TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH DANH ĐẾN CẤP ĐỘ LOÀI MỘT SỐ CHỦNG MYCOBACTERIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN Nguyễn Thị Hà1,, Nguyễn Văn Hưng2 Trần Minh Châu1, Phạm Hồng Nhung1 Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Phổi Trung ương Mặc dù có liên quan gần gũi mặt di truyền, lồi chi Mycobacterium lại có khác biệt lớn hình thái, tính chất, phân bố khả gây bệnh cho người Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh vi khuẩn lao (TBc ID hãng Becton Dickinson, Sparks, MD) không phát số chủng Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) không phân biệt đến loài chủng non-tuberculous mycobacteria (NTM) Phương pháp phân tích trình tự đoạn gen đích (16S rRNA, gyrB, rpoB, hsp65 ITS) chủng mycobacteria có thử nghiệm TBc ID âm tính khơng khắc phục nhược điểm nêu mà cho phép định danh đến lồi chủng NTM khơng phổ biến Trong số 105 chủng có TBc ID âm tính quan sát 56 chủng (53,3%) MTBC 49 chủng (46,7%) NTM Trong số 56 chủng MTBC, chiếm đa số lồi M tuberculosis, có chủng thuộc loài M bovis Trong số 49 chủng NTM, chiếm đa số phức hợp M abscessus/ M chelonae tiếp đến phức hợp M avium 13 lồi NTM khác chiếm tỉ lệ nhỏ Từ khóa: Mycobacteria, TBc ID, giải trình tự I ĐẶT VẤN ĐỀ Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh vi 4/12 loài MTBC M tuberculosis, khuẩn lao (TBc ID hãng Becton Dickinson, M africanum, M bovis (một số chủng) M Sparks, MD) phát phức hợp MTBC dựa microti không phân biệt loài vào khả tiết kháng nguyên MPT64 đặc với dẫn đến việc khó phân biệt hiệu mơi trường ni cấy TBc ID có giá trường hợp lao lây truyền từ người thành rẻ, thời gian thực nhanh chóng, sang người trường hợp lây truyền từ công cụ hữu hiệu phòng xét nghiệm động vật sang người lao, nhiều nghiên cứu đánh giá có độ Cùng chi Mycobacterium, loài NTM nhạy, độ đặc hiệu cao (97,9%; 99,5%) Tuy nhắc đến nhiều nghiên cứu gần nhiên, bối cảnh Việt Nam nằm nước phát triển, gióng lên hồi chng nhóm 30 nước có gánh nặng bệnh lao cao cảnh báo phổ biến nhóm lồi giới, tỉ lệ nhỏ chủng MTBC không phát Hầu hết nghiên cứu đưa báo cáo thông qua thử nghiệm TBc ID trở gia tăng tỉ lệ mắc bệnh liên quan thành số có ý nghĩa đáng kể nước ta đến NTM vòng thập kỷ qua.2 Việc định Thêm vào đó, thử nghiệm TBc ID phát danh đến loài chủng NTM không yêu cầu bắt buộc chẩn đốn, mà cịn cung Tác giả liên hệ: Nguyễn Thị Hà cấp nhiều thông tin phục vụ trình điều trị Trường Đại học Y Hà Nội tiên lượng cho người bệnh Tuy nhiên, phân Email: nguyenha1994.hmu@gmail.com loại phức tạp mycobacteria với 200 loài Ngày nhận: 21/07/2022 lồi, với liên quan chặt Ngày chấp nhận: 26/08/2022 chẽ mặt di truyền loài, TCNCYH 157 (9) - 2022 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phân tích trình tự đoạn gen đích khơng đủ để định danh đến lồi NTM chưa có chiến lược cụ thể tối ưu việc giải trình tự nhiều gen house-keeping (thường gọi gen giữ nhà), phương pháp phân tích đồng thời trình tự gen 16S rRNA, gyrB, rpoB, hsp65, ITS áp dụng thường xuyên Do vậy, nhằm phân biệt MTBC NTM nhóm chủng mycobacteria âm tính II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng: 105 chủng Mycobacterium nuôi cấy MGIT dương tính có TBc ID âm tính phân lập Bệnh viện Phổi Trung ương từ tháng 8/2019 đến tháng 8/2020 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang Tiêu chuẩn lựa chọn: Các chủng với thử nghiệm TBc ID, với xác định Mycobacterium có ni cấy MGIT dương tính, tỉ lệ loài thuộc MTBC (lây truyền từ người nhuộm soi cặn có AFB làm thử nghiệm TBc sang người, từ động vật sang người) ID âm tính tỷ lệ lồi NTM Việt Nam, Tiêu chuẩn loại trừ: Các chủng phân lập từ tiến hành nghiên cứu "Định danh đến loài một bệnh nhân, chủng từ bệnh nhân số chủng mycobacteria phương pháp giải nghi NTM cấy mẫu bệnh phẩm đờm trình tự gen" với mục tiêu: Định danh đến Kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Quy loài chủng Mycobacterium ni cấy MGIT trình tách chiết DNA sử dụng kít LytestarTM dương tính có TBc ID âm nghi ngờ MTBC; TB/NTM PCR kit 3.0 (CE-IVD) Phản ứng PCR Định danh đến loài chủng Mycobacterium thực kit BioFACTTM H-Star ni cấy MGIT dương tính nghi ngờ NTM Taq DNA Polymerase (BioFACT) Bảng Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Gen đích Trình tự mồi 16S rRNA 5’GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG 16S rRNA 5’TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA ITS 5’GAT TGG GAC GAA GTC GTA AC ITS 5’AGC CTC CCA CGT CCT TCA TC hsp65 5’ACCAACGATGGTGTGTCCAT hsp65 5’CTCGTCGAACCGCATACCCT gyrB 5’TCG GAC GCG TAT GCG ATA TC gyrB 5’ACA TAC AGT TCG GAC TTG CG rpoB 5’GGCAAGGTCACCCCGAAGGG rpoB 5’AGCGGCTGCTGGGTGATCATC Giải trình tự phương pháp Sanger với kit BigDye® Terminatorv3.1 máy ABI 3500 Genetic Analyzer Quy trình giải trình tự thực Viện Cơng nghệ Sinh học trực 18 Kích thước Ta ~ 1000bp3 68 ~ 400bp4 57 441bp5 60 1020bp6 72 723bp7 64 thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Sử dụng phần mềm BioEdit so sánh với sở liệu GenBank Xử lý phân tích số liệu phần mềm TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC SPSS 20, thuật tốn tính so sánh tỉ lệ Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu cho phép Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Trung ương Nghiên cứu tiến hành chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân, không can thiệp hay tác động đến người bệnh Đảm bảo thơng tin cá nhân bệnh nhân giữ bí mật, thông tin hồ sơ phục vụ mục đích nghiên cứu III KẾT QUẢ Hình Ví dụ đoạn trình tự kết BLAST GenBank Trong 105 chủng (Hình 2) có 56 chủng (53,3%) MTBC 49 chủng NTM (46,7%) Định danh đến lồi phát 2/12 lồi nằm nhóm MTBC 15/ >200 lồi nằm nhóm NTM Đối với MTBC, số 56 chủng có 55 chủng (98,2%) M tuberculosis thuộc nhóm lây truyền từ người sang người, chủng (1,8%) M bovis thuộc nhóm lây truyền từ động vật sang người Đối với NTM, số 49 chủng phân lập có 30 chủng (61,2%) thuộc nhóm mycobacteria phát triển nhanh (RGM) 19 chủng (38,8%) thuộc nhóm danh đến lồi cho thấy phức hợp M abscessus/ mycobacteria phát triển chậm (SGM) Định lại (55,1%) khơng có bệnh liên quan đến NTM TCNCYH 157 (9) - 2022 M chelonae có tần suất xuất cao với 27 chủng (55,1%), tiếp đến phức hợp MAC với chủng (16,3%) Các loài khác phân lập với tỉ lệ nhỏ Khi xem xét mối liên quan với bệnh gây NTM 49 chủng phân lập 49 bệnh nhân khác Trong số bệnh nhân có 19 người (38,8%) chẩn đoán mắc bệnh phổi NTM (NTM PD) theo tiêu chuẩn ATS 2007 người (6,1%) mắc bệnh da, niêm mạc NTM, 27 người cịn 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC M bovis 1,8% NTM 46,7% MTBC 53,3% SGM 38,8% RGM 61,2% M.tuberculosis 98,2% NTM PD 38,8% Khác 55,1% Da, mơ mềm 6,1% Hình Tỉ lệ nhóm lồi phân lập Bảng Các loài NTM phân lập Tên loài/ phức hợp Gây bệnh Tổng M abscessus/ M chelonae 10 (46,0%) 27 (55,2%) MAC (22,5%) (16,4%) M angelicum (0%) (2,0%) M farcinogenes (0%) (2,0%) M fortuitum (0%) (4,1%) M interjectrum (4,5%) (4,1%) M kansasii (13,5%) (6,1%) M marinum (4,5%) (2,0%) M mucogenicum (0%) (2,0%) M scrofulaceum (4,5%) (4,1%) M stomatopiae (4,5%) (2,0%) 22 (100%) 49 (100%) Tổng Định danh đến loài cho thấy phức hợp M abscessus/ M chelonae có tần suất xuất cao với 27 chủng (55,1%), tiếp đến phức hợp MAC với chủng (16,3%) Các loài khác phân lập với tỉ lệ nhỏ 20 TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong số 22 bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến NTM, số người nhiễm phức hợp M abscessus/ M chelonae chiếm tỉ lệ cao với 10 bệnh nhân (46%), đứng thứ hai người (22,5%) nhiễm phức hợp MAC, đứng thứ ba M kansasii với người (13,5%), loài khác chiếm tỉ lệ nhỏ Hình So sánh trình tự đoạn gyrB loài M tuberculosis M bovis (Dịng trình tự M tuberculosis, dịng trình tự M bovis, dấu "." thể Nu giống Trình tự đoạn gyrB lồi có khác biệt nhỏ, ví dụ: vị trí 142 M bovis thay G A) TCNCYH 157 (9) - 2022 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình So sánh trình tự đoạn rpoB M.a.massiliense M.a.abscessus IV BÀN LUẬN Phức hợp MTBC bao gồm 12 thành viên M tuberculosis, M bovis, M bovis BCG, M africanum, M caprae, M pinnipedii, M microti, M canettii, M mungi, M orygis, M dassie chimpanzee bacillus, loài M tuberculosis M africanum gây bệnh bắt buộc người, loài khác gây bệnh động vật có khả lây cho người Trong nghiên cứu này, quan sát thấy 56 chủng MTBC 105 chủng có TBc ID âm tính Khi định danh đến lồi, đa số chủng (55 chủng) thuộc M tuberculosis 22 chủng thuộc M bovis Như vậy, chủng MTBC âm tính với TBc ID khơng thuộc lồi nằm hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Khi chủng có TBc ID âm tính chủ yếu M tuberculosis nguyên nhân chủ yếu nghĩ đến trường hợp M tuberculosis bị đoạn đột biến gen mpb64 dẫn đến không phát MPT64 chủng Ngoài tỷ lệ nhỏ trường hợp âm tính giả khác nồng độ thấp MPT64 ống MGIT báo dương sớm MTBC bị lấn át vi khuẩn khác ống MGIT TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bội nhiễm Đối với chủng cần tiến hành định danh thêm phương pháp khác thử nghiệm niacin GeneXpert Việc phát chủng MTBC (M bovis) gây bệnh lao lây truyền từ động vật sang người có ý nghĩa điều trị phịng bệnh M bovis đề kháng tự nhiên với pyrazinamide việc quản lý đàn gia súc sản phẩm từ gia súc biện pháp có ý nghĩa so với cách ly bệnh nhân Như vậy, việc sử dụng đơn độc phương pháp định danh TBc ID dẫn đến nhóm lồi này, cao liệu Đặng Thị Nguyên (2018) tỉ lệ M abscessus/ M chelonae 36,6%.8 Khi so sánh tỷ lệ phức hợp M abscessus/ M chelonae khu vực khác nhau, chúng tơi thấy có tương tự với khu vực lưu hành phổ biến lao khu vực miền nam Đài Loan hay khu vực bang Para Bra-xin Nghiên cứu Simons năm 2011 gợi ý mối liên quan NTM PD với tiền sử lao phổi cũ nhiên cần thêm nhiều chứng để kết luận.9 Cũng thuộc khả bỏ sót số chủng MTBC, cần có chiến lược định danh phối hợp với phương pháp khác chủng có TBc ID âm tính Các phương pháp sinh học phân tử nên ưu tiên phương pháp xác định tính chất sinh vật hóa học cổ điển nhờ ưu vào thời gian quay vòng nhanh độ nhạy, độ đặc hiệu cao Đối với NTM, 49 chủng NTM có 30 chủng (61,2%) RGM 19 chủng (38,8%) SGM Tỉ lệ lồi SGM RGM có khác biệt đáng kể với khu vực châu Âu châu Mỹ mà nghiên cứu khu vực cho thấy tỉ lệ RGM tương đối thấp Các nghiên cứu khu vực Đông Á quan sát thấy tỉ lệ RGM cao nhiên lại có khác biệt lớn quốc gia khác nhau, việc so sánh tỉ lệ RGM khó khăn Nguyên nhân dẫn đến việc gia tăng tỉ lệ loài RGM gia tăng khu vực châu Á nói chung Việt Nam nói riêng chưa làm sáng tỏ, nhiên số nghiên cứu gợi ý khác biệt khí hậu, vật chủ (con người) lực phòng xét nghiệm khu vực Định danh đến loài chủng NTM cho thấy tỷ lệ phức hợp M abscessus/ M chelonae thuộc nhóm RGM đứng hàng đầu với 27 chủng (55,2%) Tỷ lệ cao nhiều so với liệu thu từ nghiên cứu khu vực Đông Á, nơi coi phổ biến phân lập RGM, nhóm M fortuitum thường có độ phổ biến cao nhiều quốc gia khu vực lại chiếm tỷ lệ tương đối thấp nghiên cứu (4,1%), lý giải nhóm M fortuitum thường gây bệnh da, mô mềm chủ yếu đối tượng đưa vào chủ yếu nhóm bệnh nhân có triệu chứng đường hơ hấp Nhóm M mucogenicum chiếm tỷ lệ nhỏ thành viên nhóm RGM quan trọng nhóm M smegmatis, nhóm RGM sinh sắc tố sớm nhóm M megeritense/ M wolinskyi khơng quan sát thấy chủng Có lẽ cỡ mẫu nghiên cứu cịn nhỏ nên nhóm phổ biến lồi RGM khơng thấy xuất Đối với nhóm SGM, phức hợp MAC (16,4%) lồi phổ biến nhất, tương đương với kết thu nghiên cứu Đặng Thị Nguyên (15,9%).8 Ở quốc gia khu vực khác, độ phổ biến MAC rộng rãi nhiều so với kết Xét riêng nhóm SGM, phức hợp MAC đóng vai trò quan trọng Các nghiên cứu phức hợp MAC thường có liên quan đến bệnh suy giảm miễn dich (HIV/ AIDS) mà đối tượng nghiên cứu này, nguyên nhân dẫn đến khác biệt Ngoài ra, M kansasii đứng thứ sáu tần suất phân lập giới, đặc trưng khả gây bệnh cao có tỉ lệ 6,1% nghiên cứu Đặc TCNCYH 157 (9) - 2022 23 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biệt chúng tơi quan sát trường hợp phân lập M marinum bệnh nhân có nhiễm trùng khớp M marinum thường biết đến nguyên nhân gây nhiễm trùng da vết xây xước tiếp xúc với nguồn nước mặn, nguyên phổ biến nước ta với đường bờ biển dài Các loài NTM gặp M angelicum, M farciogenes, M interjectrum, M scrofulacum, M stomatopiae chiếm tỉ lệ nhỏ Các lồi SGM có mức độ phổ biến cao giới M malmoense, M xenopi M simiae lại khơng tìm thấy nghiên cứu Ngun nhân cho M xenopi (ưa sống 42oC) thường liên quan đến hệ thống cung cấp nước nóng phát triển nước châu Âu châu Mỹ Việt Nam Nhiều nghiên cứu châu Á cho thấy vắng mặt M simiae khu vực Đối với M malmoense khơng tìm thấy thật M malmoense khơng phân bố Việt Nam, nguyên nhân khác nghĩ đến giảm khả phát thời gian nuôi cấy cần kéo dài - 12 tuần thay tuần quy trình thường thấy nước ta Khơng giống chẩn đốn lao, chẩn đoán bệnh NTM cần kết hợp nhiều yếu tố để đưa đến chẩn đốn xác định, tiêu chuẩn ATS/IDSA đưa năm 2007 sử dụng rộng rãi Trên 49 bệnh phân có NTM phân lập từ bệnh phẩm, có 19 bệnh nhân chẩn đốn mắc bệnh phổi NTM, bệnh nhân có bệnh da, niêm mạc, mô mềm liên quan đến NTM 27 bệnh nhân có bệnh khơng liên quan đến NTM chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh NTM Hầu hết nghiên cứu mối liên quan bệnh lý mãn tính cấu trúc phổi bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, giãn phế quản, bệnh thiếu alpha-1 antitrypsin, bệnh bụi phổi, bệnh xơ nang phổi với NTM PD Tuy nhiên, hạn chế việc 24 thu thập thông tin dẫn đến số liệu tiền sử bệnh tật bệnh nhân không đầy đủ nên đưa kết luận Việc định danh đến loài NTM tính đề kháng kháng sinh chúng đóng vai trị quan trọng việc điều trị quản lý bệnh nhân NTM PD V KẾT LUẬN Trong 105 chủng mycobacteria không phát thấy kháng nguyên MPT64 môi trường ni cấy, có 53,3% chủng thuộc MTBC 46,7% thuộc NTM Trong chủng MTBC phát 2/12 loài, chiếm 98,2% loài M tuberculosis 1,8% lồi M bovis Trong chủng NTM, có 15/ > 200 loài xuất hiện, phức hợp M abscessus/ M.chelonae chiếm đa số với 55,2%, đứng thứ hai phức hợp MAC với 16,4%, loài phức hợp khác chiếm tỷ lệ nhỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO Brent AJ, Mugo D, Musyimi R, et al Performance of the MGIT TBc identification test and meta-analysis of MPT64 assays for identification of the Mycobacterium tuberculosis Complex in liquid culture J Clin Microbiol 2011;49(12):4343-4346 doi: 10.1128/JCM.059 95-11 British Thoracic Society guidelines for the management of Non-Tuberculous Mycobacterial Pulmonary Disease (NTM-PD) Published online 2017 Kirschner P, Springer B, Vogel U, et al Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination: Report of a 2-year experience in a clinical laboratory J Clin Microbiol 1993;31(11):2882-2889 doi: 10.1128/JCM.31.11.2882-2889.1993 Richter E, Niemann S, Rüsch-Gerdes S, Hoffner S Identification of Mycobacterium kansasii by using a DNA probe (AccuProbe) and molecular techniques J Clin Microbiol TCNCYH 157 (9) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 1999;37(4):964-970 doi: 10.1128/JCM.37.4.96 late-pigmenting rapidly growing mycobacteria 4-970.1999 J Clin Microbiol 2003;41(12):5699-5708 doi: 10.1128/jcm.41.12.5699-5708.2003 Đặng Thị Nguyên, Nguyễn Thị Hằng, Đặng Thị Ngọc Hà, Trần Duy Hưng, Nguyễn Văn Khiêm, Nguyễn Văn Hưng Định danh xác định tần số chủng mycobacteria không lao (Non-Tuberculous Mycobacteria NTM) thu thập Bệnh viện Phổi Trung ương, Việt Nam Published online 2018 Simons S, van Ingen J, Hsueh PR, et al Nontuberculous mycobacteria in respiratory tract infections, Eastern Asia Emerg Infect Dis 2011;17(3):343-349 doi: 10.3201/eid1703 100604 Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bottger EC, Bodmer T Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis J Clin Microbiol 1993;31(2):175-178 doi: 10.11 28/JCM.31.2.175-178.1993 Kasai H, Ezaki T, Harayama S Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria by their gyrB sequences J Clin Microbiol 2000;38(1):301-308 Adékambi T, Colson P, Drancourt M rpoB-based identification of nonpigmented and Summary IDENTIFICATION VARIOUS MYCOBACTERIA STRAINS TO THE SPECIES LEVEL BY GENE SEQUENCING Despite the close genetic relatedness, members of the genus Mycobacterium differ significantly in morphology, biochemistry, host range and pathogenicity TBc ID (Becton Dickinson, Sparks, MD) is a rapid and reliable method for MTBC identification in liquid culture assay, however a small minority of MTBC isolates are not detected by TBc ID assay due to none to low concentration of MPT64 in liquid culture; moreover, TBc ID cannot distinguish mycobacteria to species Identification of mycobacteria isolates to the species level by analysis of several target genes (including 16S rRNA, gyrB, rpoB, hsp65 and ITS) could overcome these disadvantages and accurately differentiate some less common NTM Overall, there are 105 TBc ID negative strains, including 56 MTBC strains (53.3%) and 49 NTM strains (46.7%) Looking closely to species level identification of all 56 MTBC strains, M tuberculosis took an important part and solely M bovis strain was detected Within 49 NTM strains, the predominant is M abscessus/ M chelonae complex, the second in common is MAC and the other 13 NTM species are in smaller portions Keywords: Mycobacteria, TBc ID, sequencing TCNCYH 157 (9) - 2022 25 ... HỌC phân tích trình tự đoạn gen đích khơng đủ để định danh đến lồi NTM chưa có chiến lược cụ thể tối ưu việc giải trình tự nhiều gen house-keeping (thường gọi gen giữ nhà), phương pháp phân tích... số chủng mycobacteria phương pháp giải nghi NTM cấy mẫu bệnh phẩm đờm trình tự gen" với mục tiêu: Định danh đến Kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: Quy lồi chủng Mycobacterium ni cấy MGIT trình tách... thuộc khả bỏ sót số chủng MTBC, cần có chiến lược định danh phối hợp với phương pháp khác chủng có TBc ID âm tính Các phương pháp sinh học phân tử nên ưu tiên phương pháp xác định tính chất sinh