Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài đề cập về: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPA Nguyễn Khắc Hân Hoan*, Quách Thị Hoàng Oanh*, Phạm Ngọc Khôi**, Nguyễn Thị Phương Mai***, Ngô Diễm Ngọc***, Trần Vân Khánh**** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh DMD BMD bệnh di truyền thần kinh đột biến gen DMD Hơn 65% trường hợp đột biến lập đoạn gen Kỹ thuật MLPA gần cho chẩn đoán đoạn gen hiệu Mục tiêu: Đánh giá hiệu kỹ thuật MLPA phát đột biến đoạn gen DMD Phương pháp: 18 mẫu DNA bệnh nhân nam chẩn đoán lâm sàng bệnh DMD/BMD phát đột biến đoạn gen multiplex PCR Được khảo sát 79 exon gen DMD kit Salsa MLPA P034A2 P035A2, điện di mao quản CEQ 8000 phân tích tự động phần mềm Gene Marker Kết quả: MLPA cho phép xác định xác kích thước đoạn DNA bị đột biến,khảo sát hết 79 exon gen DMD, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh có độ lặp lại cao Mọi exon gen DMD bị khẳng định biểu đồ Bộ multiplex PCR khảo sát 25 exon có exon khơng phát Kết luận: Kỹ thuật MLPA giúp phát nhanh chóng, tồn diện đột biến đoạn gen DMD ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR Từ khóa: Bệnh loạn dưỡng cơ, Duchenne, Becker, bệnh di truyền, đột biến gen, exon, kỹ thuật PCR, kỹ thuật MLPA ABSTRACT MLPA IN DETECTION OF DELETION MUTATIONS CAUSING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY Nguyen Khac Han Hoan, Quach Thi Hoang Oanh, Pham Ngoc Khoi, Nguyen Thi Phuong Mai, Ngo Diem Ngoc, Tran Van Khanh* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - Supplement of No - 2010: 53 - 60 Background: DMD and BMD are genetic disorders caused by DMD mutations More than 65% of cases are deletion or duplication mutation Recently, MLPA is described as an effective method to dectect these mutations Objective: Evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations Method: 15 DNA samples of male affected with DMD/BMD detected with deletion mutations by multiplex PCR are tested for 79 exons with Salsa MLPA P034A2 P035A2 kit, capillary electrophoresed with CEQ 8000 and automated analysis with Gene Marker software Results: MLPA allows to detect the size of DNA fragment lost, the technique is easy, visual, rapid and reproducible All 79 deleted exons are present in electropherograms Set of multiplex PCR only detects 25 exons and some exons cannot be found by this set Conclusion: MLPA helps to rapid detection all deletions of DMD gene and is prominent to multiplex PCR * Khoa Di truyền y học – Bệnh viện Từ Dũ, ** Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nông Lâm TPHCM, *** Khoa Di truyền Tế bào Phân tử – Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học Y Hà nội Tác giả liên lạc: BS Quách Thị Hoàng Oanh, ĐT: 084-913833666, Email: oanhqch@yahoo.com Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Key word: Muscular dystrophy, Duchenne, Becker, genetic disorder, mutation, exon, PCR, MLPA với khả khuếch đại lúc đến 45 vị trí ĐẶT VẤN ĐỀ DNA đích khác phản ứng(18,19) Bệnh loạn dưỡng Duchenne (DMD) Mỗi probe MLPA gồm đoạn oligonucleotide bệnh loạn dưỡng Becker (BMD) bệnh di lai với trình tự DNA đích vị trí liền kề với truyền thần kinh phổ biến nhất, với xuất độ nhau, dài 22-43 nucleotide PCR primer khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7) Bệnh đột xuôi ngược giống tất probe biến gen dystrophin (gen DMD) gây Đây Để phân biệt sản phẩm khuyếch đại, probe gen lớn người nằm dài 2400kb vị trí chứa đoạn DNA gắn chèn khơng tham Xp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1,8,15) gia vào lai có kích thước thay đổi (19–364 nt) Thông tin chi tiết gen phổ biến Sau lai qua đêm với trình tự DNA đích, www.dmd.nl đoạn oligonucleotide probe nối ghép Bệnh nhân DMD thường bị nhược xuất (ligation) với Sản phẩm nối có primer sớm từ – tuổi, tiến triển nhanh, khả xuôi ngược khuếch đại PCR Số lại chết lứa tuổi 20 tổn thương lượng tương đối sản phẩm PCR tỉ lệ tim rối loạn hô hấp Bệnh nhân BMD biểu với số trình tự đích mẫu khảo bệnh nhẹ hơn, tiến triển chậm có sát Kích thước khác sản phẩm sống kéo dài Tuy nhiên chất lượng sống nhận biết hệ thống giải trình mao thường kém(7) quản tự động đỉnh sản phẩm Hơn 65% trường hợp bệnh DMD BMD định lượng(18,19) đột biến đoạn gen lập đoạn gen Kỹ thuật ứng dụng vào chẩn đoán dystrophin gây ra(2,10,17) Các loại đột biến khác đột biến đoạn gây DMD/BMD hiệu gồm có vài nucleotid, đột biến điểm quả(18) Tuy nhiên đến Việt Nam chưa có chuyển đoạn Hầu hết đột biến đoạn nghiên cứu kỹ thuật Vì thế, chúng tập trung chủ yếu hai vùng nóng (hot spot) thực thử nghiệm xác định đột biến đầu 5’ (exon 3-20) vùng trung tâm (exon 44đoạn gen DMD kỹ thuật MLPA so sánh 55)(3,4,7) Tuy nhiên khơng có tương quan hiệu với kỹ thuật multiplex PCR kích thước đoạn gen bị với mức Mục tiêu nghiên cứu độ biểu bệnh Đánh giá hiệu phát đột biến Phát đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa đoạn gen DMD kỹ thuật MLPA so sánh lớn áp dụng vào giai đoạn trước sinh với kỹ thuật multiplex PCR bệnh nhân Trước kỹ thuật thường sử dụng loạn dưỡng Duchenne Becker Bệnh Southern blot Tuy nhiên kỹ thuật đòi hỏi viện Từ Dũ tốn nhiều công thời gian Để thể phát 79 exon phải lai hỗn hợp probe – lần Về sau kỹ thuật multiplex PCR Chamberlain phát triển thành phương tiện chẩn đoán nhanh hơn(2) Kỹ thuật realtime PCR gần phát triển, nhiên nhiều hạn chế(11) Tại Việt Nam, phát đột biến đoạn thường dựa vào kỹ thuật đơn PCR(12,13) kỹ thuật multiplex PCR(14) Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) đời VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm 3ml máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông EDTA Đối tượng 15 bệnh nhân nam chẩn đốn lâm sàng bệnh DMD/BMD Ly trích DNA từ mẫu bệnh phẩm: DNA ly trích từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi phương pháp kết tủa ly tâm qua cột lọc với QiaAmp DNA blood mini kit (Qiagen) DNA sau cô lập hòa tan dung dịch 2Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Tris-HCl 10mM (pH 9,0) Các mẫu DNA xác định nồng độ độ tinh máy Biophotometter plus (Eppendorf) bước sóng 260/280nm lưu trữ 4oC trước chẩn đoán -300C sau phân tích Kỹ thuật multiplex PCR phát đột biến đoạn Kỹ thuật multiplex PCR thực Bệnh viện Nhi Trung Ương Ba multiplex PCR A, B C sử dụng để phát đoạn 25 exon đặc hiệu tập trung vùng hot spot gen với trình tự mồi, điều kiện phản ứng kích thước sản phẩm khuếch đại thiết kế theo Chamberlain cộng (bảng 1)(2) Sản phẩm PCR điện di gel Nussieve agarose 3% dung dịch đệm TBE 1x máy điện di Mupid Exu với điện 120V 30’, nhuộm với dung dịch ethidium bromide 0,5ug/ml 20’ chụp hình tia UV với máy Gel Doc XR (BioRad) (hình 1) Các phản ứng PCR ln kèm theo đối chứng dương tính, âm tính (wild type) song song với mẫu cần chẩn đốn Bảng 1: Kích thước (bp) 25 exon khuếch đại multiplex PCR (2)) Multiplex A Multiplex B Mutiplex C Exon Kích thước Exon Kích thước Exon Kích thước 45 547 Pm 535 49 439 48 506 410 Pb 332 19 459 43 357 16 290 17 416 50 271 41 270 51 388 13 238 32 253 360 202 42 195 12 331 47 181 34 171 44 268 60 139 196 52 113 Hình 1: Kết phát đột biến đoạn multiplex A, B C với thang 100bp Wt m chứng wildtype người nam bị đột biến 29 mẫu 08029 bị exon: 3,4,6,8,12,13 30 mẫu 08030 bị exon: 47, 48, 49, 50, 51, 52 31 mẫu 08031 bị exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 Kỹ thuật MLPA Chúng sử dụng kit Salsa MLPA MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất có chứa 80 đoạn dò cho 79 exon đích exon DP427c (5,6) 80 probe đưa chia vào hỗn hợp probe P034A2 P035A2 Ngoài ra, kit chứa đoạn dò kiểm chứng (bảng 2) Kỹ thuật MLPA thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 50 – 200ng DNA mẫu khảo sát pha loãng 5ul TE biến tính 98°C x 5’, làm lạnh đá trộn với 3ul hỗn hợp probe MLPA buffer Hỗn hợp DNA probe sau ủ lai 95°C x 1’ 60°C x 16 qua đêm Phản ứng nối ghép sau lai thực với 32ul hỗn hợp Ligase-65 buffer 54°C x 15’ bất hoạt 98°C x 5’ Bảng 2: Kích thước đoạn dò (bp) đặc hiệu exon kit Salsa MLPA P034 P035 Kích thước DMD exon đoạn dò 482* Exon DP427c 138* Exon 170* Exon 210 Exon 242 Exon 282 Exon 314 Exon 354 Exon 386 Exon Trình tự 20 nucleotid Kích thước DMD exon quanh vị trí ligation đoạn dò CAGTAATAGA-ATGCTTTCAG 218 Exon 43 CCCCCTACAG-GACTCAGATC 250 Exon 44 CAAAAGAAAA-CATTCACAAA 290 Exon 45 CTCTTCAGTG-ACCTACAGGA 322 Exon 46 CCCTGAACAA-TGTCAACAAG 362 Exon 47 AGATGGAAAT-CATAAACTGA 394 Exon 48 CCAACAGTGA-AAAGATTCTC 434 Exon 49 GGAATAGTGT-GGTTTGCCAG 466 Exon 50 146 Exon 51 TTGAAGCCAT-CCAGGAAGTG Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation ATTGCAAAGT-GCAACGCCTG ACAGTTTCTC-AGAAAGACAC AGATGCCAGT-ATTCTACAGG CATTGCTAGT-ATCCCACTTG TCAAACAATT-AAATGAAACT GTTAAATCAT-CTGCTGCTGT AAGAGATTTT-GTCTAAAGGG TAAACCGTTT-ACTTCAAGAG TCTGGCAGAT-TTCAACCGGG Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Kích thước DMD exon đoạn dò 426 Exon 458 Exon 10 138 Exon 11 170 Exon 12 210 Exon 13 242 Exon 14 282 Exon 15 314 Exon 16 354 Exon 17 386 Exon 18 426 Exon 19 458 Exon 20 154 Exon 21 186 Exon 22 226 Exon 23 258 Exon 24 298 Exon 25 330 Exon 26 370 Exon 27 402 Exon 28 442 Exon 29 474 Exon 30 154 Exon 31 186 Exon 32 226 Exon 33 258 Exon 34 298 Exon 35 330 Exon 36 370* Exon 37 402 Exon 38 442 474 146 178 Exon 39 Exon 40 Exon 41 Exon 42 Nghiên cứu Y học Trình tự 20 nucleotid Kích thước DMD exon Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation đoạn dò quanh vị trí ligation 178* Exon 52 AGCCTCTTGA-TTGCTGGTCT ACAGGGATAT-GAGAGAACTT 218 Exon 53 GAGCAGGTCT-TAGGACAGGC AGACAAGTCA-TTTGGCAGTT TTGACAGCCC-ATCAGGGCCG 250 Exon 54 GCAGACAAAT-GTAGATGTGG AGCCTCTTGG-ACCTGATCTT 290 Exon 55 ACTCATAGAT-TACTGCAACA GGTAGTTGAT-GAATCTAGTG 322 Exon 56 TCCTGTTACA-AAGACGTTTG GGGCAAACAT-CTGTAGATGG 362 Exon 57 GAAAGATGAT-GAATTAAGCC TGGCTTTCAG-AAAAAGAAGA 394 Exon 58 AGACTGTACG-AATATTTCTG GCAATCCATG-GGCAAACTGT 434 Exon 59 GATGAGACCC-TTGAAAGACT AACAGATCCT-GGTAAAGCAT 466 Exon 60 GCCTCTGAAA-GAGAACGTGA AAGCTGTGTT-GCAGAGTCCT 162 Exon 61 GCAGCTGCAT-GAAGCCCAC AAGCTGAGAA-GTTCAGAAAA 194 Exon 62 TCCCTGGGAG-AGAGCCATCT GTGGATCGAA-TTCTGCCAGT 234* Exon 63 AAACAACTTG-CTGGGACCAT AAGGACAAGG-ACCCATGTTC 266* Exon 64 CTGCAGTCTT-CGGAGTTTCA AGGAGACCAT-GAGTGCCATC 306 Exon 65 GCTGCATGTG-ATGCCTTGGA GGCCTATACT-ATCTCAGCAC 338 Exon 66 CTGTCTTTTA-AAACTGGCAT GGCCTGCCCT-TGGGGATTCA 378* Exon 67 ACACTTGGCT-CAATGTTACT CAGAAGATAA-AGAATGAAGC 410 Exon 68 GACTGGATGA-GACTGGAACC GTAAGCCTCC-AGAAAGATCT 450 Exon 69 TTTTTTTCTG-GTCGAGTTGC TGAGTCTGTA-AATAGTGTCA 482 Exon 70 CCCCGAATGG-GCTACCTGCC 162* Exon 71 TCTGATCAAC-TTCTGGCCAG GGCATGAGTT-ATTGTCATAC 194 Exon 72 CCTCAGCTTT-CACACGATGA ACAGACCCTA-ACAGATGGCG 234* Exon 73 TATCATTTAG-ATAAGATCCA AAGTTGCTTG-AACAGAGCAT GGAGGCTGCC-CAAAGAGTCC 266 Exon 74 CCAGATCTTG-ATTTCCTTAG CTGCATTGGA-AACAAAGAGT 306 Exon 75 TGAGCTCATT-GCTGAGGCCA TCTGAAGTGG-AAATGGTGAT 338 Exon 76 ACCTCTCTAC-AGAGGTCCGA GAAAGGAAAT-GAATGTCTTG 378 Exon 77 CCAGGACACA-AGCACAGGGT CCTGAAGAGT-ATCACAGAGG 410* Exon 78 TGGAAAGCCA-ATGAGAGAGG ATCACAAAGT-GGATCATTCA 450 Exon 79 CCACATGGCA-GATGATTTGG TGGCTGCAAA-TCGATGGTTG 64-70-76-82 Chứng ñịnh lượng DNA, xuất DNA < 100 ng CTGAAATTCA-GCAGGGGGTG 88-92-96 Chứng DNA, tín hiệu thấp biến tính khơng hồn tồn TGCAAAGAGG-AGACAACTTA 100 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể X AAGGCTCTAG-AAATTTCTCA 105 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể Y GGGCTTGTCT-GAGGATGGG 118 Chứng đặc hiệu nhiễm sắc thể Y, có P034 CGATGATGGT-GATGACTGAA * probe đặc hiệu trình tự chuỗi DNA ngược có phần trình tự intron Chữ đứng kit P034, chữ in nghiêng kit P035 Cả kit có đoạn dò chứng 10µl sản phẩm nối ghép trộn kỹ với 30µl PCR buffer đặt vào máy luân nhiệt 60°C Liền sau 10ul hỗn hợp phản ứng có chứa dNTPs, Taq polymerase primer (primer xuôi: 5’-Cy5GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’, primer ngược: 5’-GTGCCAGCAAGATCCAATC TAGA-3’) thêm vào PCR thực điều kiện luân nhiệt: (950C x 30” + 600C x 30” + 720C x 60”) x 35 chu kỳ + 720C x 20’ giữ 40C máy Master Cycler ProS (Eppendorf) Các đoạn dò khơng ghép nối với mang primer không khuếch đại Sản phẩm sau khuếch đại điện di phân tách đoạn hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) điều kiện: 2ul PCR + 0,5ul Beckman size standard 600 + 32ul sample loading solution; nhiệt độ mao quản 500C, biến tính 900C x 20’’; điện bơm mẫu vào 2kV x 30’’ điện phân tách đoạn 4,8kV x 60’ Kích thước 4Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 peak xác định nhờ so sánh với thang kích thước so sánh với mẫu chứng Sau điện di, kết xuất dạng file.esd, phân tích tự động tìm đột biến phần mềm Gene Marker version 1.85 (SoftGenetics) Kết phân tích biểu thị dạng biểu đồ sóng (electropherogram) dạng bảng Các vị trí gen bị đoạn cá thể nam (1 nhiễm sắc thể X) khơng có đỉnh tín hiệu xuất Hình minh họa kết chẩn đoán mẫu 08029 Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Từ ngày 1/3/2009 đến 31/5/2009 thực chẩn đoán cho 15 mẫu tất phát đoạn hai kỹ thuật Số exon phát bị mẫu đa dạng Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR, có mẫu khơng phát đoạn, mẫu nhiều 25 exon Các band đặc hiệu cho exon khảo sát rõ Với kỹ thuật MLPA, số lượng exon bị đột biến đoạn thay đổi, exon, nhiều toàn 79 exon gen DMD Kết phát đột biến nêu bảng Bảng 3: Số exon phát bị 15 mẫu khảo sát Mã số MLPA Multiplex PCR 08024 08026 08029 08030 08031 – 12 3–7 – 13 46 – 52 – 34 Exon phát ñược 8, 12 3, 4, 3, 4, 6, 8, 12, 13 47, 48, 49, 50, 51, 52 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 07025 06058 05020 05060 3–7 48 – 50 45 – 52 – 29 3, 4, 48, 49, 50 45, 47, 48, 49, 50, 51,52 32, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19 07009 07047 10013 10016 10017 10021 31 – 40 – 17 45-53 52 61-67 1-79 32, 34, 41, 42, 43 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17 45, 47, 48, 49, 50,52 52 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34,41,42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51,52, 60 Exon không khảo sát 9, 10, 11 5, 2, 5, 7, 9, 10, 11, 46, 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 21, 33 5, 46 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15 46, 51, 53 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 Các exon lại Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Hình 3: Kết phân tích phần mềm GeneMarker mẫu 08029 Hình kit P034, hình kit P035 Bệnh nhân bị đoạn từ exon đến exon 13 đoạn gen lớn, vượt ngồi vùng nóng BÀN LUẬN đầu 5’; mẫu đoạn không nằm trước vùng Cả hai phương pháp có khả phát nóng trung tâm Kết phù hợp với y văn cho xác exon bị đoạn gen gen DMD gen dài dễ bị đứt gẫy DMD phù hợp với chẩn đoán bệnh cảnh trình phân chia tế bào(1,11,16) lâm sàng Trong 15 mẫu khảo sát, có mẫu bị 6Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Kỹ thuật multiplex PCR biểu thị exon bị đoạn vắng mặt band tương ứng gel agarose Người đọc so band mẫu khảo sát với band chứng wild type để xác định diện đột biến Tuy nhiên multiplex PCR phương pháp định tính Trường hợp cá thể nữ (46,XX) mang gen DMD bị đoạn số exon khảo sát kỹ thuật khơng phát Do giới hạn kỹ thuật multiplex, nên multiplex PCR khảo sát 25 exon Số exon khảo sát khơng liên tục, khơng thể kết luận có diện hay khơng exon nằm exon phát 10 15 mẫu khảo sát có exon bị ngồi khả phát multiplex PCR Multiplex PCR kỹ thuật sử dụng rộng rãi Tuy nhiên kỹ thuật có nhược điểm khó tối ưu cho nhiều cặp primer primer có điều kiện phản ứng khác Một thay đổi nhỏ điều kiện làm cho phản ứng bị thất bại MLPA cho phép phát bất thường liều gen giới hạn rộng Kỹ thuật dựa nguyên tắc định lượng so sánh probe khuếch đại PCR với cặp primer Vì MLPA loại bỏ giới hạn tối ưu multiplex PCR kiểm tra liều gen nhiều vị trí đích khác cách dễ dàng Với kit Salsa MLPA P034A2 P035A2, toàn exon gen DMD khảo sát lần thử nghiệm, ống phản ứng khác với điều kiện luân nhiệt Kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh có độ lập lại cao Mọi exon gen DMD bị khẳng định biểu đồ Thời gian thao tác thực kỹ thuật ngắn Tuy nhiên, kỹ thuật đòi hỏi phải lai đoạn dò 16 qua đêm Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu nêu trước đây(10,11,18,19) Nghiên cứu Y học MLPA cho phép xác định xác kích thước đoạn DNA bị đột biến Điều hữu ích xác định biến đổi khung dịch mã để suy đoán liên quan kiểu gen – kiểu hình Các đột biến gây lệch khung dịch mã thường dẫn đến bệnh DMD Nếu khung dịch mã khơng thay đổi bệnh nhân thường có kiểu hình bệnh BMD nhẹ Tuy nhiên MLPA cho kết dương tính giả có probe bị thay đổi tín hiệu Điều xảy vị trí lai nối ghép probe, DNA đích bị đột biến điểm bị SNP Đây nhược điểm MLPA Vì cần làm PCR để xác định lại kết MLPA cho thấy có probe bị thay đổi tín hiệu Ngồi ra, kỹ thuật MLPA có đoạn dò đặc hiệu nhiễm sắc thể X Y Đây ưu điểm lớn giúp xác định giới tính mẫu khảo sát hữu ích cho việc tiên lượng kiểu hình bệnh nhân thai sau sinh(19,20) Ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh trường hợp đoạn gen cho thai dễ dàng giúp giúp cho việc phòng bệnh chủ động tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh tương lai giảm gánh nặng cho xã hội KẾT LUẬN Bệnh loạn dưỡng Duchene Becker rối loạn thần kinh đơn gen phổ biến nam giới Kỹ thuật MLPA giúp phát nhanh chóng, tồn diện đột biến đoạn gen DMD ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR Ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh hứa hẹn đạt hiệu cao Cám ơn: Các đồng nghiệp Khoa Di truyền y học Bệnh viện Từ Dũ Bệnh viện Nhi trung ương ủng hộ giúp đỡ thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Beggs AH, Koenig M, Bobrow M, Bentley DR (1990) Detection of 98% of DMD/BMD gene deletion by polymerase chain reaction Human Genetics, 86: 45–48 Chamberlain JS, Gibbs RA, Raniel JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dytrophy locus via multiplex DNA amplification Nucleic Acids Research, 16: 11141–11156 Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Elhawary NA, Rabah MS, Nemat H (2004) Frameshift deletion mechanisms in Egyptian Duchenne and Becker muscular dystrophy families Molecular and Cells, 18: 141– 149 Forrest SM, Smith TJ, Cross GS et al (1987) Effective strantergy for prenatal prediction of Duchenne and Becker muscular dystrophy Lancet, 2: 1294–1296 Gatta V et al (2005) Identification of deletions and duplications of the DMD gene in affected males and carrier females by multiple ligation probe amplification (MLPA) Hum Genet Jun;117(1):92-98 Janssen B et al (2005) MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls Neurogenetics.; 6(1):29-35 Kneppers ALJ, Ginjaar IB, Bakker E (2004) Duchenne and Becker muscular dystrophy In: Rob Elles & Roger Mountford (eds) Molecular diagnosis of genetic diseases, 2nd edition, pp311-342 Humana Press, New Jersey Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C, Kunkel LM (1987) Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophiy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals Cell 50: 509–517 Kunkel, L M et al (1991) Searching for dystrophin gene deletion in patients with atypical presentations In: Lindsten J, Pettersson U (eds) Etiology of human disease at the DNA level, pp 51–60 Ravel, New York Lalic T et al (2005) Deletion & duplication screening in the DMD gene using MLPA Eur J Hum Genet.13(11):1231-4 Lai KK et al (2006) Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Clin Biochem 2006 Jan 11 Nguyễn Thị Hồn, Nguyễn Thanh Liêm, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Thu Nhạn, Bùi Phương Thảo (2006) Đột biến đoạn gene Dystrophin bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne/ Becker Việt Nam Tạp chí Nhi khoa, tập 14 - số đặc biệt: 202–208 Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng (2002) Kết bước đầu phát đột biến gien gây bệnh loạn dưỡng Duchenne Tạp chí Nhi khoa, tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm trường Đại học Y Hà Nội hội nghị khoa học tồn quốc Nguyễn Thị Phương Mai, Vũ Chí Dũng, Hoàng Thị Thanh Mộc cs (2007) Áp dụng kỹ thuật multiplex PCR thay PCR cổ điển phân tích gen dystrophin bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne Hội nghị nhi khoa Việt Úc, Bệnh viện Nhi Đồng TPHCM, 111-111 Prior TW, Bridgeman SJ (2005) Experience and Strategy for the Molecular testing of Duchenne Muscular Dytrophy Journal of Molecular Diagnostics, 7:317-326 Roberts RG, Bobrow M, Bentley DR (1992) Point mutations in the dystrophin gene Proceding National Academy of Science of USA 89: 2331–2335 Roberts RG, Coffey AJ, Bobrow M, Bentley DR (1993) Exon structure of the human dystrophin gene Genomics, 51: 919– 928 Schwartz M and Duno M (2005) Multiplex ligationdependent probe amplification is superior for detecting deletions/duplications in Duchenne muscular dystrophy Clin Genet.; 67(2):189-91 19 20 Nghiên cứu Y học Schwartz M and Duno M (2004) Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligation-dependent probe amplification method Genet Test.; 8(4):361-7 White SJ et al (2006) Copy number variation in the genome; the human DMD gene as an example Cytogenetic and Genome Research, 115: 240-6 Review 8Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 10 Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV Nhi Đồng – Lần XIX - Năm 2010 Nghiên cứu Y học ... biểu bệnh Đánh giá hiệu phát đột biến Phát đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa đoạn gen DMD kỹ thuật MLPA so sánh lớn áp dụng vào giai đoạn trước sinh với kỹ thuật multiplex PCR bệnh nhân Trước kỹ thuật. .. hợp bệnh DMD BMD định lượng(18,19) đột biến đoạn gen lập đoạn gen Kỹ thuật ứng dụng vào chẩn đoán dystrophin gây ra(2,10,17) Các loại đột biến khác đột biến đoạn gây DMD/BMD hiệu gồm có vài nucleotid,... KẾT LUẬN Bệnh loạn dưỡng Duchene Becker rối loạn thần kinh đơn gen phổ biến nam giới Kỹ thuật MLPA giúp phát nhanh chóng, tồn diện đột biến đoạn gen DMD ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex