Nghiên cứu tách chiết capsaicin từ ớt ( capsicum frutescens ( l ) bail) để phát triển thực phẩm chức năng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM -o0o - BÁO CÁO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CAPSAICIN TỪ ỚT (Capsicum frutescens (L.) Bail) ĐỂ PHÁT TRIỂN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Mã số: 184.TP14 TS NGUYỄN NGỌC TUẤN GVHD: Chủ nhiệm: Lê Thị Thảo My Võ Duy Khánh TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hoàn thành nghiên cứu bên cạnh nỗ lực nhóm cịn có giúp đỡ từ nhiều phía Trước tiên, chúng tơi xin gửi lời cám ơn tới trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất điều kiện cho việc học tập nghiên cứu, thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tận tình giảng dạy, truyền đạt cho chúng tơi kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuấn tận tình giúp đỡ, trực tiếp bảo, hướng dẫn suốt trình làm đồ án tốt nghiệp Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bên viện nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi phịng thí nghiệm dụng cụ, hóa chất thiết bị để chúng tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Mặc dù cố gắng với trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, chúng tơi mong nhận ý kiến đóng góp quý thầy cô Chúng chân thành cám ơn Tp HCM, ngày 27 tháng năm 2019 Nhóm thực đề tài i TĨM TẮT Mục đích: tách chiết, phân lập hợp chất phenolic từ ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Được thu hái huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp Ngày 18 tháng năm 2018 Được định danh Tiến sĩ Đỗ Ngọc Đài-Trường ĐH Kinh tế Nghệ An Tp Vinh Tách chiết, phân lập hai hợp chất Capsaicin Acid Cinnamic từ ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) bằng phương pháp sắc kí cột, sắc kí mỏng xác định cấu trúc hợp chất bằng phương pháp vật lí UV, IR, NMR, MS ii MỤC LỤC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Error! Bookmark not defined LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ĐỒ ÁN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1 Tổng quan ớt 1.1 Giới thiệu 1.2 Định danh dược liệu 1.3 Mô tả hình thái phân bố sinh thái 1.4 Thành phần hóa học 1.5 Hoạt tính sinh học ớt 1.6 Tổng quan capsaicin 1.6.1 Nguồn gốc Capsaicin 1.6.2 Định nghĩa Capsaicin 1.6.3 Công dụng Capsaicin 1.6.4 Tác dụng phụ Capsaicin CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu: 2.1 Thời gian địa điểm: 2.2 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị: 2.2.1 Nguyên liệu: 2.2.2 Hóa chất thiết bị 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 11 2.3.2 Phương pháp chiết tách, phân lập 11 2.3.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 11 iii 2.4 Nghiên cứu hợp chất từ ớt 11 2.4.1 Quy trình nghiên cứu 11 2.4.2 Phương pháp lấy mẫu 12 2.4.3 Quy trình xử lí mẫu 13 2.4.4 Phương pháp sắc ký cột phương pháp sắc ký mỏng: 15 2.5 Phương pháp xác định cấu tạo hợp chất: 17 2.6.Các thông số vật lý thu được: 21 2.6.1 Capsaicin 21 2.6.2 Cinnamic acid 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 Các hợp chất: 22 3.1 Hợp chất 1: 22 3.2 Hợp chất 2: 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC a Phụ lục 1: Thiết bị sử dụng trình nghiên cứu a Phụ lục 2: Hình ảnh chấm bảng mỏng b iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất capsaicin Bảng 3.1 Kết 1H-NMR 13C-NMR hợp chất Bảng 3.2: Kết phổ hợp chất v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây ớt Hình 2.1 Ngun liệu ớt nghiên cứu Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 2.3 Quy trình thu mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 2.4 Quy trình xử lí mẫu ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 2.5 Phân lập hợp chất từ ớt (Capsicum frutescens (L.) Bail) Hình 3.1 Phổ HMBC hợp chất Hình 3.2 Capsaicin 3D Hình 3.3 Phổ 1H-NMR CAP005 Hình 3.4 Phổ giản thể 1H-NMR CAP005 Hình 3.5 Phổ giản thể 1H-NMR CAP005 Hình 3.6 Phổ 13C-NMR CAP005 Hình 3.7 Phổ giản thể 13C-NMR CAP005 Hình 3.8 Phổ HMBC CAP005 Hình 3.9 Phổ HMBC giản thể CAP005 Hình 3.10 Phổ HMBC giản thể CAP005 Hình 3.11 Phổ HMBC giản thể CAP005 Hình 3.12 Phổ HMBC giản thể CAP005 Hình 3.13 Phổ HMQC CAP005 Hình 3.14 Phổ HMQC giản thể CAP005 Hình 3.15 Phổ HMQC giản thể CAP005 Hình 3.16 Phổ khối lượng hợp chất Hình 3.17 Phổ 1H-NMR hợp chất vi Hình 3.18 Phổ 1H-NMR hợp chất Hình 3.19 Phổ 13C-NMR hợp chất Hình 3.20 Phổ 13C-NMR hợp chất Hình 3.21 Phổ DEPT hợp chất Hình 3.22 Phổ DEPT hợp chất vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT UltraViolet Visible (UV-Vis): Quang phổ tử ngoại khả kiến Ultraviolet (UV): Tia tử ngoại tia cực tím Infrared radiation (IR): Quang phổ hồng ngoại Nuclear Magnetic Resonance (NMR): Cộng hưởng từ hạt nhân Mass Spectroscopy (MS): Phương pháp khối phổ Thin Layer Chromatography (TLC): Sắc ký lớp mỏng Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT): Xác định cấu trúc bằng cách chuyển giao phân cực Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC): Tương quan hạt nhân đa liên kết Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC): Kết hợp lượng tử đơn hạt nhân viii ĐẶT VẤN ĐỀ Các nhà khoa học xác định chất capsaicin ớt cay có khả giết chết tế bào ung thư nhiều lợi ích cho sức khỏe, nhiên điều có sử dụng capsaicin cách Ớt loại phổ biến nhiều nơi giới, sử dụng rộng rãi làm chất tạo hương vị thực phẩm, chất tạo màu, … Do có hương vị đặc trưng nên ớt sử dụng làm gia vị bữa ăn hàng ngày Bên cạnh đó, ớt cịn vị thuốc quý y học cổ truyền chữa nhiều bệnh hữu hiệu Ớt vị thuốc giúp tiêu hóa tốt, giúp ăn ngon chóng tiêu Ớt cịn dùng ngồi vị thuốc gây đỏ, kích thích chỗ với trường hợp đau nhức phong thấp, đau khớp, đau lưng [4] Gần đây, số tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng bắt đầu trồng ớt với diện tích lớn nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu cho nhà máy sản xuất mặt hàng thực phẩm Các sản phẩm đưa thị trường tiêu thụ xuất mang lại lợi nhuận cao Trong ớt có chất chủ yếu như: capsaicin (C18H27NO3) alcaloid chiếm khoảng 0,05 – 2%, phần lớn tập trung biểu bì giá nỗn; vitamin C chiếm tỉ lệ khoảng 0,8 – 1% ớt Việt Nam; ngồi ớt cịn có chất khác capsanthin, vitamin B1, B2, citric axit, malic axit [5] Ngồi Capsaicinoid, đặc biệt capsaicin đóng vai trị quan trọng cơng nghiệp thực phẩm dược phẩm [5] [6] Capsaicin sử dụng điều trị hen suyển, ho, đau họng, giảm đau răng, viêm thấp khớp [7] Capsaicin cịn chất kháng oxi hóa, thúc đẩy q trình chuyển hóa lượng, ngăn chặn tích tụ chất béo chất chống viêm [8] Hàm lượng capsaicin khác tùy theo loại ớt khác Nhiều nghiên cứu thực nhằm so sánh, đánh giá hàm lượng capsaicin loại ớt Năm 2010, Nwokem cộng [9] trích ly năm loại ớt khác Nigeria, hàm lượng capsaicin xác định bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Năm 2012, Ida Musfiroh cộng [10] đánh giá hàm lượng capsaicin 12 loại ớt khác Indonesia Trong năm 2012, XiangYuan Deng cộng [11] tối ưu hóa q trình trích ly capsaicinoid với hỗ trợ siêu âm tỉ lệ dung mơi/ngun liệu thích hợp là10 mg/g Trích ly với hỗ trợ vi sóng phương pháp sử dụng trích ly capsaicinoid Năm 2003, Opal cộng sư [12] trích ly capsaicinoid với tỉ lệ nguyên liệu 10 ml/g cho thấy phương pháp trích 95% capsaicinoid Ngồi ra, tỉ lệ dung mơi/ngun liệu Barbero cộng ix CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận Hình 3.14 Phổ HMQC giản thể CAP005 36 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận Hình 3.15 Phổ HMQC giản thể CAP005 37 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận 3.2 Hợp chất 2: Hợp chất có dạng tinh thể màu trắng khơng mùi, nhiệt độ nóng chảy 132133°C Phổ khối lượng HRMS: m/z 148,566 [M]+ ứng với công thức phân tử C9H7O2: 148,1586 Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton nhóm benzyl H-2’, 6’(7,41), H3’,5’(7,56) H-4’(7,40) Ngồi cịn có hai tín hiệu proton trans olefin (δH 6,46, 7,79) (Bảng 3.2) Phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ DEPT (Bảng 3.2), cho thấy tín hiệu nguyên tử cacbon: cacbon cacbonyl C-1 (δC 171,8); sáu cacbon thơm (δC 128,4, 129,0, 130,7, 134,1), hai carbon olefin (δC 117,2, 147,1) Kết hợp phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT so sánh với tài liệu tham khảo [24] cho phép xác định cấu trúc hợp chất axit cinnamic Axit cnnamic Bảng 3.2: Kết phổ hợp chất Cacbon DEPT 13C-NMR C=O 171,8 CH 147,1 7,79(1h, d, J=15,5) CH 117,2 6,46 (1H, d, J=16) C-1’ C 134,1 C-4’ CH 130,7 7,40 (1H, s) C3’-5’ CH 129,0 7,56 (2H, t,) C2’-6’ CH 128,4 7,41 (2H, d,) 38 1H-NMR CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận Hình 3.16 Phổ khối lượng hợp chất CAP003-CDCL3-1H Hình 3.17 Phổ 1H-NMR hợp chất 39 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận CAP003-CDCl3-1H Hình 3.18 Phổ 1H-NMR hợp chất 40 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận CAP003-CDCl3-C13CPD CAP003-CDCl3-Cl3CPD Hình 3.19 Phổ 13C-NMR hợp chất 41 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận CAP003-CDCl3-Cl3CPD Hình 3.20 Phổ 13C-NMR hợp chất 42 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận CAP003-CDCl3-Cl3CPD&DEPT Hình 3.21 Phổ DEPT hợp chất CAP003-CDCl3-Cl3CPD&DEPT Hình 3.22 Phổ DEPT hợp chất 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Mẫu ớt ((Capsicum frutescens (L.) Bail), 5kg) thu hái huyện Thanh Bình, tỉnh Đồng Tháp, ngâm chiết với dung mơi ethanol, sau tiến hành thu hồi dung môi bằng áp suất thấp 480 g cao màu nâu Tiến hành chiết phân đoạn với dung môi cloroform bỏ dung môi thu 78 g cao Tiếp tục tiến hành phương pháp sắc ký cột phân tách phân đoạn (CAP1 3,6 g; CAP2 5,4 g; CAP3 25,2 g; CAP4 11,4 g; CAP5 21,8 g) Phân đoạn CAP3 CAP5 sử dụng phương pháp sắc kí cột phân tách phân đoạn tách phân đoạn khác (CAP32, CAP33, CAP34, CAP51, CAP52, CAP53) Phân đoạn CAP32 CAP51 bằng phương pháp sắc ký cột thu hai chất CAP003 38 mg (ở phân đoạn CAP32) với hệ dung môi rửa giải CHCL3:MeOH tỉ lệ 30:1 CAP005 6,4 mg (ở phân đoạn CAP51 với hệ dung môi rửa giải Hexan:Aceton tỉ lệ 7:3 Bằng phương pháp phổ MS, IR, NMR xác định cấu trúc hợp chất CAP003 Acid Cinnamic CAP005 Capsaicin 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu tách chiết phân lập capsaicin có từ lâu giới Việt Nam Tuy nhiên thực lại, với điều kiện phịng thí nghiệm, quy mơ nhỏ thời gian cịn hạn chế Nên chúng tơi có vài kiến nghị sau: - Khối lượng capsaicin thu lớn, nên lấy làm chất chuẩn để định lượng, kiểm định, loại thực phẩm có hàm lượng capsaicin - Có thể dùng capsaicin thu để điều chế loại thực phẩm chức hỗ trợ việc giảm cân, phòng chống ung thư… 44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] http://kkhtn.duytan.edu.vn/Home/ArticleDetail/vn/94/1668/tac-dung-cua-ot [2] “Life Science Research” (PDF) Truy cập 29 tháng năm 2015 [3] https://tuoitre.vn/chat-capsaicin-trong-ot-co-the-giup-ngan-chan-nguy-co-tangcan-1175835.htm [4] Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam 2004: p 382 – 384 [5] Xiaofeng Xu, Y.Z., Shiqiang Yan*, Optimization of Soxhlet extraction of capsaicinoids using orthogonal experiment [6] Xiang-Yuan Deng*, K.G., Xin Huang and John Liu, Optimization of ultrasonicassisted extraction procedure of capsaicinoids from Chili peppers using orthogonal array experimental design African Journal of Biotechnology, 21 August, 2012 Vol 11: p 13153-13161 [7] Enkelejda Goci1*, E.H., Kliton Vide2, Ledjan Malaj3Application And Comparison Of Three Different Extraction Methods Of Capsaicin From Capsicum Fruits Albanian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013 Vol 1: p 16-19 [8] Gerardo F Barbero, M.P., * and Carmelo G Barroso, Pressurized Liquid Extraction of Capsaicinoids from Peppers Journal of Agricultural and Food Chemistry, 04/04/2006 Vol 54: p 3231 – 3236 [9] C.O Nwokem*, E.B.A., 2J.A Kagbu, 2E.J Ekanem, Determination of Capsaicin Content and Pungency Level of Five Different Peppers Grown in Nigeria New York Science Journal, 2010 Vol 3: p 17 – 21 [10] Ida Musfiroh*, M.M., Treesye Angelina, Muchtaridi Muchtaridi, Capsaicin Level of Various Capsicum Fruits International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 29 Nov 2012 Vol 5: p 248 – 251 [11] Xiang-Yuan Deng, Kun Gao, Xin Huang and John Liu - Optimization of ultrasonicassisted extraction procedure of capsaicinoids from Chili peppers using 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ orthogonal array experimental design, African Journal of Biotechnology, 21/08/2012 Vol 11: p 13153-13161 [12] Opal J Williams, G.S Vdaya Raghavan, Valerie Orsat' Jianming Dai Microwave assisted Extraction Of Capsaicinoids From Capsicum Fruit, Journal of Food Biochemistry, 24/06/2003 Vol 28, p 113 – 122 [13] Gerardo F Barbero, Miguel Palma, Carmelo G Barroso - Determination of capsaicinoids in peppers by microwave-assisted extraction–high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, Analytica Chimica Acta, 04/06/2006 Vol 578, p 227–233 [14] Aggarwal BB, Kunnumakkara AB, Harikumar KB, Tharakan ST, Sung B, Anand P, Potential of spice-derived phytochemicals for cancer prevention, vol 74(13), pp 1560-1569, 2008 [15] https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/sac-ky/sac-ky-cot.aspx [16] Verlag chemie Academic pess (1966), N.Y Thin Layer Chromatography [18] Valentovic MA, Ball JG, Brown JM, Terneus MV, McQuade E, Van Meter S, Hedrick HM, Roy AA, William T, Resveratrol attenuates cisplatin renal cortical cytotoxicity by modifying oxidative stress, vol 28(2), pp 248-257, 2014 [19] Bley K, Boorman G, Mohammad B, McKenzie D, Babbar S, A comprehensive review of the carcinogenic and anticarcinogenic potential of capsaicin, vol 40(6), pp 847-873, 2012 [20] Yuan LJ, Qin Y, Wang L, Zeng Y, Chang H, Wang J, Wang B, Wan J, Chen SH, Zhang QY, Zhu JD, Zhou Y, Mi MT, Capsaicin-containing chili improved postprandial hyperglycemia, hyperinsulinemia, and fasting lipid disorders in women with gestational diabetes mellitus and lowered the incidence of large-for-gestationalage newborns, vol 35(2), pp 398-393, 2016 [21] Ellis CN, Berberian B, Sulica Vl, Dodd WA, Jarratt MT, Katz HI, Prawer S, Krueger G, Rex IH Jr, Wolf JE, A double-blind evaluation of topical capsaicin in pruritic psoriasis, vol 29(3), pp 438-442, 1993 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ [22] https://www.syngenta.com.vn/cay-ot [23] Natural Product Letters , Volume 3, 1993 - Issue [24] T Fukuyama, M Arai, H Matsubara and I Ryu, J Org Chem., 2004, 69, 81058107 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thiết bị sử dụng q trình nghiên cứu Hình 1.1 Thiết bị quay Hình 1.2 Cân kĩ thuật Hình 1.3 Bể siêu âm Hình 1.4 Máy sấy a Phụ lục 2: Hình ảnh chấm bảng mỏng Hình 2.1 TLC Capsaicin Hình 2.2 Bảng mỏng phân đoạn Hình 2.3 Bảng mỏng chiếu đèn UV b Hình 2.4 TLC Acid Cinnamic c ... 172,8 (C- 1), 146,7 (C-3? ?), 145,2 (C-4? ?), 138,1 (C- 7), 130,4 (C-1? ?), 126,5 (C- 6), 120,8 (C-6? ?), 114,3 (C-5? ?), 110,7 (C-2? ?), 43,6 (C-1’? ?), 36,8 (C- 2), 32,2 (C- 5), 30,9 (C- 8), 29,3 (C- 4), 25,3 (C- 3), ... Ngun liệu ớt nghiên cứu Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu phân l? ??p hợp chất từ ớt (Capsicum frutescens (L. ) Bail) Hình 2.3 Quy trình thu mẫu ớt (Capsicum frutescens (L. ) Bail) Hình 2.4 Quy trình xử l? ?... 126,39(d) 126,5 5,32(m) 5,32 (1 H, m) 23 CHƯƠNG Kết Quả Và Bàn Luận 137,98(d) 138,1 5,35(m) 5,34 (1 H, m) 30,92(d) 30,9 2,21(m) 2,21 (1 H, m) 22,62(q) 22,7 0,94(d, 7, 0) 0,94 (3 H, d, 6, 5) 8- 22,62(q)