Những kết luận mới của luận án: 1. Căn nguyên và đặc tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây viêm phổi liên quan thở máy Căn nguyên gây viêm phổi liên quan thở máy gặp phổ biến là các vi khuẩn Gram âm, trong đó hàng đầu là A. baumanii, K. pneumonia và P. aeruginosa. Trong các vi khuẩn Gram dương, căn nguyên gặp nhiều nhất là S. aureus và cũng là căn nguyên thường gặp thứ 4. Ghi nhận sự đề kháng cao của các vi khuẩn với kháng sinh: > 80% các chủng A. baumanii, K. pneumoniae, P. aeruginosa đã kháng với gần như tất cả kháng sinh được thử, trừ colistin. 2. Kết quả điều trị bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy Tỷ lệ bệnh nhân tử vong hoặc xin về để tử vong là 36,18%. Thời gian nằm viện tương đối dài, trung bình là 28,0 ± 18,0 ngày. Điều trị kháng sinh ban đầu phù hợp ở 41,18% nhóm tử vong và 70,00% nhóm sống nhưng khác biệt giữa 2 nhóm không có ý nghĩa thống kê. 3. Xác định nguồn lây truyền của các vi khuẩn đa kháng thuốc bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới Xác định được một số Sequence Types (STs) nổi trội, đặc trưng riêng tại địa điểm nghiên cứu: ST2 (48%), ST571 (24%) của A. baumannii; ST15 (34%), ST16 (30%) của K. pneumoniae. Ghi nhận sự xuất hiện thường xuyên và các cụm lây truyền quy mô lớn, hầu hết có liên quan đến mẫu môi trường của A. baumannii (39 cụm lây truyền, liên quan từ 2 đến 22 chủng) và K. pneumoniae (37 cụm lây truyền, liên quan từ 2 đến 53 chủng). Tuy nhiên, E. coli chỉ xuất hiện ít và lây truyền hạn chế (11 cụm, liên quan từ 2 đến 6 chủng).
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THỊ HẢI NINH NGHIÊN CỨU CĂN NGUYÊN, KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ VÀ XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN CỦA CÁC VI KHUẨN ĐA KHÁNG THUỐC GÂY VIÊM PHỔI LIÊN QUAN ĐẾN THỞ MÁY BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HÀ NỘI HỌC Y TRẦN THỊ HẢI NINH NGHIÊN CỨU CĂN NGUYÊN, KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ VÀ XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN CỦA CÁC VI KHUẨN ĐA KHÁNG THUỐC GÂY VIÊM PHỔI LIÊN QUAN ĐẾN THỞ MÁY BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI Chuyên ngành: Truyền nhiễm bệnh nhiệt đới Mã số: 62720153 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYỄN VĂN KÍNH PGS.TS NGUYỄN VŨ TRUNG HÀ NỘI - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Thị Hải Ninh, nghiên cứu sinh khóa 35, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Truyền Nhiễm bệnh nhiệt đới, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Nguyễn Văn Kính PGS.TS Nguyễn Vũ Trung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Số liệu luận án phần số liệu Đề tài nghiên cứu mã số HNQT/SPĐP/04.16 thuộc chương trình “Hợp tác nghiên cứu song phương đa phương khoa học công nghệ đến năm 2020” Bộ Khoa học Công nghệ, bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương quan chủ trì đề tài Tơi chủ nhiệm đề tài quan chủ trì đề tài đồng ý cho phép sử dụng phần số liệu đề tài vào luận án tiến sỹ Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 04 tháng 01 năm 2022 Người viết cam đoan Trần Thị Hải Ninh LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập làm luận án, nhận quan tâm, giúp đỡ nhiều nhà trường, Bệnh viện, gia đình bạn bè đồng nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn: Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học - Trường Đại học Y Hà Nội Ban giám đốc, khoa Nội tổng hợp, phịng Kế hoạch tổng hợp, tồn thể cán nhân viên Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Bộ môn Truyền nhiễm - Trường Đại học Y Hà Nội Khoa Y, trường ĐH Cambridge; Viện nghiên cứu Sanger – Vương quốc Anh; Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Trường Đại học Oxford Hà Nội (OUCRU); Hội đồng nghiên cứu y học – Vương quốc Anh; Đại sư quán Anh Việt Nam Văn phòng chương trình Khoa học Cơng nghệ Quốc gia, Bộ Khoa học công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Nguyễn Văn Kính, Chủ tịch Hội Truyền nhiễm Việt Nam, Nguyên Giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Truyền Nhiễm - Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy hết lịng giúp đỡ, ln tạo điều kiện tốt cho tơi học tập tận tình bảo, hướng dẫn tơi hồn thành luận án PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, Phó Cục trưởng Cục Khoa học cơng nghệ đào tạo – Bộ Y tế, Chủ nhiệm Bộ mơn Vi sinh – Kí sinh trùng - Trường Đại học Y Hà Nội, Nguyên Phó Giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, người Thầy dìu dắt, dạy dỗ, bảo tơi suốt q trình học tập tạo điều kiện, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Ban giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương toàn thể bác sĩ, điều dưỡng, viên chức khoa, phòng dành cho tơi nhiều tình cảm nhiệt tình giúp đỡ, bảo tơi suốt q trình học tập, làm việc hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Hội đồng khoa học chấm đề cương đóng góp ý kiến quý báu để hoàn thành luận án Và cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới cha mẹ, chồng con, anh chị em gia đình bạn bè động viên, khích lệ, cổ vũ cho tơi mặt tinh thần để tơi hồn tất khóa học này, tạo điều kiện cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà nội, ngày 04 tháng 01 năm 2022 Trần Thị Hải Ninh DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AST : The American Thoracic Society : Hiệp hội Lồng ngực Hoa Kỳ ARDS : Acute Respiratory Distress Syndrome Hội chứng suy hô hấp cấp tiến triển BN : Bệnh nhân BV : Bệnh viện CDC : Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CI : Confidence Interval Khoảng tin cậy CLSI : The Clinical and Laboratory Standards Institute Viện Tiêu chuẩn xét nghiệm lâm sàng COPD : Chronic obstructive pulmonary disease Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính CRO : Carbapenem-resistant Organism Vi khuẩn kháng carbapenem ESBL : Extended-Spectrum Beta-Lactamase Men beta-lactamase phổ rộng ESBL-PE : Extended-Spectrum Beta-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae sinh men beta-lactamase phổ rộng EUCAST : The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Ủy ban Châu Âu thử độ nhạy cảm kháng sinh HIC : High-income country Nước có thu nhập cao HSTC : Hồi sức tích cực ICU : Intensive Care Unit Đơn vị điều trị tích cực KKS : Kháng kháng sinh LMIC : Lower-middle-income country Nước có thu nhập trung bình – thấp MDR : Multidrug resistance Đa kháng thuốc MLST : Multi-locus sequence typing Chuỗi đa locus MRSA : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Tụ cầu kháng Methicillin NGS : Next Generation Sequencing Giải trình tự gen hệ NKBV : Nhiễm khuẩn bệnh viện NKQ : Nội khí quản PDR : Pandrug resistance Toàn kháng thuốc PFGE : Pulsed field gel electrophoresis Điện di xung điện trường SBS : Sequencing by Synthesis Sắp xếp theo tổng hợp SMRT : Single molecule real-time sequencing Giải trình tự gen tức thời đơn phân tử SNVs : Single nucleotide variants Nucleotide đơn lẻ khác biệt UMIC : Upper-middle-income country Nước có thu nhập trung bình – cao VAE : Ventilator-Associated Events Biến cố liên quan đến thở máy VPBV : Viêm phổi bệnh viện VPLQTM : Viêm phổi liên quan đến thở máy VRE : Vancomycin Resistant Enterococci Enterococci kháng Vancomycin WGS : Whole Genome Sequencing Giải trình tự gen tồn XDR : Extensive drug resistance Siêu kháng thuốc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương viêm phổi liên quan thở máy 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Tình hình viêm phổi liên quan thở máy giới 1.1.3 Tình hình viêm phổi liên quan thở máy Việt Nam 1.2 Căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi liên quan thở máy 1.2.1 Phân bố nguyên theo khu vực địa lý mức thu nhập quốc gia 1.2.2 Phân bố nguyên theo đặc điểm nhóm bệnh nhân 10 1.2.3 Phân bố nguyên theo thời điểm mắc viêm phổi liên quan thở máy 11 1.2.4 Căn nguyên viêm phổi liên quan thở máy Việt Nam 12 1.2.5 Đặc điểm kháng kháng sinh số vi khuẩn thường gặp gây viêm phổi liên quan thở máy 13 1.3 Kết điều trị bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy 18 1.3.1 Thời gian nằm viện bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy 18 1.3.2 Điều trị kháng sinh bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy 19 1.3.3 Tình hình tử vong bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy 21 1.3.4 Yếu tố tiên lượng tử vong bệnh nhân viêm phổi liên quan thở máy 22 1.4 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ nghiên cứu nguồn lây truyền vi khuẩn bệnh viện 23 1.4.1 Đại cương kỹ thuật giải trình tự gen hệ 23 1.4.2 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ xác định đường lây truyền vi khuẩn bệnh viện 27 1.5 Giới thiệu khái quát địa điểm nghiên cứu 32 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 34 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 37 2.2.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 37 2.2.3 Qui trình nghiên cứu 38 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 42 2.3.1 Thời gian nghiên cứu 42 2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 43 2.4 Nội dung nghiên cứu 43 2.4.1 Mục tiêu – Xác định nguyên đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn gây viêm phổi liên quan thở máy khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Bệnh Nhiệt đới trung ương 43 2.4.2 Mục tiêu – Đánh giá kết điều trị BN viêm phổi liên quan thở máy khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Bệnh Nhiệt đới trung ương 44 2.4.3 Mục tiêu – Xác định nguồn lây truyền vi khuẩn đa kháng thuốc gây viêm phổi liên quan thở máy kỹ thuật giải trình tự gen hệ 45 2.5 Các tiêu chuẩn, kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 45 2.5.1 Các khái niệm sử dụng nghiên cứu 45 2.5.2 Thang điểm Rankin sửa đổi (Modified Rankin Sacle, MRS) 47 2.5.3 Bảng điểm APACHE II 47 2.5.4 Bảng điểm đánh giá nhanh tình trạng suy đa tạng (qSOFA) 49 2.5.5 Các số đánh giá biến đổi cận lâm sàng bệnh nhân 49 Thêm 200 µl ethanol 80% vào ống Để 30 giây Cẩn thận loại bỏ dịch - Giữ nguyên plate giá từ, lặp lại bước rửa lần sau: Thêm 200 µl ethanol 80% vào ống Để 30 giây Cẩn thận loại bỏ dịch - Giữ nguyên plate giá từ, để khô tự nhiên 15 phút - Nhấc plate khỏi giá từ - Dùng pipet thêm 52,5 µl RSB (Resuspension Buffer) vào ống mẫu, hút nhả pipet 10 lần, thay đầu côn lần, nhằm DNA khỏi hat bead - Để nhiệt độ phòng phút, đảm bảo DNA hết khỏi bead - Đặt ống lên giá từ phút, để lực từ hút hết hạt bead xuống dưới, lúc phần dịch phần có chứa DNA - Ký hiệu plate mới - Dùng pipet, cẩn thận chuyển 50 µl dịch từ plate cũ sang plate mới, thay đầu côn sau lần thao tác Bước 2.4 Chuẩ n hóa mẫu, đinh ̣ lượng thư viê ̣n Chuẩ n bi ̣ hóa chấ t: LNA1 (LibraryNormalization Additives 1), LNB1 (Library Normalization Beads 1), LNW1 (Library Normalization Wash 1), LNS1 (Library Normalization Storage Buffer 1), 0,1 N NaOH, ghiếng 96 lỗ: ghiếng, Ống tube 15 ml: ố ng Đo nồ ng đô ̣ DNA bằ ng Qubit (hoặc hóa chất tương đương) - Sử dụng: máy Qubit, ống đo chuyên dụng kit: dsDNA HS Assay - Pha hóa chất Qubit Working Solution theo tỷ lệ ul QuBit reagent: 199 ul QuBit Buffer - Pha hỗn hợp dung dịch đo nồng độ DNA ống đo chuyên dụng theo bước sau: - Standard : 10 ul standard 190 ul Qubit working solution - Mẫu cần đo nồng độ DNA: ul mẫu 198 ul Qubit working solution - Đưa standard mẫu vào máy Qubit đo nồng độ DNA - Tính toán nồ ng đô ̣ của DNA sang nM dựa kích thước DNA theo công thức sau: (nồng độ ng/l) (660 g/mol x kích thước thư viện trung bình) x 106 = nồng độ nM Quy trin ̀ h chuẩ n hóa mẫ u: - Rã đông ống LNA1 (Library Normalization Additives 1) đến nhiệt độ phòng, cách ngâm bể nước có nhiệt độ 20° đến 25°C - Làm ấm ống LNB1 (Library Normalization Beads 1) LNW1 (Library Normalization Wash 1) nhiệt độ phòng, ngâm bể nước có nhiệt độ 20° đến 25°C - Voltex LNB1 phút đảo nghịch liên tục khoảng 15-20 lần - Làm ấm ống LNS1 (Library Normalization Storage Buffer 1) nhiệt độ phòng trước sử dụng - Đánh dấu plate 96 sa ̣ch - Cẩn thận chuyển 20 ul dịch từ sản phẩ m PCR tinh sa ̣ch, thay đầu côn sau lần thao tác - Hút 1,1 ml LNA1 (hóa chất xúc tác DNA bám vào hat bead) vào ống Ephendorf 1.5 ml - Dùng pipet P1000, hút nhả pipet ống LNB1 20 lần để trộn bead - Hút 200 ul LNB1 vào ống Ephendorf chứa sẵn LNA1, trộn cách đảo ngược ống 20 lần - Hút 45 ul hỗn hợp LNA1/LNB1 vào ống LNP chứa sẵn mẫu - Đóng chặt nắp ống LNP lắc ống LNP vận tốc 1.800 rpm 30 phút để đảm bảo sợi DNA bám vào hạt bead với mật độ - Để ống giá từ phút để lực từ hút hạt bead có gắn DNA xuống đáy ống - Giữ nguyên ống LNP giá từ, vặn pipet đến 80ul, loại bỏ dịch - Nhấc ống LNP khỏi giá từ tiến hành bước rửa với LNW1 sau: Thêm 45 ul LNW1 ống Đóng chặt nắp ống Lắc với vận tốc 1.800 rpm phút Đặt ống gía từ phút Cẩn thận loại bỏ dịch nổi, thay đầu côn sau lần thao tác Nhấc ống LNP khỏi giá từ tiến hành bước rửa lần với LNW1: Thêm 45 ul LNW1 ống Đóng chặt nắp ống Lắc với vận tốc 1.800 rpm phút Đặt ống gía từ phút Cẩn thận loại bỏ dịch nổi, thay đầu côn sau lần thao tác Nhấc ống LNP khỏi giá từ, thêm 30ul NaOH 0,1N vào ống Đóng chặt nắp lắc ống LNP vận tốc 1.800 rpm phút để đảm bảo DNA bị hết khỏi hạt bead Trong lắc, chuẩn bị ống SGP (StoraGe Plate) (là ống PCR) Cho 30 ul hóa chất bảo quản DNA LNS1 vào ống SGP Sau phút lắc, kiểm tra, đảm bảo tất mẫu LNP trộn hồn tồn Nếu thấy mẫu khơng trộn hoàn toàn, nhẹ nhàng hút nhả pipet đến lần, lắc thêm phút Đặt ống LNP giá từ phút để hút toàn hạt bead xuống đáy Thiết lập pipet đến 30 ul, chuyển dịch chứa DNA từ ống LNP sang ống SGP, thay đầu côn sau lần thao tác Đậy chặt nắp ống, ly tâm 1.000 xg phút Bước 2.5 Đưa mẫu vào máy Miseq Chuẩ n bi:̣ o - Điề u chin ̉ h Block nhiê ̣t cho ố ng 1.5ml ở 96 C - Rã đông hóa chấ t Miseq Reagent để ở nhiê ̣t đô ̣ phòng - Water ice - HT1 - Resuspension Buffer Quy trin ̀ h: - Nế u ố ng SGP đã đươ ̣c bảo quản đông la ̣nh, làm ấ m các ố ng SGP đế n nhiê ̣t đô ̣ phòng, hút nhả 3-5 lầ n các ố ng SGP để trô ̣n đề u DNA - Ly tâm ố ng SGP ta ̣i 1000xg vòng phút ở 20oC đảm bảo DNA tâ ̣p trung ở phầ n dung dich ̣ đáy ố ng - Ký hiê ̣u ố ng PAL (Pool Amplicon Library) - Chuyể n 12 ul của mỗ i mẫu ố ng SGP sang ố ng PAL - Ký hiê ̣u ố ng DAL mới (Dilluted Amplicon Library) - Thêm 588 ul hóa chấ t hỗ trơ ̣ các sơ ̣i DNA bám vào flowcell HT1 vào ố ng DAl - Chuyể n 24 ul hỗ n hơp̣ DNA từ Pal sang DAl có chứa HT1 Sử du ̣ng cùng đầ u côn mix đề u 3-5 lầ n - Vortex ố ng DAL với tố c đô ̣ cao nhấ t - Đưa ố ng DAL vào block nhiê ̣t ở 96 oC, ủ phút để đảm bảo các sơ ̣i đơn DNA biế n tin ́ h hoàn toàn thành ma ̣ch đơn DNA - Sau ủ, đảo nghich ̣ ố ng DAL 1-2 lầ n để pha trô ̣n và đă ̣t vào box nước đã lâ ̣p tức vòng phút - Đưa toàn bô ̣ hỗ n hơ ̣p hô ̣p DAl vào khay Miseq Reagent Cartridge theo vi tri ̣ ́ load Samples khay - Thao tác chạy máy theo hướng dẫn hãng Illumina Dữ liệu trình tự gen vi khuẩn đa kháng thuốc phân tích phần mềm CLC workbench QIAgen kết hợp với phần mềm cung cấp, cài đặt tích hợp Viện Nghiên cứu Sanger Bước 2.6 Các bước để xác định trình tự gen vi khuẩn: - Sau hệ thống Miseq hoàn thành chương trình chạy giải trình tự, số lần chạy cần lưu ý để đánh giá thành cơng lần chạy Với hóa chất giải trình tự Miseq reagent kit V3 600cycles, liệu giải trình tự tối đa nhận vào khoảng 14.5 đến 15 Gb Mật độ cluster hình thành flowcell khuyến cáo nên nằm khoảng từ 800 đến 1200K/mm2 Trên 90% phần trăm đoạn đọc có chất lượng giải trình tự lớn Q30 (Phred quality scores of ≥30), nghĩa 99.9% trình tự nucleotide đọc cách xác - Coverage ≥ 100 lần sử dụng để phân tích - Q trình phân tích liệu thực sử dụng phần mềm Miseq reporter cặt đặt sẵn hệ thống Miseq phần mềm CLC genomics Workbench (Qiagen) Đối với chế độ “Resequencing”- giải trình tự lại, đoạn đọc (sequencing reads) phần mềm Miseq reporter tự động trình tự so sánh với trình tự tham khảo (reference sequence) nhập trước Các đoạn được trình tự mẫu chứa file đuôi bam (.bam file) Các file đuôi bam tải vào phần mềm CLC Genomics Workbench để phân tích vào tạo trình tự hồn chỉnh (consensus sequence) Bên cạnh thơng tin điểm sai khác (variants) ghi nhận trình trình tự đoạn đọc với trình tự tham khác chứa file định dạng vcf Các bước phân tích số liệu sử dụng CLC Genomics Workbench (QIAgen) sau: Bước 1: Làm liệu: loại bỏ phần liệu bị nhiễu, tín hiệu xấu; loại đoạn gap (đoạn trống) Bước 2: Xuất files (dạng Mers Not Mers) Bước 3: Lắp ráp trình tự gen sử dụng phần mềm denovo assembly sequencing remappinghoặc reference- based mapping tool để lắp ráp trình tự gen Denovo sequencing: xác định biến dị (variant calling) để tạo thành file VCF sử dụng GATK Samtools Reference- based mapping tool: - Ghép đoạn short read thành contig so sánh với reference genome công bố - Ngưỡng lựa chọn (cut off value)là đoạn đọc phải lặp lại 100 lần hay gọi coverage ≥ 100 lần - Xuất consensus trình tự gen hồn chỉnh chủng vi khuẩn giải trình tự Bước 4: Lập file BAM, xây dựng contig, scaffold sử dụng công cụ bwa, trinity, bcftools Bước 5: Thống kê đánh giá chất lượng lắp ráp: số lượng độ dài contig, tổng độ dài contig, độ dài contig lớnnhất, tỉ lệ GC, N50… phần mềm Quast phần mềm khác Bước 6: Xây dựng trình tự gen hoàn chỉnh chủng vi khuẩn giải trình tự DANH sAcu BENH NHAx'rHAM GIA NcHIflu MA A STT nqcumn HO TEN nnA ruOr GIOI ctrt npxn ruHAu CUU l NGAY vAo vrsN Hodng Thi M 24 NT 1706107s4GP 27/612017 NDOO2 Nguy6n V6n V 59 Nam 170502816GP 09lsl20r7 J NDOO3 Pham Minh D 30 Nam 170600776GP 02t6t2017 NDOO4 Einh Vdn B 50 Nam 17060rs29GP 05t6t20r7 NDOO5 Vfi D6c H 67 Nam I 70606823GP r8l6l20r7 NDOO6 Ta Thdnh L, 2I Nam 170510153GP 29tst20t7 NDt)OT Le Thi T aa JJ Nfr I 70605965GP t5l6l20l7 B NDOOS Nguy6n V[n Q 36 Nanr I 70600987GP a71612017 il'' i 'e \\ o\ Tl NDOlO Nguy6n Xudn D 7T Nam I70408990GP 26t4t20r7 \ t0 NDO11 Bii 75 Nir 1706046sOGP 2316120t7 11 NDOI2 Cao Thi D 55 NT 170609902GP 23t6t20r1 L2 NDOl3 Vfi Van L 6l Nam 170611054GP 27t6/2017 r3 btrD014 L0 XuAn T 72 Nam t70604750GP t3t6t2017 t4 NDOT5 NgO V6n M 49 Nam 17060145sGP 051612017 15 NDO16 'frAn V[n'I' 87 Nam 170611094GP 27 l6 NDOIT tsui Thi L 61 Nf 170611671GP 281612017 I7 NDOl8 Ducrng Chi L 40 Nam 17061 1636GP 281612017 18 NDOl9 I-ucrng Vdn T 86 Nam 1,70610707GP 291612017 l9 NDOzO Nguy6n Van Kh 65 Nam n06r2223GP 30161201l 20 NDO2I Tr'6n NgQc H 54 Narn t70611685GP 301612017 I NDOO Hanh C t6t20r7 fr 2l - Nrro2t - | rui' Van"F[ 62 Nant l 7061 rGP 0l11l20L7 22 ND024 | Hodng XuAn M 41 Nam 170700234GP 0211712017 /aa NDO25 47 Nam 170700916GP 0317l20rl 24 NDo26 Trinh Nggc 58 Nam i70700134GP 0l17l20r7 aa -) -) Nfr 17070t62sGP 041712017 55 Nir t7061l549GP 071712011 170702r82GP 05ll12017 70703934GP 081712017 07 04092GP 0917120t7 -r< PhBrn Vin M H ztl I NDO27 D6ng'I'hi I-an C 26 NDO29 D5 27 NDO3O Nguy6n Ti6n Th 34 Nam 28 NDO3I Duong Thi T 78 NT 29 NDO3? 'Iruong'I'hi Vdn 61 Ntr 17 rhi M D NDO33 Iruong V[n Ch 51 Nam 17070s746GP 121712017 ND03s Nguy6n Van Qu 54 Nam 170706363GP r2l7l20l7 )L NDO36 Nguy6n Thi H 69 Nir I tlol0ozS3cP t2l7l20r7 33 NDO37 Nguy6n Thi Tr 53 Nfr t70707200GP 34 NDO3B Nguy6n Th! Ng, 64 Nir 170707744GP r4l7l20r7 35 ND03S) L0 Ti0n D 58 Nam 170706384GP I4l7l20I7 36 NDO4O Pham Thi Qu l5 NT 170707800GP r417l20l7 aFl JI NDO4I Ddo V[n L 79 Nam 170707805GP r4l7l20r7 38 ND()42 Trdn Dinh T 63 Nam 170708359GP 1517l20r1 I 7070935 I GP r717l20r7 30 i I I r3l7 12017 Nguy6n Ddng 39 NDO44 Kh 50 Nam 40 NDO45 vfr Thi D 59 Nfi 170710052GP t8l7l20r7 41 NDO46 Phuns VAn B 70 Nam 1707 rcAzzGP 18l7l20r7 42 NDO47 Nguy6n'l'hi A 67 NT 170711822GP 201712017 43 NDO5O Ph4m Nggc A 43 Nfr 170710106GP 1817l20r7 44 NDOSl Phpm'fhi 74 NT t70709123GP 1717l20r7 S 4i- ts726cp DArl 45 NIl052 46 NDO53 Nguy6n ThiNh 36 Nfr r70713023Gp 221712011 47 NDO54 Vi Vdn N 49 Nam t7071s l95GP 291712017 48 NDO55 Pharn'fhdnh D 83 Nam 170716901GP 2617120t7 49 NDO56 TrAn Thi X 90 NiI 170716900GP 261712017 50 NDO57 D6 Manh H 57 Nam 170802196GP 231812017 51 NDO58 Phi Nsoc M 27 NT 17080415OGP 041812017 52 NDO59 Nguy6n'l'hi Qu 5l Nir 1707208s2GP 3A17l2Q17 53 NDO6O Dinh'fhi 65 Nir r70806976GP 071812017 54 NDO6l Ng6 Thi FI 40 Nir 170802889GP 031812017 55 NDO62 D0 Hiru Gi 59 Nam 170810191GP 0918120r7 56 NDO63 NguySn Vdn H 61 Nam 70809037GP rv8l20l7 57 NDO64 Hodns Vdn T 79 Nam 170814958GP t3l8l20rl 58 NDO65 Nguy0n Nggc D 21 Nam 170813862GP tzl8l2017 59 NDO66 Trdn Trgng D, 72 Nam 170813105GP tzl8l2017 60 NDO67 Pir4m'l-hi Ng, 63 Nit 17081755gGP ts18l2017 6I ND06t4 CAn Dinh C 64 Nam 17081623()GP t6l8l2017 62 NDO69 'TrAn Khdc L 49 Nam 170814967GP \618120r7 63 NDOTO vfi ThiL 81 Nfl t70820302GP t7l8l20r7 64 NDO71 NguySn Dirc T 63 Nam 170821052GP 18l8l2017 65 NDO72 Phucrns Bao L -a IJ NT 708 3800GP r8l8l2017 66 NDO73 Vbn Dilc M, t8 Nam 170819059GP t7l8l20r7 67 NDO74 Luonq Vdn X 7I Nam 1,70821666GP t9l8l2017 6tl NDO75 Moons Phd B 48 Nam I 70827638GP 241812017 69 NDO76 DO Vdn T .,) J-) Natn 170828941GP 2s1812017 10 NDO77 Du