sử dụng carotenoid giúp cho hoạt độ GOT GPT dần phục hồi lại chậm khơng hồn tồn ổn định Ngun nhân thời gian sử dụng chế phẩm 10 ngày ngắn nồng độ chế phẩm carotenoid bổ sung chưa đủ liều chất enzyme GOT, GPT 3.2.2.6 Quan sát tiêu đúc cắt tế bào gan chuột Ở lô chuột uống CCl4, tế bào gan bị tổn thương mạnh Giữa tế bào có khoảng trống rộng mẫu gan chuột đối chứng, điều chứng tỏ, gan chúng có gắn kết yếu Bên cạnh đó, ta thấy xuất nhiều đại thực bào có mặt quanh mạch máu, gần tế bào bị chết, nhân chúng bị teo đi, có kích thước bé hẳn so với nhân tế bào gan bên cạnh Bên cạnh đó, lơ chuột từ đến lô chuột uống CCl4 kèm với chế phẩm carotenoid thực phẩm chức chúng tơi tổn thương gan nhẹ hẳn Tương tự, mẫu 15 Kết từ hình 3.5 cho ta khẳng định thay đổi gan bị gây độc CCl4 kết hợp với chế phẩm carotenoid chúng tơi, thay đổi lô chuột tương tự với hoạt độ enzyme máu 3.2.2.4 Enzyme cytochrome b5 máu gan chuột Hình 3.6 Hàm lượng cytochrome b5 máu gan chuột (Lô 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm β-carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm β-carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Nồng độ μg/ml β-carotene ED50 100 50 25 12,5 6,25 3,1 lutein 0,8696 0,7623 0,7757 0,7321 0,7252 0,7151 0,7188 0,6847 0,6734 0,6648 0,6204 0,6283 % tế bào sống sót Nồng độ μg/ml β -caroten lutein 100 101,51 88,98 50 90,55 85,45 25 84,65 83,47 12,5 83,91 79,93 6,25 78,61 77,60 3,1 72,41 73,34 lycopene Ocpola Curcumin 0,8290 0,8135 0,7869 0,7190 0,6551 0,6251 0,8219 0,7569 0,6980 0,6831 0,6487 0,6027 0,8308 0,8050 0,7719 0,7356 0,7239 0,6817 lycopene 96,77 94,96 91,85 83,92 76,46 72,96 Ocpola 95,94 88,35 81,48 79,73 75,72 70,36 Curcumin 96,98 93,97 90,10 85,86 84,49 79,57 37,5 uM 18,75 9,375 4,69 2,35 1,17 DMSO 62,57 Chúng ta thấy hàm lượng cytochrome b5 có thay đổi đáng kể lô chuột nghiên cứu Ở lô chuột đối chứng uống dung dịch muối sinh lý, hàm lượng cytochrome b5 0,085 μg/ml máu 0,089 μg/g gan, lô chuột uống CCl4, hàm lượng 0,04 μg/ml máu 0,037 μg/g gan Các lơ chuột có uống CCl4, hàm lượng cytochrome b5 ổn định hơn, trở giá trị 0,09 μg/ml máu 0,1 μg/g gan Điều chứng tỏ, chế phẩm tinh carotenoid thực phẩm chức Ocpola chúng tơi có khả cân lượng cytochrome b5 chuột uống CCl4 3.2.2.5 Các số GOT GPT máu gan chuột Từ kết bảng 3.1, thấy tăng nồng độ chế phẩm β-carotene, lutein, lycopene TPCN Ocpola từ 3,1μg/ml lên tới 100μg/ml khả bảo vệ tế bào khỏi tác hại H2O2 tăng, thể chỗ % tế bào gan nuôi in vitro tăng từ khoảng 70% lên tới 100% Khi cho H2O2 vào đĩa có tế bào gan chuột chúng sống sót 62,57% curcumin chất có khả chống oxy hóa người biết đến có khả bảo vệ cao (96,98% tế bào sống sót) nồng độ 100 μg/ml Trong đó, chế phẩm tinh β-carotene nồng độ 100 μg/ml 100% tế bào sống sót Chứng tỏ, β-carotene có khả bảo vệ tế bào khỏi tác hại H2O2 Tương tự, chế phẩm lutein, lycopene thực phẩm chức Ocpola có khả bảo vệ tế bào gan chuột khỏi tác hại H2O2 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hố β-carotene, lycopene lutein điều kiện in vivo chuột 3.2.2.1 Sự thay đổi trọng lượng trung bình chuột trước sau thí nghiệm 14 11 Hình 3.1 Sự thay đổi trọng lượng trung bình chuột trước sau thí nghiệm (Lơ 1: uống NaCl 0,9%, lơ 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm β-carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + Ocpola,, lô 7: uống chế phẩm β-carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Từ kết từ hình 3.1, ta thấy lô chuột uống CCl4, trọng lượng chuột giảm rõ rệt, sức sống Khi cho uống kèm với chế phẩm carotenoid chúng tôi, chúng có phục hồi nhẹ Còn lơ chuột bình thường chuột uống bổ sung carotenoid có phát triển bình thường 3.2.2.2 Hoạt tính catalase máu chuột Ta thấy ống đối chứng, khơng có mẫu máu, lượng KMnO4 sử dụng để trung hòa H2O2, đó, hoạt độ catalase coi 100% Ở lô 1, chuột uống muối sinh lí, hoạt độ có tăng nhẹ so với lô Lô chuột uống CCl4, Ở hoạt độ catalase tăng lên 600 lần, điều chứng tỏ chúng bị tổn thương nhiều Còn lô chuột từ đến 6, chuột ngồi uống CCl4, bổ sung thêm chế phẩm tinh beta-carotene, lycopene, lutein Ocpola; đây, hoạt độ catalase có tăng, rõ ràng nhỏ hoạt độ lô uống CCl4 đáng kể Còn lơ chuột lại từ đến 10 lô chuột uống chế phẩm tinh betacarotene, lycopene, lutein Ocpola; hoạt độ enzyme catalase xoay quanh giá trị 100% Từ đây, ta thấy gan bị tổn thương CCl4, chế phẩm carotenoid chúng tơi có tác dụng bảo vệ, hoạt độ catalase giảm đáng kể Điều khẳng định việc gan chuột bị tổn thương CCl4, chế phẩm carotenoid chúng tơi có tác dụng làm giảm tác hại tổn thương 3.2.2.3 Hoạt tính peroxidase máu gan chuột Hình 3.4 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase Hình 3.5 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase máu chuột lơ thí nghiệm gan chuột lơ thí nghiệm (Lơ 1: uống NaCl 0,9%, lơ 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm β-carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm β-carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lơ 10: uống Ocpola) Hình 3.2 Sự thay đổi hoạt độ Hình 3.3 Sự thay đổi hoạt độ catalase máu chuột lơ thí catalase gan chuột lơ thí nghiệm nghiệm (Lơ 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm β-carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm β-carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Ở lô 2, chuột uống CCl4, hoạt độ peroxidase tăng lên mạnh, 600% Còn lơ chuột từ đến 6, chúng giảm xuống xấp xỉ 100% Các lô chuột không uống chất độc, mà uống chế phẩm carotenoid chúng tôi, hoạt độ peroxidase xoay quanh 100% 12 13 ... cầm, cá tơm… hay để xuất Từ đó, chúng tơi tiến hành đề tài Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế xác định hoạt tính sinh học vài carotenoid từ cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng Đề tài... nguồn cỏ giàu carotenoid Việt Nam để góp phần sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức Nội dung nghiên cứu • Thu thập thực vật Việt Nam, có chứa carotenoid β - carotene, lycopene lutein • Tách chiết, tinh. .. Đại học KHTN, ĐHQG HN, chủ trì Thiếu Tướng Phạm Sơn Dương Đề tài luận án thực nghiên cứu tác dụng sinh học sản phẩm TPCN, đưa đề xuất thành phần sản phẩm 3.3.2 Thực phẩm chức Kingpharocula Sản phẩm