Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ cây cỏ việt nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng luận văn TS sinh học 62 42 30 15

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Trần Thị Huyền Nga NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT VÀI CAROTENOID TỪ CÂY CỎ VIỆT NAM DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Trần Thị Huyền Nga NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT VÀI CAROTENOID TỪ CÂY CỎ VIỆT NAM DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Văn Mùi TS Phan Quốc Kinh Hà Nội 2010 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CAROTENOID 1.1.1 Carotenoid 1.1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.1.2 Cấu trúc hóa học phân loại carotenoid 1.1.1.3 Tính chất vật lý 1.1.1.4 Tính chất hóa học 1.1.2 Vai trò carotenoid 1.1.2.1 Vai trò carotenoid thực vật 1.1.2.2 Chức carotenoit đời sống động vật sức khỏe người 1.1.3 Một số carotenoid điển hình 12 1.1.3.1 Beta-carotene 12 1.1.3.2 Lycopene 14 1.1.3.3 Lutein 16 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG, DƯỢC PHẨM PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG 18 1.2.1 Khái niệm thực phẩm chức 19 1.2.2 Vai trò thực phẩm chức sống đại 20 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN LIỆU 24 2.1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Phương pháp chiết xuất tinh chế carotenoid 31 2.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa carotenoid tinh chế 36 2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học carotenoid lên dòng tế bào ung thư in vitro 40 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học carotenoid lên chuột thực nghiệm theo phương pháp Favari [50] 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 KẾT QUẢ THU VÀ CHỌN MẪU NGHIÊN CỨU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1.1 Kết thu mẫu khảo sát mẫu nghiên cứuError! Bookmark not defined 3.1.2 Kết nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu cao Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kết qủa tinh carotenoid 50 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAROTENOIT 53 3.2.1 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa điều kiện in vitro 53 3.2.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm tinh carotenoid lên catalase 53 3.2.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm tinh carotenoid lên peroxidase 55 3.2.1.3 Kết khả chống oxy hóa lên tế bào gan chuột in vitro 57 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hố  -carotene, lycopene lutein điều kiện in vivo chuột 58 3.2.2.1 Sự thay đổi trọng lượng trung bình chuột trước sau thí nghiệm 59 3.2.2.2 Hoạt tính catalase máu chuột 60 3.2.2.3 Hoạt tính peroxidase máu gan chuột 61 3.2.2.4 Enzyme cytochrome b5 máuvà gan chuột 64 3.2.2.5 Các số GOT GPT máu gan chuột 64 3.2.2.6 Kết làm tiêu đúc cắt tế bào gan chuột 67 3.2.3 Kết thử nghiệm hoạt tính β-carotene, lycopene lutein lên dòng tế bào ung thư 69 3.2.3.1 Kết thử độ độc lên tế bào Error! Bookmark not defined 3.2.3.2 Kết cảm ứng enzyme Caspase của β-carotene, lycopene lutein lên LU1 MCF7 73 3.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ 75 3.3.1.Thực phẩm chức TPCN Ocpola 77 3.3.2 Thực phẩm chức Kingpharocula 89 KẾT LUẬN 90 KIẾN NGHỊ 91 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký mỏng mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký mỏng carotenoid mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký lỏng hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Các bảng số liệu nghiên cứu luận án PHỤ LỤC Khối phổ carotenoid PHỤ LỤC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carotenoid PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm TPCNOcpola PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm Kingpharocula MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong y học đại, carotenoid đƣợc sử dụng làm thuốc nhƣ  – carotene, lutein, lycopene, zeaxanthin…; bên cạnh carotenoid đƣợc dùng làm mỹ phẩm, bảo vệ da, làm đẹp da nhƣ lycopene…Ngồi ra, chúng đƣợc dùng rộng rãi để làm phẩm màu thực phẩm; hay ngành sản xuất thức ăn cho chăn nuôi gà, nuôi trồng thủy sản nhƣ tôm, cá hồi…Chúng thuốc đặc trị nhƣng lại nguồn bổ sung dinh dƣỡng tốt cho thể, mang lại sức khỏe vẻ đẹp cho ngƣời Gần đây, thị phần sản phẩm thực phẩm chức thuốc chứa carotenoid chiếm lƣợng không nhỏ thị trƣờng dƣợc giới Báo cáo BCC, công ty chuyên phân tích thơng tin thị trƣờng Mỹ, thị phần carotenoid toàn giới năm 2005 cho thấy chúng chiếm khoảng 887 triệu đô la Mỹ riêng năm 2004, dự kiến lên tới tỉ đô la Mỹ vào năm 2009,  – carotene chiếm thị phần lớn nhất, với khoảng 242 triệu đô la Mỹ, lutein khoảng 139 triệu đô la Mỹ, asthaxanthin, canthaxanthin… Qua đó, ta thấy nhu cầu carotenoid tăng giới, nƣớc ta vậy, nhu cầu ngày gia tăng Hiện nay, thị trƣờng dƣợc nƣớc ta nhu cầu carotenoid nóng dần lên, nhiên hầu hết sản phẩm phải nhập Ở Việt Nam, gấc đƣợc biết đến nhƣ nguồn  – carotene dồi dào, nhƣng công ty dƣợc phẩm nƣớc dừng lại chỗ thu mua gấc từ bà thu sản phẩm dầu gấc, chứa hỗn hợp carotene Những sản phẩm carotene tinh đƣa vào sản phẩm thuốc hay thực phẩm chức nhập từ nƣớc tiên tiến, có nguồn gốc chủ yếu từ vi tảo Dunaliella salina hay bán tổng hợp… Đất nƣớc ta với nhiều loại thực vật phong phú miền nhiệt đới nguồn tài nguyên đa dạng phong phú để tìm kiếm thêm loại carotenoid mới, làm nguyên liệu để sản xuất carotenoid cung cấp cho nhu cầu sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, phẩm màu, phụ gia thức ăn gia cầm, cá tôm… hay để xuất Từ đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế xác định hoạt tính sinh học vài carotenoid từ cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng” Đề tài khơng có ý nghĩa khoa học mà có ý nghĩa thực tiễn cho công bảo vệ nâng cao sức khỏe cộng đồng Mục đích nghiên cứu - Chiết xuất, tinh chế số carotenoid có cỏ Việt Nam xác định chất hóa học số carotenoid phƣơng pháp đại nhƣ sắc ký mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao, khối phổ cộng hƣởng từ Qua sàng lọc, để tìm thực vật có chứa hàm lƣợng cao  - carotene, lycopene lutein - Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa  - carotene, lycopene, lutein, sản phẩm thực phẩm chức TPCN Ocpola điều kiện in vitro qua số enzyme oxy hóa nhƣ catalase, peroxidase, cytochrome b5, GOT, GPT, lên tế bào gan chuột Nghiên cứu khả gây độc lên dòng tế bào ung thƣ biểu mô miệng KB, ung thƣ tuyến tiền liệt LNCap, khảo sát khả cảm ứng caspase-3 lên dòng tế bào ung thƣ phổi LU-1, ung thƣ vú MCF-7, Nghiên cứu ảnh hƣởng hoạt chất carotenoid TPCN Ocpola điều kiện in vivo lên chuột bị gây độc CCl4 Dựa vào kết nghiên cứu hóa học số hoạt tính sinh học số carotenoid có cỏ Việt Nam, luận án đề xuất số kiến nghị sử dụng nguồn cỏ giàu carotenoid Việt Nam để góp phần sản xuất dƣợc phẩm, thực phẩm chức Nội dung nghiên cứu  Thu thập thực vật Việt Nam, có chứa carotenoid nhƣ  - carotene, lycopene lutein  Tách chiết, tinh hợp chất carotenoid phƣơng pháp khác  Xác định chất hóa học carotenoid thu đƣợc từ kết phƣơng pháp đại nhƣ HPLC, ghi phổ khối, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân  Nghiên cứu hoạt tính sinh học chúng lên thể sinh vật qua số mơ hình thực nghiệm để kiểm tra khả chống oxy hóa, phòng chống ung thƣ carotenoid Những đóng góp luận án  Đã có đóng góp nghiên cứu hàm lƣợng -carotene gấc cùi vàng thịt gấc, trƣớc ý đến màng hạt gấc Từ tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu sản xuất sản phẩm có chứa -carotene  Phát khả cảm ứng enzyme caspase-3, enzyme chìa khóa dẫn đến q trình chết theo chƣơng trình tế bào ung thƣ phổi ung thƣ vú, đƣa thêm chứng khả ức chế ung thƣ carotenoid  Góp phần đƣa sản phẩm Thực phẩm chức có tên Ocpola, Kingpharocula với thành phần cao thu đƣợc từ cánh hoa cúc vạn thọ, gấc, bổ sung dinh dƣỡng cho mắt, bảo vệ mắt, tăng cƣờng thị lực, tăng cƣờng hoạt động điểm vàng, làm đẹp da Bố cục luận án Luận án gồm 98 trang, có bảng 38 hình Mở đầu: trang Chƣơng Tổng quan tài liệu: 21 trang Chƣơng Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu: 22 trang Chƣơng Kết thảo luận: 34 trang Kết luận kiến nghị: trang Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (15 cơng trình) : trang Tài liệu tham khảo: 15 trang, có 22 tài liệu tiếng Việt, 102 tài liệu tiếng Anh, tài liệu trang web PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký mỏng mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký mỏng carotenoid mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Hình ảnh sắc ký hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Kết sắc ký lỏng hiệu cao mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC Các bảng số liệu nghiên cứu luận án PHỤ LỤC Khối phổ carotenoid PHỤ LỤC Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carotenoid PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm TPCN Ocpola PHỤ LỤC Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm Kingpharocula Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CAROTENOID 1.1.1 Carotenoid 1.1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.1.2 Cấu trúc hóa học phân loại carotenoid 1.1.1.3 Tính chất vật lý 1.1.1.4 Tính chất hóa học 1.1.2 Vai trò carotenoid 1.1.2.1 Vai trò carotenoid thực vật 1.1.2.2 Chức carotenoid đời sống động vật sức khỏe người 1.1.3 Một số carotenoid điển hình 1.1.3.1 Beta-carotene 1.1.3.2 Lycopene 1.1.3.3 Lutein 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG, DƢỢC PHẨM PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG 1.2.1 Khái niệm thực phẩm chức 1.2.2 Vai trò thực phẩm chức sống đại Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nguyên liệu đối tƣợng - Chúng sử dụng 128 mẫu thực vật, thu thập Thành phố Hà Nội, đƣợc định loại PGS.TS Trần Ninh (Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH KHTN) - Máu ngƣời, đƣợc cung cấp Viện Huyết học Truyền máu Trung Ƣơng - Chuột nhắt trắng đực, dòng Swiss, đƣợc cung cấp Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng - Các dòng tế bào ung thƣ biểu mơ miệng KB, ung thƣ tuyến tiền liệt LNCap, ung thƣ vú MCF-7, ung thƣ phổi LU-1, GS J M Pezzuto (đại học Hawaii Hoa Kỳ cung cấp) 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm - Hố chất: hố chất có độ tinh khiết cao, hãng Sigma, Merck, Fluka, Prolab, Trung Quốc đảm bảo độ tin cậy cho thí nghiệm - Thiết bị: máy sắc ký lỏng cao áp HPLC 10Av Shimazu, máy đo quang phổ Bionet, khối phổ MSEngine-5989-HP, máy cộng hƣởng từ hạt nhân 500MHz AVANCE VARIAN, máy cô quay, máy đo pH, bơm nhu động, hệ thống cột sắc ký, máy lắc, máy siêu âm, cân phân tích, tủ sấy 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phƣơng pháp chiết xuất tinh chế carotenoid - Sấy khô - Ngâm chiết: Lƣợng 10gr bột khô mẫu thực vật đƣợc trộn với 100ml dung mơi ether dầu hỏa (acetone), ngâm bình kín, tối màu, qua đêm (24-48h) Dung dịch ngâm đƣợc lọc qua phễu có giấy lọc để thu dịch trong, đem cô hệ thống cô quay thu hồi dung môi để thu cao chiết - Sắc ký mỏng: Lƣợng 0,1gr cao khơ mẫu thực vật đƣợc hòa tan lại với 1ml hệ dung môi sắc ký mỏng (hệ 1,2,3 nhƣ bảng 2.2) đem ly tâm 0C để loại bỏ cặn không tan, thu lại cao bốc cách thủy Cao đƣợc hòa tan lại với 1ml dung mơi sắc ký để chấm lên sắc ký silicagel tráng sẵn - Sắc ký lỏng hiệu cao: Pha động: acetonitrine:methanol:chloroform = 55:23:22 (v/v/v) Tốc độ dòng 0,85 ml/phút, thời gian chạy 20 phút, pH 2-8, nhiệt độ 300C Pha tĩnh: cột silical gep C18, máy HPLC-10Av, Shimazu - Sắc ký cột lọc gel: Cột lọc gel Pharmacia Biotech chiều dài 40 cm, đƣờng kính 1,5 cm Pha tĩnh hạt silicagel (Merck) có kích thƣớc 0,063 x 0,2 mm Pha động hệ dung môi rửa giải ether dầu hoả : acetone đƣợc pha theo tỷ lệ tƣơng ứng 90:10 Nhiệt độ: 30 0C Cân 20 g silicagel ngâm hệ dung môi rửa giải 24 giờ, sử dụng để nhồi cột Mẫu đƣa lên cột đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cân gr mẫu cao thực vật, hoà tan với 10 ml ether dầu hoả : acetone (95/5, v/v), để lắng, sau lọc bỏ cặn thu phần dịch phía khoảng ml Tốc độ dòng chạy bơm nhu động 20 ml/giờ, thu phân đoạn ml chất cột đƣợc đẩy hết Các phân đoạn đƣợc đo mật độ quang phổ với bƣớc sóng hấp phụ cực đại tƣơng ứng với chất Các phân đoạn có độ hấp phụ quang học giống nhau, giống với chất chuẩn đƣợc gộp lại thu đƣợc dịch chứa carotenoid tinh Dung dịch đƣợc đem bốc cách thủy để thu carotenoid dạng tinh khiết, khơ, có màu đặc trƣng - Ghi phổ khối carotenoid: - Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhật 1H 13C carotenoid 2.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa carotenoid tinh - Xác định ảnh hưởng chế phẩm đến hoạt độ enzyme peroxidase theo phương pháp E.C Xavran - Xác định ảnh hưởng chế phẩm đến hoạt độ enzyme catalase theo phương pháp Bach Zubkova - Xác định số GOT GPT máy phân tích số máu Bệnh viện Medlatec - Định lượng hàm lượng cytochrome b5 theo phương pháp Schenkman - Thí nghiệm chống oxy hố chế phẩm tinh lên tế bào gan chuột 2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học carotenoid lên dòng tế bào ung thƣ in vitro - Phương pháp thử độ độc tế bào lên dòng tế bào ung thư (Cytotoxic assay) - Nghiên cứu khả cảm ứng lên enzyme Caspase caroteoid dòng tế bào ung thư phổi LU1 ung thư vú MCF7 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học carotenoid lên chuột thực nghiệm theo phƣơng pháp Favari - Mơ hình nghiên cứu: Động vật thí nghiệm chuột nhắt đực dòng Swiss, đƣợc cân con, đánh dấu, phân nhóm ngẫu nhiên trƣớc làm thí nghiệm Chúng đƣợc chia thành 10 nhóm, nhóm có 10 con, gồm: - Nhóm 1: uống NaCl 0,9% x 2ml/kg thể trọng chuột - Nhóm 2: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột - Nhóm 3: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo -carotene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 4: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo lutein tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 5: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo lycopene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 6: uống CCl4 x 2ml/kg thể trọng chuột kèm theo TPCN Ocpola x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 7: uống -carotene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 8: uống lutein tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 9: uống lycopene tinh x 2,5g/kg thể trọng chuột - Nhóm 10: uống TPCN Ocpola x 2,5g/kg thể trọng chuột - Các tiêu nghiên cứu chuột: Cho động vật nhịn ăn 24 trƣớc lấy máu Mẫu máu gan chuột đƣợc xác định số GOT (AST-aspartate transaminase) GPT (ALT–alanin transaminase) Những enzyme đƣợc coi tiêu sinh học đáng tin cậy tổn thƣơng tế bào gan Các số đƣợc xác định Phòng Sinh hóa, Bệnh viện Medlatec Chúng định lƣợng cytochrome b5 máu gan chuột Ngồi chúng tơi xác định số peroxidase catalase máu gan chuột Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ TINH SẠCH CÁC CAROTENOID 3.1.1 Chiết xuất carotenoid Từ 200 mẫu thu thập đƣợc, tiến hành sử dụng nhiều hệ dung môi khác phù hợp cho mẫu khác nhƣ n-hexane, ether dầu, acetone, chloroform, ethylacetate, cồn… để tách chiết carotenoid, từ chúng tơi tách chiết thành công đƣợc 128 mẫu để thu cao thô tổng số tiến hành sắc ký mỏng Kết khảo sát với 128 mẫu thực vật sắc ký mỏng bƣớc đầu cho thấy có mặt chất carotenoid mẫu nghiên cứu tiến hành chất chuẩn -carotene, lutein lycopene Chúng thu đƣợc 119 mẫu chứa -carotene, 113 mẫu chứa lutein 50 mẫu chứa lycopene Các mẫu cánh hoa, loài cây, rau chủ yếu chứa -carotene lutein Phổ mẫu có chứa lycopene hơn, tập trung chủ yếu củ Từ kết sắc ký lỏng hiệu cao, xác định đƣợc hàm lƣợng -carotene, lutein lycopene 68 mẫu thực vật Các mẫu chứa -carotene phổ biến nhất, ta ý đến số mẫu có hàm lƣợng cao nhƣ màng hạt gấc chín (22 mg/100g), cùi thịt vàng gấc (11,4 mg/100g), gấc bánh tẻ (15 mg/100g), màng hạt mƣớp đắng chín (9,2 mg/100g), cùi thịt vàng mƣớp đắng chín (4,8 mg/100g), rau dệu (6,9 mg/100g), hồng chín (1,903 mg/100g), tiếp đến mẫu nhƣ rau ngót, thịt đu đủ chín, củ khoai lang vàng… Khơng màng hạt gấc chín mà phần cùi thịt vàng gấc chứa hàm lƣợng cao carotene Đặc biệt, phát nguồn -carotene hồn tồn mới, gấc bánh tẻ, với hàm lƣợng cao (15 mg/100g) Phát cho ta hƣớng tới nguồn nguyên liệu chứa -carotene mới, an tồn có giá thành rẻ, bên cạnh màng hạt gấc chín cùi thịt vàng gấc chín Chúng tơi nhận nhận thấy lycopene tập trung chủ yếu loại củ có màu đỏ, nhƣ cà chua (45 mg/100g), hồng trứng (6,7 mg/100g), đu đủ chín (2 mg/100g), gấc (8,9 mg/100g) Từ trƣớc tới nay, cà chua nguồn lycopene phục vụ cho đời sống ngƣời, chứa hàm lƣợng cao (45 mg/100g), có hoạt tính sinh học cao Đối với lutein, ta thấy mẫu chứa lutein phổ biến thiên nhiên nhiên hàm lƣợng lại không cao nhƣ -carotene Hàm lƣợng lutein cao mẫu cánh hoa cúc vạn thọ (714 mg/100g), tiếp đến mẫu tía tơ (1,45 mg/100g), rau dền tía (1,36 mg/100g), thịt bí đỏ (1,37 mg/100g)… Các mẫu rau có màu xanh đậm chứa lutein nhiên hàm lƣợng không cao, không nhiều hẳn nhƣ mẫu 3.1.2 Kết tinh carotenoid Với kết HPLC, thời gian lƣu phân đoạn -carotene, lutein lycopene tách khỏi cột phù hợp với chất chuẩn LCMS NMR cho kết màu sắc, khối lƣợng phân tử, nhiệt độ nóng chảy hay cơng thức phù hợp với carotenoid nghiên cứu Điều chứng tỏ quy trình tách chiết tinh chúng tơi có hiệu tốt, thu đƣợc chế phẩm có độ tinh cao, đảm bảo độ tin cậy cho nghiên cứu Chế phẩm -carotene tinh từ gấc có cơng thức phân tử C 40H56, (cấu tạo all trans-  -carotene) Qua phổ MS NMR ta thấy có píc m/z 538,0 [M + H+] khối lƣợng phân tử -carotene (537) cộng với H+ Từ phổ 1H-NMR ta thấy xuất tín hiệu singlet đặc trƣng ứng với 10 gốc methyl cộng hƣởng δ 2,2; 1,98; 1,75; 1,05 tín hiệu doublet vị trí 6,635; 6,625 số tín hiệu multilet tƣơng ứng với carbon bậc cao Từ phổ 13C-NMR thấy xuất tín hiệu 20 carbon, với 11 píc tƣơng ứng carbon bậc cao vùng trƣờng thấp pic ứng với carbon bậc thấp vùng trƣờng cao Qua kết luận đƣợc phân tử có cấu tạo đối xứng, số lƣợng phân tử carbon phổ bị giảm ½, phân tử có 40 phân tử C Qua phổ DEPT 90&135, xuất píc, ứng với 14 nhóm =CH-, píc ứng với 10 gốc CH3 píc ứng với gốc CH2 Từ đó, ta kết luận chế phẩm -carotene tinh từ gấc có công thức phân tử C40H56, (cấu tạo all trans-  -carotene) Đây lần giới, công bố phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90&135 -carotene từ gấc, bên cạnh -carotene từ màng hạt gấc đƣợc nghiên cứu từ lâu Tƣơng tự, lycopene tinh từ thịt cà chua có công thức cấu tạo C40H56, (all-trans-lycopene) Và lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ có cơng thức C 40H56O2, (trans-lutein) Hiệu suất tinh carotenoid từ mẫu nghiên cứu Từ 6,6 kg gấc bánh tẻ tƣơi, thu đƣợc 550 g bột khô, thu đƣợc 61 g cao 85 mg carotene Hiệu suất tinh -carotene từ gấc 1,4.10-2 % Từ 10 kg cà chua tƣơi, thu đƣợc 600 g bột thịt cà chua khô, 71g cao 26 mg lycopene tinh Hiệu suất tinh lycopene từ cà chua 4,3 10-2 % Từ 9,5 kg hoa cúc vạn thọ tƣơi, thu đƣợc 780 g bột khô cánh hoa cúc vạn thọ, thu đƣợc 120,56 g cao thô chứa lutein ester 4,96 g lutein tinh Nhƣ vậy, thu đƣợc 630 mg/100g bột khô cánh hoa cúc vạn thọ Hiệu suất lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ 0,63 % So với kết nghiên cứu tính toán HPLC hàm lƣợng -carotene gấc bánh tẻ 15 mg; lycopene từ cà chua 45mg; lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ 714mg; ta thấy kết tinh carotenoid quy trình chúng tơi đƣa đạt hiệu suất khoảng 90% Do đó, kết luận quy trình thu mẫu, chiết xuất tinh carotenoid cho kết tốt, thu đƣợc chế phẩm carotenoid tinh khiết với hiệu cao 3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAROTENOID 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa điều kiện in vitro 3.2.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa carotenoid tinh lên catalase Đối với chế phẩm -carotene thu đƣợc từ gấc, nồng độ 2,5 mg% làm giảm hoạt độ catalase gần nửa, 65% (nhóm máu A), 55,5% (nhóm máu B), 53,5% (nhóm máu AB) 57,5% (nhóm máu O) Cho tới nồng độ cuối 40 mg%, hoạt độ catalase giảm xuống thấp nhất, 17,6% (nhóm máu A), 15,1% (nhóm máu B), 15% (nhóm máu AB), 15,5% (nhóm máu O) Khi tăng nồng độ chế phẩm lycopene từ mg% đến 30 mg%, hoạt độ catalase giảm từ 100% xuống 48,3% nhóm máu A, 33,3% nhóm máu B, 43,1% nhóm máu AB 41,8% nhóm máu O Ảnh hƣởng chế phẩm lên catalase nhóm máu có khác nhau, hoạt độ catalase giảm dần theo thứ tự B>O>AB>A Đối với lutein, nồng độ thấp (2 mg%) gây giảm hoạt độ catalase nhanh chóng, đến 10 mg% làm giảm hoạt độ catalase tới gần mức tối thiểu, 27,3% với nhóm máu A, 33,3% với nhóm máu B, 30% với nhóm máu AB, 41,7% với nhóm máu O 3.2.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa chế phẩm tinh carotenoid lên peroxidase Chế phẩm tinh -carotene có gây ảnh hƣởng tới hoạt độ peroxidase máu ngƣời mạnh hẳn so với cao gấc Nồng độ -carotene 25 mg% gây giảm hoạt độ peroxidase 70,7% (nhóm máu A), 67,5% (nhóm máu B), 82,1% (nhóm máu AB), 73,7% (nhóm máu O) Ảnh hƣởng chế phẩm tinh lycopene lên hoạt độ peroxidase đƣợc thể qua giảm hoạt độ enzyme từ 100% xuống 55,1% (nhóm máu A), 51% (nhóm máu B), 59,6% (nhóm máu AB), 45,8% (nhóm máu O) nồng độ lycopene tăng đến 40 mg% Sự giảm hoạt độ diễn mạnh nồng độ lycopene mức từ mg% đến 10 mg%, sau diễn tiến chậm Hiệu lực cạnh tranh lycopene lên peroxidase nhóm máu O lớn nhất, nhóm máu B, A, AB Đối với chế phẩm tinh lutein thu đƣợc từ cao cánh hoa cúc vạn thọ nhận thấy chúng gây giảm mạnh hoạt độ peroxidase nồng độ thấp Ở mg%, hoạt độ peroxidase nhóm máu A giảm 64,5%, nhóm máu B giảm 52,7%, nhóm máu AB giảm 54,8%, nhóm máu O giảm 55,3% Đến nồng độ 25 mg%, hoạt độ giảm 29,1% (nhóm máu A), 21,4% (nhóm máu B), 25,4% (nhóm máu AB), 20,7% (nhóm máu O) 3.2.1.3 Khả chống oxy hóa chế phẩm lên tế bào gan chuột in vitro Bảng 3.1 Khả chống oxy hóa lên tế bào gan chuột in vitro DMSO 0,5360 H202 0,8567 Nồng độ μg/ml β-carotene lutein lycopene Ocpola ED50 100 50 25 12,5 6,25 3,1 0,8696 0,7623 0,7757 0,7321 0,7252 0,7151 0,7188 0,6847 0,6734 0,6648 0,6204 0,6283 % tế bào sống sót Nồng độ μg/ml β -caroten lutein 100 101,51 88,98 50 90,55 85,45 Curcumin 0,8290 0,8135 0,7869 0,7190 0,6551 0,6251 0,8219 0,7569 0,6980 0,6831 0,6487 0,6027 0,8308 0,8050 0,7719 0,7356 0,7239 0,6817 lycopene 96,77 94,96 Ocpola 95,94 88,35 Curcumin 96,98 93,97 37,5 uM 18,75 9,375 4,69 2,35 1,17 DMSO 62,57 25 12,5 6,25 3,1 84,65 83,91 78,61 72,41 83,47 79,93 77,60 73,34 91,85 83,92 76,46 72,96 81,48 79,73 75,72 70,36 90,10 85,86 84,49 79,57 Từ kết bảng 3.1, thấy tăng nồng độ chế phẩm β-carotene, lutein, lycopene TPCN Ocpola từ 3,1μg/ml lên tới 100μg/ml khả bảo vệ tế bào khỏi tác hại H2O2 tăng, thể chỗ % tế bào gan nuôi in vitro tăng từ khoảng 70% lên tới 100% Khi cho H2O2 vào đĩa có tế bào gan chuột chúng sống sót 62,57% curcumin chất có khả chống oxy hóa đƣợc ngƣời biết đến có khả bảo vệ cao (96,98% tế bào sống sót) nồng độ 100 μg/ml Trong đó, chế phẩm tinh β-carotene nồng độ 100 μg/ml 100% tế bào sống sót Chứng tỏ, β-carotene có khả bảo vệ tế bào khỏi tác hại H2O2 Tƣơng tự, chế phẩm lutein, lycopene nhƣ thực phẩm chức Ocpola có khả bảo vệ tế bào gan chuột khỏi tác hại H2O2 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hố -carotene, lycopene lutein điều kiện in vivo chuột 3.2.2.1 Sự thay đổi trọng lượng trung bình chuột trước sau thí nghiệm Hình 3.1 Sự thay đổi trọng lƣợng trung bình chuột trƣớc sau thí nghiệm (Lơ 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + Ocpola,, lô 7: uống chế phẩm -carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Từ kết từ hình 3.1, ta thấy lơ chuột uống CCl 4, trọng lƣợng chuột giảm rõ rệt, sức sống Khi cho uống kèm với chế phẩm carotenoid chúng tơi, chúng có phục hồi nhẹ Còn lơ chuột bình thƣờng chuột uống bổ sung carotenoid có phát triển bình thƣờng 3.2.2.2 Hoạt tính catalase máu chuột Hình 3.2 Sự thay đổi hoạt độ Hình 3.3 Sự thay đổi hoạt độ catalase máu chuột lô thí catalase gan chuột lơ thí nghiệm nghiệm (Lô 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm -carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Ta thấy ống đối chứng, khơng có mẫu máu, lƣợng KMnO sử dụng để trung hòa H2O2, đó, hoạt độ catalase đƣợc coi 100% Ở lô 1, chuột uống muối sinh lí, hoạt độ có tăng nhẹ so với lô Lô chuột uống CCl4, Ở hoạt độ catalase tăng lên 600 lần, điều chứng tỏ chúng bị tổn thƣơng nhiều Còn lơ chuột từ đến 6, chuột ngồi uống CCl4, đƣợc bổ sung thêm chế phẩm tinh beta-carotene, lycopene, lutein Ocpola; đây, hoạt độ catalase có tăng, nhƣng rõ ràng nhỏ hoạt độ lô uống CCl4 đáng kể Còn lơ chuột lại từ đến 10 lô chuột uống chế phẩm tinh beta-carotene, lycopene, lutein Ocpola; hoạt độ enzyme catalase xoay quanh giá trị 100% Từ đây, ta thấy gan bị tổn thƣơng CCl 4, chế phẩm carotenoid chúng tơi có tác dụng bảo vệ, hoạt độ catalase giảm đáng kể Điều khẳng định việc gan chuột bị tổn thƣơng CCl4, chế phẩm carotenoid chúng tơi có tác dụng làm giảm tác hại tổn thƣơng 3.2.2.3 Hoạt tính peroxidase máu gan chuột Hình 3.4 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase Hình 3.5 Sự thay đổi hoạt độ peroxidase máu chuột lơ thí nghiệm gan chuột lơ thí nghiệm (Lơ 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm -carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Ở lô 2, chuột uống CCl4, hoạt độ peroxidase tăng lên mạnh, 600% Còn lơ chuột từ đến 6, chúng giảm đƣợc xuống xấp xỉ 100% Các lô chuột không uống chất độc, mà uống chế phẩm carotenoid chúng tôi, hoạt độ peroxidase xoay quanh 100% Kết từ hình 3.5 cho ta khẳng định thay đổi gan bị gây độc CCl4 kết hợp với chế phẩm carotenoid chúng tơi, thay đổi lô chuột tƣơng tự nhƣ với hoạt độ enzyme máu 3.2.2.4 Enzyme cytochrome b5 máu gan chuột Hình 3.6 Hàm lƣợng cytochrome b5 máu gan chuột (Lô 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm -carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lơ 10: uống Ocpola) Chúng ta thấy hàm lƣợng cytochrome b5 có thay đổi đáng kể lô chuột nghiên cứu Ở lô chuột đối chứng uống dung dịch muối sinh lý, hàm lƣợng cytochrome b5 0,085 μg/ml máu 0,089 μg/g gan, nhƣng lô chuột uống CCl4, hàm lƣợng 0,04 μg/ml máu 0,037 μg/g gan Các lơ chuột có uống CCl4, hàm lƣợng cytochrome b5 ổn định hơn, trở giá trị 0,09 μg/ml máu 0,1 μg/g gan Điều chứng tỏ, chế phẩm tinh carotenoid thực phẩm chức Ocpola có khả cân lƣợng cytochrome b5 chuột uống CCl4 3.2.2.5 Các số GOT GPT máu gan chuột Hình 3.7 Các số GOT GPT Hình 3.8 Các số GOT GPT máu chuột gan chuột (Lô 1: uống NaCl 0,9%, lô 2: uống CCl4, lô 3: uống CCl4 + chế phẩm -carotene, lô 4: uống CCl4 + chế phẩm lutein, lô 5: uống CCl4 + chế phẩm lycopene, lô 6: uống CCl4 + hỗn hợp chế phẩm, lô 7: uống chế phẩm -carotene, lô 8: chế phẩm lutein, lô 9: uống chế phẩm lycopene, lô 10: uống Ocpola) Khi tế bào gan bị phá huỷ gây tăng cao, nhanh hoạt độ GOT, GPT máu Ở lô chuột bị gây độc, số GOT GPT tăng cao nhất, lô gây độc đồng thời sử dụng chế phẩm carotenoid, hoạt độ GOT GPT giảm nhƣng cao so với lô đối chứng Các lô gây độc đồng thời sử dụng hỗn hợp ba chế phẩm carotenoid hoạt độ GOT GPT lại giảm mạnh Điều chứng tỏ việc sử dụng carotenoid giúp cho hoạt độ GOT GPT dần phục hồi lại nhƣng chậm khơng hồn tồn ổn định Nguyên nhân thời gian sử dụng chế phẩm 10 ngày ngắn nồng độ chế phẩm carotenoid bổ sung chƣa đủ liều chất enzyme GOT, GPT 3.2.2.6 Quan sát tiêu đúc cắt tế bào gan chuột Ở lô chuột uống CCl4, tế bào gan bị tổn thƣơng mạnh Giữa tế bào có khoảng trống rộng mẫu gan chuột đối chứng, điều chứng tỏ, gan chúng có gắn kết yếu Bên cạnh đó, ta thấy xuất nhiều đại thực bào có mặt quanh mạch máu, gần tế bào bị chết, nhân chúng bị teo đi, có kích thƣớc bé hẳn so với nhân tế bào gan bên cạnh Bên cạnh đó, lơ chuột từ đến lô chuột uống CCl4 kèm với chế phẩm carotenoid thực phẩm chức chúng tơi tổn thƣơng gan nhẹ hẳn Tƣơng tự, mẫu gan lô 7-10 tƣơng đƣơng với mẫu gan lô chuột đối chứng Qua đây, ta lần khẳng định rằng, chế phẩm tinh thực phẩm chức có khả bảo vệ gan Lơ Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô 10 Hình 3.9 Hình ảnh quan sát tiêu đúc cắt tế bào gan chuột 10 lơ thí nghiệm 3.2.3 Hoạt tính β-carotene, lycopene lutein lên dòng tế bào ung thƣ 3.2.3.1 Kết thử độ độc lên tế bào 45 40 35 β –carotene ug/ml 30 Lycopene 25 Lutein 20 Ocpola 15 Chất chuẩn ellipticine 10 Dòng tế bào ung thư Hình 3.10 Nồng độ chế phẩm carotenoid TPCN Ocpola giá trị IC50 tế bào ung thƣ KB LNCap Chúng tiến hành kiểm tra khả gây độc lên dòng tế bào ung thƣ biểu mơ miệng ung thƣ tuyến tiền liệt Các chế phẩm β-carotene, lycopene lutein thể độc tính hai dòng tế bào, nhiên dòng tế bào ung thƣ KB số IC50 lớn số IC50 dòng LNCap Điều có nghĩa chế phẩm carotenoid thể độc tính dòng tế bào ung thƣ LNCap mạnh dòng tế bào ung thƣ KB Nhƣ vậy, qua việc tiến hành thí nghiệm in vitro với mục đích nhằm khẳng định khả phòng ngừa ung thƣ carotenoid (β-carotene, lycopene lutein), với kết thu đƣợc chúng tơi nói chế phẩm thu đƣợc từ ba đối tƣợng thực vật nghiên cứu thể tính độc hay nói cách khác thể khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thƣ 3.2.3.2 Kết cảm ứng enzyme Caspase của β-carotene, lycopene lutein Ocpola lên LU-1 MCF-7 Hình 3.11 Cảm ứng chế phẩm tinh TPCN lên dòng tế bào ung thƣ phổi Hình 3.12 Cảm ứng chế phẩm tinh Ocpola lên dòng tế bào ung thƣ vú Từ kết trên, ta thấy dòng tế bào ung thƣ phổi nồng độ chế phẩm tinh -carotene, lycopene, lutein TPCN Ocpola nồng độ 6,25 μg/ml, hoạt độ caspase-3 29,93 (ng/100 μl) với beta-carotene; 16,5 (ng/100 μl) với lycopene; 14,05 (ng/100 μl) với lutein, 33,25 (ng/100 μl) với TPCN Ocpola, (P