Xác định đột biến điểm trên gen PARK2 ở bệnh nhân parkinson bằng kỹ thuật giải trình tự gen

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN PARK2 Ở BỆNH NHÂN PARKINSON BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Phạm Lê Anh Tuấn1, Nguyễn Thanh Bình1,2 Trần Vân Khánh1 Trần Huy Thịnh1, Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Lão khoa Trung ương Gen PARK2 mã hóa Parkin, enzyme E3 ubiquitin ligase Đột biến gen PARK2 ghi nhận phổ biến bệnh nhân Parkinson dạng di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Đột biến điểm gen PARK2 chiếm tỷ lệ khoảng - 12% bệnh nhân khởi phát sớm (trước 40 tuổi) Nhóm nghiên cứu nhận thấy cần thiết nghiên cứu tìm hiểu đột biến điểm gen PARK2 bệnh nhân Parkinson Việt Nam Nghiên cứu thực 30 bệnh nhân Parkinson với độ tuổi trung bình 52,6 ± 7,4 tuổi, tỷ lệ nam/nữ = 1,3 sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger Nghiên cứu phát đột biến điểm gen PARK2 với tỷ lệ 10%, tương ứng với 3/30 bệnh nhân mang dạng đột biến khác Các bệnh nhân mang đột biến giai đoạn khởi đầu (I II) bệnh Nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn bệnh nhân gia đình, đóng góp vào sở liệu bệnh Parkinson Việt Nam Từ khóa: Parkinson, đột biến gen, giải trình tự, PARK2 I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Parkinson (PD) rối loạn gây nhiều yếu tố, gồm di truyền môi trường, đồng thời định thời gian phát bệnh tiến triển PD ảnh hưởng chủ yếu tới hệ thần kinh vận động, thối hóa dài hạn hệ thần kinh trung ương Cơ chế bệnh học điển hình bệnh chức hệ ubiqitin-proteasome, tăng vượt mức q trình oxi hóa, rối loạn điều tiết vận chuyển protein thương tổn ty thể.1 Sự kết hợp nhiều chế bệnh sinh khác cuối dẫn tới sụp đổ hoạt động tế bào quan trọng Tuy nhiên, nhiều yếu tố ảnh hưởng chế khác vậy, Shulman (2011) ước tính khoảng - 10% bệnh nhân Tác giả liên hệ: Trần Huy Thịnh Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 19/05/2022 Ngày chấp nhận: 26/05/2022 14 PD mang kiểu hình bệnh điển hình ghi chép cụ thể y văn.2 Trong số nhiều gen liên quan tới PD, có số gen gọi PARK loci, chúng phát có mối tương quan mật thiết tới chế gây bệnh Đột biến gen PARK gây thể bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể (NST) thường (như gen PARK1, PARK8) hay thể di truyền lặn NST thường (PARK2, PARK7, PARK6) Trong nghiên cứu này, chúng tơi sâu tìm hiểu đột biến gen PARK2, gen xuất phổ biến đồ đột biến PD giới PARK2 mã hóa Parkin, enzyme E3 ubiquitin ligase Các đột biến gây bệnh gen PARK2 bao gồm đột biến thay đổi đơn nucleotid, đột biến xóa đoạn nhỏ lớn, đột biến vị trí cắt nối Các đột biến này, dù theo chế hay chế khác, dẫn tới bất hoạt chức Parkin Nghiên cứu Dawson cs (2010) cho thấy đột biến sai nghĩa làm phần chức Parkin TCNCYH 155 (7) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thơng qua việc gây suy giảm hoạt độ xúc tác ngăn chặn q trình ubiquitin hóa Các đột biến điểm cịn làm lỏng lẻo cấu trúc protein, dẫn tới việc hấp phụ thối hóa nhanh enzyme Gen PARK2 gồm 12 exon, trải dài 50kb Nhiều nghiên cứu tìm đột biến điểm gen PARK2 có liên hệ tới ca PD khởi phát sớm (trước 40 tuổi) Các đột biến điểm gen PARK2 không tập trung mà trải dài khắp gen nên khơng có liệu vùng đột biến tập trung cụ thể Tỷ lệ phát đột biến điểm gen PARK2 bệnh nhân PD thay đổi đáng kể, dựa dân tộc, vùng địa lý tiêu chuẩn lựa chọn mẫu khác Cụ thể, nghiên cứu Kann cộng (2001) Đức 111 bệnh nhân PD cho tỷ lệ đột biến gen PARK2 9%, nghiên cứu Sun cộng (2006) cho tỷ lệ lên tới 12,6% Từ luận chứng trên, nhận định việc xác định đột biến điểm gen PARK2 bệnh nhân PD cần thiết Dữ liệu nghiên cứu không thông tin di truyền quan trọng cho bệnh nhân PD người nhà mà cịn góp phần xây dựng hệ thống liệu đột biến gây bệnh Việt Nam Vì nghiên cứu thực với mục tiêu: Xác định đột biến điểm toàn vùng mã hoá gen PARK2 bệnh nhân Parkinson II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn lựa chọn: Lựa chọn 30 bệnh nhân đến khám điều trị Khoa Thần kinh Bệnh Alzheimer, Bệnh viện Lão khoa Trung ương Bệnh nhân lựa chọn tham gia vào nghiên cứu phải đáp ứng tiêu chuẩn xác định bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn Ngân hàng não thuộc Hội bệnh Parkinson Vương quốc Anh (UKPDSBB/United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank) TCNCYH 155 (7) - 2022 Tiêu chuẩn loại trừ: + Bệnh nhân mắc bệnh di truyền khác + Bệnh nhân có tiền sử mắc bệnh não như: chấn thương sọ não nhiều lần, u não, viêm não, tai biến mạch máu não Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2021 đến tháng 5/2022 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Quy trình thực hiện: + Thu thập mẫu: Phương pháp lấy mẫu thuận tiện, 2mL máu tĩnh mạch bệnh nhân mắc Parkinson thu thập vào ống chống đông EDTA + Tách chiết DNA: DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu toàn phần kit The Wizard® Genomic DNA Purification Kit hãng Promega (USA) Tất mẫu sau tách chiết tiến hành đo nồng độ độ tinh máy đo quang phổ Nanodrop Mẫu đạt tiêu chuẩn OD260/ OD280 ≥ 1,8 sử dụng để phân tích gen + Kỹ thuật PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại số exon gen PARK2 Trình tự mồi thiết kế sử dụng tiện ích primer3 (v.0.4.0) Thành phần phản ứng PCR: tổng thể tích 10µl gồm: 1µl DNA, 1µl primer (F/R), 5µl Gotaq 2x, 3µl nước cất Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 95oC/5 phút, [95oC /30 giây, 58 oC /30 giây, 72oC /30 giây] x 35 chu kỳ, 72oC /5 phút, giữ 15oC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%, 120V 30 phút + Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen gồm: Buffer Big dye 5X, Big dye Terminator v3.1, mồi xi mồi ngược (10 pmol/µl), sản phẩm PCR exon gen GBA Quy trình 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thực theo hướng dẫn sử dụng cho kit BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI - Mỹ) Sản phẩm PCR giải trình tự sau tinh giải trình tự gen Sanger máy ABI-3500 phân tích phần mềm CLC Main Workbench Kết giải trình tự so sánh với trình tự chuẩn: NG_008289 gen PARK2 GeneBank - Xử lý số liệu: + Kết giải trình tự xử lý phần mềm CLC MainWorkbench (Qiagen) so sánh với trình tự chuẩn từ NCBI Genebank + Phần mềm excel sử dụng để thu thập thông tin từ hồ sơ bệnh án xử lý số liệu Đạo đức nghiên cứu Đây nghiên cứu mô tả cắt ngang thông tin cá nhân mã hóa giữ bảo mật an toàn Thu thập số liệu tiến hành cách trung thực, phục vụ cho mục đích nghiên cứu III KẾT QUẢ Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn ngẫu nhiên 30 bệnh nhân chẩn đốn mắc PD thơng qua triệu chứng lâm sàng Các đặc điểm phân bố nhóm tuổi giới đối tượng nghiên cứu trình bày bảng Bảng Phân bố tuổi giới nhóm đối tượng nghiên cứu Nhóm tuổi Nam Nữ Tổng Số lượng Tỷ lệ Số lượng Tỷ lệ Số lượng Tỷ lệ < 50 15 50% 26,67% 23 76,67% ≥ 50 6,67% 16,67% 23,33% Tổng 17 56,67% 13 43,33% 30 100% Về tuổi, nhóm bệnh nhân 50 tuổi chiếm đa số (76,67%) nghiên cứu Những bệnh nhân phát bệnh trước tuổi 50 coi nhóm bệnh nhân khởi phát bệnh trung bình/sớm Tuổi trung bình bệnh nhân nghiên cứu 52,6 ± 7,4 tuổi, dao động từ 42 đến 70 tuổi Về giới tính, tỷ lệ nam/nữ có chênh lệch 1,3 Ngồi ra, thơng tin lâm sàng bệnh nhân tổng hợp xếp giai đoạn bệnh theo phân loại Hoehn Yahr Thông tin đặc điểm giai đoạn bệnh đối tượng nghiên cứu trình bày bảng Bảng Đặc điểm giai đoạn bệnh đối tượng nghiên cứu Có đột biến Khơng có đột biến Tổng số Giai đoạn bệnh theo Hoehn Yahr n=3 % n = 27 % n = 30 % I 6,67 30 11 36,67 II 3,33 12 40 13 43,33 III 0 20 20% IV 0 0 0 V 0 0 0 16 TCNCYH 155 (7) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Theo bảng 2, đặc điểm giai đoạn bệnh PD chia làm 05 giai đoạn Cả bệnh nhân có đột biến gen PARK2 giai đoạn I II Ở bệnh nhân khơng có đột biến giai đoạn thường gặp giai đoạn II (40%) giai đoạn I (30%), gặp giai đoạn III (20%), khơng có bệnh nhân giai đoạn IV, V Đặc điểm đột biến gen PARK2 xác định nghiên cứu Cả 30 mẫu nghiên cứu xác định đột biến gen PARK2 kỹ thuật giải trình tự gen Sanger Chúng phát 3/30 (10%) bệnh nhân mang đột biến gen PARK2, tập trung exon Thông tin cụ thể tổng hợp bảng Bảng Đặc điểm thông tin bệnh nhân có đột biến đột biến tìm thấy STT Mã số Giới Tuổi Vị trí exon Đột biến thay Thay đổi acid amin Mô tả đột biến P4 Nữ 42 Exon c.823C>T p.Arg275Trp Dị hợp tử P15 Nữ 44 Exon c.1076G>A p Gly359Asp Dị hợp tử P26 Nam 45 Exon c.1010G>A p.Cys337Tyr Dị hợp tử Các đột biến gen PARK2 xác định Cả đột biến gen PARK2 xác định nghiên cứu chứng minh đóng góp vào khả gây bệnh PD (theo sở liệu Clinvar) Hình ảnh kết giải tình tự đột biến trình bày Hình Kết đột biến c.823C>T (p.Arg275Trp) bệnh nhân P4 Hình Kết đột biến c.1076G>A (p.Gly359Asp) bệnh nhân P15 TCNCYH 155 (7) - 2022 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bệnh nhân P4 mang đột biến thay đổi nucleotid vị trí 823, khiến nucleotid C biến thành T dạng dị hợp tử Thay đổi khiến acid amin thứ 275, Arginine, PARK2 mRNA biến đổi thành Tryptophan Ở bệnh nhân P15, đột biến dạng dị hợp tử làm thay đổi nucleotid vị trí 1076 exon 9, khiến nucleotid G biến đổi thành A Thay đổi DNA mã hóa mRNA PARK2 có acid amin thứ 359, Glycine, biến đổi thành Aspartate Hình Kết đột biến c.1010G>A (p.Cys337Tyr) bệnh nhân P26 Một đột biến khác exon bệnh nhân P26 làm thay đổi nucleotid vị trí 1010, khiến nucleotid G biến đổi thành A dạng dị hợp tử Thay đổi khiến acid amin thứ 337, Cystein, PARK2 mRNA biến đổi thành Tyrosin IV BÀN LUẬN Parkinson bệnh lý thần kinh nhận quan tâm lớn từ xã hội hệ đem lại cho bệnh nhân, gia đình, cộng đồng Bệnh nhiều chế bệnh sinh, nhiều biến đổi gen khác gây nên nghiên cứu nguyên nhân cấu thành bệnh hay vùng địa lý cụ thể mang đóng góp khơng nhỏ tới sở liệu PD Việt Nam nói riêng giới nói chung Nghiên cứu tuyển chọn ngẫu nhiên 30 bệnh nhân chẩn đoán mắc PD chuyên gia lâm sàng Về độ tuổi, tuổi trung bình nhóm nghiên cứu thu nhận 50,6 ± 7,4 tuổi, với dao động từ 42 đến 70 tuổi, tương đồng với nghiên cứu tác giả Nhữ Đình Sơn (2012) với độ 18 tuổi trung bình 56,69 ± 10,54 Các đột biến gen PARK2 cho có liên quan tới dạng PD khởi phát sớm (trước 40 tuổi) Trong nghiên cứu chúng tơi, có bệnh nhân mang đột biến gen PARK2 độ tuổi bệnh nhân 42, 44 45 tuổi, trẻ đáng kể so với tuổi trung bình nhóm nghiên cứu Điều phù hợp với nghiên cứu Min Kyung Chu (2014) tuổi khởi phát trung bình bệnh nhân PD mang đột biến PARK2 40,3 ± 13,6 tuổi tuổi bệnh nhân thời điểm nghiên cứu 44,6 ± 10,9 tuổi.3 Độ tuổi nhóm bệnh nhân mang đột biến PARK2 phù hợp với giai đoạn bệnh mà bệnh nhân phải trải qua Bảng cho thấy hai bệnh nhân giai đoạn I bệnh bệnh nhân giai đoạn II Đây giai đoạn khởi phát bệnh Về tỉ lệ giới tính, chênh lệch bệnh nhân nam cao gấp 1,3 lần so với nữ không mang lại nhiều ý nghĩa nghiên cứu khác giới khơng tìm thấy liên hệ giới tính với tỷ lệ mắc PD Trên tổng số 30 bệnh nhân nghiên cứu, TCNCYH 155 (7) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xác định bệnh nhân mang đột biến gen PARK2 (chiếm 10%) Tỷ lệ phù hợp với tỷ lệ 9% nghiên cứu Karn cs (2001) người Đức, hay tỷ lệ 12,6% nghiên cứu Sun cs (2006) người dân Mỹ, hay tỷ lệ 11,6% nghiên cứu Chu cs (2014) người Hàn Quốc.3-5 Tất đột biến thu nhân đột biến dị hợp tử Cả đột biến xác định chứng minh thử nghiệm lâm sàng in vivo nghiên cứu trước Đột biến ghi nhận lần đầu nghiên cứu Madegowda cs (2005) bệnh nhân PD Ấn Độ với tần suất allele thấp (0,49) Đột biến làm thay đổi acid amin Glycine - acid amin nhẹ, không phân cực - thành Arspatate acid amin mang tính chất acid (cung cấp proton) Dù thay đổi này, lý thuyết, mang đến thay đổi lớn tới cấu trúc không gian protein cần có nghiên cứu chứng minh cụ thể ảnh hưởng đột biến in vivo công nhận ngân hàng liệu Clinvar Đột biến c.823C>T (p.Arg275Trp) làm biến đổi acid amin Arginine thành Tryptophan Arginine Arginine acid amin khơng phân nhánh, tích điện +1 khơng có vịng thơm, Tryptophan acid amin khơng phân cực có vịng Benzopyrrole Việc chuyển biến từ Arg thành Trp làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc khơng gian Parkin vị trí Sriram cs (2005) qua thử nghiệm in vivo cho đột biến làm cấu trúc enzyme Parkin bị “bó” lại, khả phân giải chất, tích tụ dẫn tới giảm chức tổng hợp ATP ty thể tế bào Đột biến Arg275Trp ghi nhận thường xuyên nghiên cứu khắp giới đánh giá đột biến điểm gen PARK2 phổ biến Ví dụ nghiên cứu Klein cs (2005) bệnh nhân PD khởi phát sớm Italia xác định trường hợp mang đột biến vị trí này.6 Nghiên cứu Li cs (2014) gia đình người Duy Ngơ Nhĩ Thiên Tân, Trung Quốc khẳng định đột biến Arg275Trp đột biến chiếm đa số gen PARK2.7 Hay nghiên cứu Mitsuyama cs (2015) tổng hợp sở liệu từ 366 ca bệnh từ 39 dân tộc khác nhận định đột biến Arg275Trp đột biến phổ biến vùng mã hóa RING1 Parkin Trong đó, đột biến c.1076G>A (p.Gly359Asp) lại không ghi nhận nhiều lâm sàng Đột biến cuối c.1010G>A (p.Cys337Tyr) gây biến đổi acid amin Cysteine thành Tyrosine Về mặt lý thuyết, Cysteine Tyrosine thuộc nhóm acid amin phân cực, khơng tích điện, cấu trúc cysteine lại mạch nhánh đơn giản tyrosine lại tạo vòng thơm Thêm vào đó, cysteine đánh giá có khả phản ứng hóa học mạnh, tyrosine trơ Chính đột biến Cys337Tyr gây biến đổi lớn tới cấu trúc Parkin có khả gây bệnh Nghiên cứu Yan cs (2020) khẳng định điều này, đồng thời họ khởi tạo dòng tế bào gốc cảm ứng mang đột biến từ bệnh nhân mắc PD khởi phát sớm để phục vụ nghiên cứu sâu Đây báo cáo đột biến gen PARK2 xác định bệnh nhân PD Việt Nam Ngoài yếu tố gen, yếu tố khác môi trường sống thể trạng tâm lý góp phần vào biến đổi kiểu hình bệnh nhân Parkinson Vì vậy, chúng tơi đề nghị cần có nghiên cứu sâu hơn, cỡ mẫu lớn để chứng minh đầy đủ ý nghĩa đột biến điểm tìm kiếm thêm đột biến quần thể người Việt Nam TCNCYH 155 (7) - 2022 V KẾT LUẬN Bằng kỹ thuật giả trình tự gen Sanger, nghiên 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cứu phát 3/30 bệnh nhân (tỷ lệ 10%) mang đột biến điểm gen PARK2 Các đột biến đột biến sai nghĩa, nằm exon exon gen Lời cảm ơn Nghiên cứu thực hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Bộ Y tế "Nghiên cứu xác định đột biến gen liên quan đến bệnh Parkinson Việt Nam" số định phê duyệt 5886 QĐBYT, thực từ 6/2020-6/2022 TÀI LIỆU THAM KHẢO Shi MM, Shi CH, Xu YM Rab GTPases: The key players in the molecular pathway of Parkinson’s disease Front Cell Neurosci 2017;11 doi: 10.3389/FNCEL.2017.00081 Shulman JM, De Jager PL, Feany MB Parkinson’s disease: genetics and pathogenesis Annu Rev Pathol 2011;6:193-222 doi: 10.1146/ ANNUREV-PATHOL-011110-130242 Chu MK, Kim WC, Choi JM, et al Analysis of dosage mutation in PARK2 among Korean patients with early-onset or familial Parkinson’s disease J Clin Neurol 2014;10(3):244-248 doi: 10.3988/JCN.2014.10.3.244 Kann M, Jacobs H, Mohrmann K, et al Role of parkin mutations in 111 communitybased patients with early-onset parkinsonism Ann Neurol 2002;51(5):621-625 doi: 10.1002/ ANA.10179 Sun M, Latourelle JC, Wooten GF, et al Influence of heterozygosity for parkin mutation on onset age in familial Parkinson disease: the GenePD study Arch Neurol 2006;63(6):826832 doi: 10.1001/ARCHNEUR.63.6.826 Klein C, Djarmati A, Hedrich K, et al PINK1, Parkin, and DJ-1 mutations in Italian patients with early-onset parkinsonism Eur J Hum Genet EJHG 2005;13(9):1086-1093 doi: 10.1038/SJ.EJHG.5201455 Li H, Yusufujiang A, Naser S, et al Mutation analysis of PARK2 in a Uyghur family with early-onset Parkinson’s disease in Xinjiang, China J Neurol Sci 2014;342(1):2124 doi: 10.1016/J.JNS.2014.03.044 Summary IDENTFICATION OF POINT MUTATIONS IN PARK2 GENE WITH PARKINSON’S DISEASE PATIENTS USING SEQUENCING METHOD PARK2 encodes Parkin, a E3 ubiquitin ligase enzyme Mutations on PARK2 gene were often recorded in autosomal recessive juvenile form of Parkinson’s Object: Point mutations in PARK2 genes were found in early-onset Parkinson patients (before age of 40) at the rate of - 12% We suggest that it is necessary to conduct an investigation of PARK2 mutations in Vietnamese cohort This cohort study was performed in 30 Parkinson patients with average age of 52.6 ± 7.4 years old, male/female ratio is 1.3, using Sanger sequencing Three different types of point mutations were found in three patients (10%) All these three patients are currently in phase I and phase II of the disease This study proved to be significant to not only patients and their families but also to the database of Parkinson disease in Vietnam Keywords: Parkinson’s disease, mutation, Sanger sequencing, PARK2 gene 20 TCNCYH 155 (7) - 2022 ... có bệnh nhân giai đoạn IV, V Đặc điểm đột biến gen PARK2 xác định nghiên cứu Cả 30 mẫu nghiên cứu xác định đột biến gen PARK2 kỹ thuật giải trình tự gen Sanger Chúng phát 3/30 (10%) bệnh nhân. .. LUẬN Bằng kỹ thuật giả trình tự gen Sanger, nghiên 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cứu phát 3/30 bệnh nhân (tỷ lệ 10%) mang đột biến điểm gen PARK2 Các đột biến đột biến sai nghĩa, nằm exon exon gen. .. biến gen PARK2 xác định nghiên cứu chứng minh đóng góp vào khả gây bệnh PD (theo sở liệu Clinvar) Hình ảnh kết giải tình tự đột biến trình bày Hình Kết đột biến c.823C>T (p.Arg275Trp) bệnh nhân