Bài viết trình bày việc chẩn đoán xác định người mang đột biến dị hợp tử - SEA có ý nghĩa lớn với việc chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai bị Hb Bart’s có vai trò quan trọng cho tư vấn di truyền.
NGHIÊN CỨU PHỤ SẢN/DI TRUYỀN Phát đột biến đoạn hai gen Alpha Globin ( SEA) gây bệnh Αlpha Thalassemia kỹ thuật PCR Đào Thị Trang1, Hoàng Thị Ngọc Lan1,2, Nguyễn Thị Hảo1, Bùi Thị Lành1, Hoàng Thị Hải1, Đoàn Thị Kim Phượng1,3 Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Phụ sản Trung ương Bệnh viện Đại học Y Hà Nội doi:10.46755/vjog.2020.1.790 Tác giả liên hệ (Corresponding author): Đào Thị Trang, email: daotrang.dt39@gmail.com Nhận (received) 05/12/2019 - Chấp nhận đăng (accepted) 20/04/2020 Tóm tắt Đặt vấn đề: Chẩn đoán xác định người mang đột biến dị hợp tử SEA có ý nghĩa lớn với việc chẩn đoán trước sinh Chẩn đoán sớm thai bị Hb Bart’s có vai trị quan trọng cho tư vấn di truyền Mục tiêu: Đánh giá hiệu việc phát đột biến SEA phương pháp PCR Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 66 mẫu DNA tách chiết từ 31 mẫu máu 35 mẫu ối tươi/ối nuôi cấy làm xét nghiệm đột biến gen α globin phương pháp lai phân tử ngược Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Các mẫu DNA PCR mồi thiết kế, sau điện di để xác định đột biến SEA So sánh kết hai phương pháp Kết quả: Đoạn mồi thiết kế khuếch đại thành công đoạn gen mang đột biến SEA 66/66 mẫu máu mẫu ối có kết 100% tương đồng hai phương pháp Kết luận: PCR phương pháp xác, đơn giản, nhanh chóng kinh tế chẩn đốn người mang gen chẩn đoán thai thi mang đột biến SEA Từ khóa: α-thalassemia, đột biến SEA, PCR, kỹ thuật lai phân tử ngược Detection of the ( SEA) double αlpha-globin gene deletion by simple PCR method Dao Thi Trang1, Hoang Thi Ngoc Lan1,2, Nguyen Thi Hao1, Bui Thi Lanh1, Hoang Thi Hai1, Doan Thi Kim Phuong1,3 Ha Noi Medical University National Hospital of Obstetrics and Gynecology Hanoi Medical University Hospital Abstract Background: Detecting the carriers of SEA double deletion, as well as fetuses with Hb Bart’s syndrome is essential to prenatal diagnosis. Objectives: Evaluating accuracy and the cost-effectiveness of a simple PCR method in determining SEA mutation. Materials and methods: 66 DNA extraction products of 31 blood and 35 amniotic fluid samples were tested for SEA mutation by hybridization technique in Genetic Counseling Centre, Hanoi Medical University Hospital These samples were diagnosed SEA mutation by the combined gap-PCR method (with the designed primers) and agarose gel electrophoresis The results of this PCR assay were compared with that of the reserved hybridization method Results: These designed primers have made successful PCR to detect SEA deletion The results of the PCR assay were completely in concordance with that of the reserved hybridization method. Conclusion: Application of PCR assay on detecting SEA double alpha globin gene deletion is exact, simple, rapid (towards both blood and prenatal samples) and cost-effective in Vietnam Keywords: α-thalassemia, SEA mutation, PCR method, reserved hybridization technique Đào Thị Trang cs Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31 doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Αlpha thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đột biến gen α-globin, gây thiếu máu tan máu mạn tính phù thai, thai chết lưu [1] Xác định người mang đột biến SEA có vai trị quan trọng tư vấn chẩn đoán trước sinh Chẩn đoán sớm thai nhi mắc hội chứng Hb Bart’s có ý nghĩa việc tiên lượng cho thai nhi, hạn chế biến chứng nguy hiểm cho thai phụ cung cấp thông tin di truyền hữu ích cho gia đình Hiện nay, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, phương pháp phát đột biến SEA chủ yếu dựa vào kit thương mại với nguyên lý lai phân tử ngược Phương pháp phát nhiều đột biến lúc kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian giá thành cao Trong đó, nhiều nghiên cứu Việt Nam cho thấy đột biến đoạn lớn dạng SEA người có nguy cao mang gen α-thalassemia lên đến 87,35 - 95% [2,3] Do đó, nhiều trường hợp cần xác định đột biến SEA đủ ý nghĩa lâm sàng Trên giới nước có nhiều bệnh viện, trung tâm sử dụng phương pháp PCR để phát đột biến SEA Tuy nhiên, phần lớn tác giả sử dụng cặp mồi giống để khuếch đại đoạn gen α globin bình thường đột biến SEA với kích thước sản phẩm lớn, 1800 bp 1349 bp, dẫn tới khó thực kéo dài phản ứng khuếch đại [4] Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, thực nghiên cứu nhằm mục tiêu: Phát triển kỹ thuật PCR với đoạn mồi tự thiết kế, nhằm rút ngắn thời gian đơn giản hóa kỹ thuật xét nghiệm tăng hiệu mặt chi phí Đánh giá tính xác xét nghiệm PCR việc phát người bệnh thai nhi có đột biến SEA việc so sánh kết với phương pháp lai phân tử ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: 66 mẫu DNA tách chiết từ 31 mẫu máu ngoại vi 35 mẫu tế bào ối tươi/ối nuôi cấy người thai nhi có định xét nghiệm đột biến gen α-thalassemia Bệnh viện Đại học Y Hà Nội từ tháng 4/2019 đến 10/2019 Nghiên cứu có sử dụng DNA người bình thường mẫu tế bào ối thai khơng có nguy mang đột biến SEA để làm mẫu đối chứng Phương pháp nghiên cứu: Mỗi mẫu DNA (tách chiết kít hãng Qiagen, Đức) xác định đột biến gen phương pháp: lai phân tử ngược PCR đột biến SEA So sánh kết phát đột biến phương pháp Thiết kế mồi: Các cặp mồi cho phản ứng PCR thiết kế để khuếch đại đoạn gen α-globin bình thường trình tự gen liền kề với đột biến SEA Sử dụng chương trình Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) để thiết kế mồi Trình tự mồi trình bày Bảng Bảng Trình tự mồi, nồng độ mồi kích thước sản phẩm sau PCR Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) α/SEA(F) CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC α(R) TGAAGAGCCTGCAGGACCAGGTCAGT α/SEA(F) CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC SEA(R) ATATATGGGTCTGGAAGTGTATCCCTC Phản ứng PCR: Mỗi phản ứng 20 µl bao gồm: µl PCR Master mix 2X (0,8 U/µl, ThermoFisher Scientific), 0,5 µl loại primer, 10 - 100 ng DNA (thể tích cho vào tùy thuộc nồng độ mẫu, khơng q 20% thể tích phản ứng PCR), DMSO 0,5% 0,5 µl, Betaine 0,5M 2,5 µl, nước cất vừa đủ 20 µl Chu trình nhiệt: 980C x 10s; 30 chu kỳ: 980C x 1s; 660C x 5s; 28 Kích thước sản phẩm (bp) 1019 669 720C x 23s; 720C x 60s Tổng thời gian PCR khoảng 31 phút Sau PCR, điện di sản phẩm thạch agarose 1,5%, 35 phút Kỹ thuật lai phân tử ngược: Sử dụng kít Thalassemia Gene Diagnostic (Hybribio)/Thalassemia α-Globin StripAssay (ViennaLab) có chứng CE/IVD Đào Thị Trang cs Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31 doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A B Hình Hình ảnh điện di phát đột biến SEA kỹ thuật PCR hình ảnh kết lai phân tử Hình 1.A Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi thiết kế Chú thích: L: Thang chuẩn; 1: mẫu chứng không đột biến SEA, 2: mẫu chứng đồng hợp tử đột biến SEA, 3: mẫu chứng dị hợp tử đột biến SEA (mẫu máu), (mẫu tế bào ối tươi): đồng hợp tử đột biến SEA; (mẫu tế bào ối tươi): dị hợp tử SEA; (mẫu tế bào ối tươi): khơng đột biến SEA Hình 1.B Hình ảnh kết lai tương ứng kết PCR > 6; Màng lai 1: Không phát đột SEA đột biến gen thalassemia khác khảo sát Màng lai 2: Đồng hợp tử đột biến SEA Màng lai 3: Dị hợp tử đột biến SEA Thanh lai 4: Đồng hợp tử đột biến SEA Thanh lai 5: Dị hợp tử đột biến SEA Thanh lai 6: Không phát đột SEA đột biến gen α-thalassemia khác khảo sát Bảng So sánh kết phát đột biến SEA mẫu máu, mẫu ối tươi mẫu ối nuôi cấy Loại mẫu Mẫu máu Mẫu ối tươi/ối nuôi cấy Tỷ lệ phù hợp kết Phương pháp Kết Lai phân tử n (%) PCR n (%) Lai phân tử n (%) PCR n (%) Không đột biến 13 (41,9%) 13 (41,9%) 15 (42,9%) 15 (42,9%) 100% Dị hợp tử 17 (54,8%) 17 (54,8%) 14 (40%) 14 (40%) 100% (3,2%) (máu cuống rốn) (3,2%) (17,1%) (17,1%) 100% Đồng hợp tử Trong 31 mẫu máu 35 mẫu ối, tỷ lệ phát đột biến SEA cho kết hoàn toàn trùng khớp với phương pháp lai phân tử ngược Đào Thị Trang cs Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31 doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 29 Bảng So sánh kết phát đột biến SEA 16 mẫu ối tươi Phương pháp Lai phân tử (ối nuôi cấy) n (%) PCR (ối tươi) n (%) PCR (ối nuôi cấy) n (%) Tỷ lệ phù hợp kết Không đột biến (37,5%) (37,5%) (37,5%) 100% Dị hợp tử (37,5%) (37,5%) (37,5%) 100% (25%) (25%) (25%) 100% Kết Đồng hợp tử Trong 35 mẫu ối nghiên cứu, có 16 mẫu thực kỹ thuật PCR phát đột biến SEA hai loại mẫu (của bệnh nhân) tế bào ối tươi tế bào ối qua nuôi cấy Kết phát đột biến SEA PCR 16 mẫu ối tươi, cho kết phù hợp với ối nuôi cấy hai phương pháp, lai phân tử ngược PCR Bảng Độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp PCR với đột biến SEA PCR Lai Có đột biến (n,%) Không đột biến (n,%) Tổng số 38 (57,6) (0%) 38 (0,0) 28 (42,4%) 28 38 (57,6) 28 (42,4%) 66 Có đột biến Khơng đột biến Tổng số Độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp PCR xét nghiệm xác định đột biến SEA 100% so với phương lai phân tử ngược BÀN LUẬN Mồi thiết kế khuếch đại đoạn gen mang đột biến SEA đoạn gen α-globin bình thường Các cặp mồi thiết kế lại giúp giảm nhiệt độ nóng chảy mồi (Tm), tăng khả gắn mồi xác; với việc sử dụng master mix phù hợp, thời gian khuếch đại chuỗi so với phương pháp PCR, gap-PCR multiplex PCR trước đây, giảm từ 2,5 [6,7] xuống khoảng 30 phút Phương pháp PCR nghiên cứu cho thấy tính xác với độ nhạy độ đặc hiệu 100% so với kỹ thuật lai phân tử ngược (đã có chứng nhận CE/IVD) Theo nghiên cứu Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2018 cho thấy tỷ lệ gặp đột biến dị hợp tử SEA người có sàng lọc mang gen α-thalassemia lên đến 95% sử dụng phương pháp lai phân tử ngược 91,5% trường hợp đột biến dị hợp tử SEA nằm nhóm cơng thức máu có MCV MCH giảm nhiều (MCV ≤ 75 fl MCH ≤ 24 pg) [5] Như vậy, với trường hợp bệnh nhân có MCV, MCH giảm nhiều HbA2 < 3,5% (khơng có Hb bất thường khác), việc thực phương pháp PCR cho thấy hiệu mặt chi phí, kỹ thuật thời gian xét nghiệm (so sánh chi tiết nêu Bảng 5) Trong trường hợp phương pháp PCR không phát đột biến SEA nghi ngờ dị hợp tử kép, thực phương pháp chẩn đoán phát đa đột biến sau Bảng So sánh phương pháp lai phương pháp PCR Phương pháp Phương pháp PCR Tiêu chí Trên Trên màng Thời gian - 4,5 - 70 phút 5.000.000 đồng 3.500.000 đồng Khoảng 500.000 đồng Số đột biến phát 21 đột biến α-thalassemia đột biến α 16 đột biến β đột biến SEA Nồng độ DNA yêu cầu - 20 ng/µl ~ > 50 ng/µl ≥ 2,5 ng/µl Mẫu thực Máu, tế bào ối nuôi cấy Máu, tế bào ối nuôi cấy Máu, tế bào ối nuôi cấy, tế bào ối tươi Trang thiết bị yêu cầu Máy PCR, buồng điện di, bể ổn nhiệt, máy ủ lắc Máy PCR, bể ổn nhiệt, máy lai hãng Hybribio Máy PCR, buồng điện di Chi phí 30 Phương pháp lai Đào Thị Trang cs Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31 doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 Trong trường hợp chẩn đoán trước sinh, kỹ thuật PCR thực mẫu ối tươi ối nuôi cấy cho thấy kết hoàn toàn phù hợp với phương pháp lai phân tử ngược mẫu ối nuôi cấy Một số nghiên cứu cho thấy giá trị phương pháp PCR chẩn đoán trước sinh hội chứng Hb Bart’s [7,8] Nghiên cứu bước đầu cho thấy ưu điểm việc sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đốn trước sinh đối tượng có nguy sinh bị Hb Bart’s, đặc biệt thực mẫu ối tươi không cần nuôi cấy tế bào (nồng độ thấp làm nghiên cứu 2,5 ng/ µl) Phát đột biến SEA từ mẫu ối không cần nuôi cấy phương pháp PCR cho kết sớm vòng 24 sau nhận mẫu, ưu điểm thiết yếu chẩn đoán di truyền trước sinh Jomoui, W., et al Genetic origin of α(0)-thalassemia (SEA deletion) in Southeast Asian populations and application to accurate prenatal diagnosis of Hb Bart’s hydrops fetalis syndrome Journal of Human Genetics 2017; 62(8): 747-754 Karnpean, R., et al Accurate Prenatal Diagnosis of Hb Bart’s Hydrops Fetalis in Daily Practice with a Double-Check PCR System Acta Haematol 2009; 121(4): 227-33 KẾT LUẬN Thiết kế mồi khuếch đại thành công đột biến đoạn SEA Phương pháp PCR phát đột biến SEA cho kết xác, nhanh chóng, kỹ thuật đơn giản, hiệu chi phí, có độ nhạy, độ đặc hiệu 100% so với phương pháp lai phân tử ngược Kỹ thuật cho thấy tiềm phát đột biến mẫu tế bào ối không cần thời gian ni cấy chẩn đốn trước sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Weatherall, D.J Thalassemia as a global health problem: recent progress toward its control in the developing countries Ann N Y Acad Sci 2010; 1202: 17-23 Bui Thi Kim L., D Phu Chi, C Hoang Thanh Spectrum of Common alpha-Globin Deletion Mutations in the Southern Region of Vietnam Hemoglobin 2016; 40(3): 206-7 Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Hương Ly, Lê Phương Thảo, Trần Danh Cường Đặc điểm đột biến gen globin đối tượng nguy cao sinh mắc thalassemia Trung tâm chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2018 Tạp chí Phụ sản 2019; 16(3): 22-27 Chong, S.S., et al Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of α-thalassemia Blood 2000; 95(1): 360-362 Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vân Anh, Lê Phương Thảo, Đoàn Thị Kim Phượng, Phan Thu Giang Giá trị MCV, MCH sàng lọc bệnh alpha-thalassemia thai phụ Trung tâm chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương Tạp chí Phụ sản 2019; 16(3): 28-34 Liu, Y.T., et al Rapid detection of alpha-thalassaemia deletions and alpha-globin gene triplication by multiplex polymerase chain reactions Br J Haematol 2000; 108(2): 295-9 Đào Thị Trang cs Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31 doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 31 ... kết PCR > 6; Màng lai 1: Không phát đột SEA đột biến gen thalassemia khác khảo sát Màng lai 2: Đồng hợp tử đột biến SEA Màng lai 3: Dị hợp tử đột biến SEA Thanh lai 4: Đồng hợp tử đột biến. .. mẫu thực kỹ thuật PCR phát đột biến SEA hai loại mẫu (của bệnh nhân) tế bào ối tươi tế bào ối qua nuôi cấy Kết phát đột biến SEA PCR 16 mẫu ối tươi, cho kết phù hợp với ối nuôi cấy hai phương...1 ĐẶT VẤN ĐỀ Αlpha thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đột biến gen α -globin, gây thiếu máu tan máu mạn tính phù thai, thai chết lưu [1] Xác định người mang đột biến SEA có vai